في فيفو فوتولابيلينج الخلايا في القولون لتقييم إمكانية الهجرة من الخلايا المكونة للدم في الفئران حديثي الولادة

Summary

البروتوكول هو موضح هنا تستخدم نهجاً فوتولابيلينج في الفئران حديثي الولادة على وجه الخصوص تحديد الخلايا المناعية التي يهاجر من القولون إلى مواقع خارج المعوية. سوف تكون هذه الاستراتيجية مفيدة لدراسة التفاعلات بين المضيف-ميكروبيومي في وقت مبكر من الحياة.

Abstract

المجتمعات البكتيرية المعوية تقام في بداية الحياة والتأثير على تنمية الخلايا المناعية والدالة. الحجمية الولدان عرضه للتأثيرات الخارجية العديدة بما في ذلك استخدام المضادات الحيوية والنظام الغذائي، مما يؤثر على قابلية لأمراض المناعة الذاتية والالتهابات. اضطرابات مثل أمراض الأمعاء الملتهبة (الأمريكتين) تتميز بتدفق إعداد كبيرة من الخلايا المناعية للامعاء. ومع ذلك، قد بالإضافة إلى ذلك الهجرة الخلايا المناعية مكيفة حسب الحجمية الخروج من الأمعاء للتأثير على الاستجابات المناعية في مواقع خارج المعوية. وبالتالي، هناك حاجة تحديد وتوصيف الخلايا التي قد تحمل رسائل للميكروبات من الأمعاء إلى المواقع البعيدة. هنا، يمكننا وصف طريقة لتسمية الخلايا في القولون من الفئران حديثي الولادة في فيفو التي تمكن من التعرف عليهم في مواقع خارج المعوية بعد الهجرة.

Introduction

الجهاز الهضمي الثدييات تؤوي مئات الأنواع من البكتيريا التي توجد في علاقة تكافلية مع المضيف¹. فرض تعايش سلمي مع هذه الميكروبات الخلايا المناعية الموجودة في الوسط المحلي وإقامة حاجز وقائي ضد الغزوات الممرض. وهكذا، التفاعلات ثنائية الاتجاه بين الخلايا المناعية والحجمية ذات الأهمية الحاسمة لإقامة مجتمع commensal أن يثقف المضيف الجهاز المناعي ويقوم بتعيين عتبة مفاعليه المناعي لمسببات الأمراض. التغييرات في العوامل الجرثومية يمكن تكوينها، أو dysbiosis، تخل بالتوازن المناعي والتشويش الدوائر التنظيمية التي تقيد الالتهابات المعوية مما يؤدي إلى الأمراض بوساطة جهاز المناعة مثل داء السكري من النوع 1 وبنك التنمية بين الأمريكتين^2،3 .

الفترة مباشرة بعد الولادة هو نافذة التنموية فريدة خلالها المجتمعات الميكروبية الأمعاء تبدأ في إنشاء نظام المناعة في نفس الوقت ينضج⁴. الحجمية بعد الولادة ليست مستقرة، مع التحولات في تركيبة المجتمع التي تحدث طبيعيا وكثيراً ما⁵. الخلايا المناعية التي تتفاعل مع الحجمية الموجودة في هذين الموقعين تشريحية متميزة في الأمعاء- بروبريا الصفيحة و ظهارة الأمعاء⁶. توجد أنواع عديدة من الخلايا المناعية في الأمعاء، بما في ذلك الخلايا الليمفاوية (مثل خلايا T وخلايا ب والخلايا اللمفاوية الفطرية) فضلا عن الخلايا النقوي (التي تتضمن الخلايا الجذعية، وحيدات، والضامة). هذه الخلايا، تعرف أيضا باسم الخلايا المكونة للدم، القيام بالعديد من الوظائف التي تحافظ على الحاجز المعوي، والحفاظ على التوازن.

بالإضافة إلى مهامها التنظيمية في مواقع المعوية، خلايا المناعة في الغشاء المخاطي قد تحمل أيضا رسائل الميكروبية إلى مواقع خارج المعوية لتنظيم الحصانة الشاملة^7،،من⁸⁹. هذا هو مجال يحظى باهتمام متزايد من البحوث ويسلط الضوء على الحاجة إلى أساليب لتحديد الخلايا المناعية التي تهاجر من الأنسجة المعوية من أجل التحقيق في وظيفتها. ويستخدم البروتوكول ذكرت هنا نموذجا ماوس متاحة تجارياً التي يتم استغلالها بروتين فلوري فوتوكونفيرتيبلي لتسمية الخلايا. أوبيكويتوسلي express الفئران^اقتطعت أم بروتين Dendra2 فلورية خضراء التي يتم تبديل لا رجعة فيه إلى الأسفار حمراء عند التنشيط بالضوء من الأشعة فوق البنفسجية (الأشعة فوق البنفسجية)¹⁰. استخدام قنية ألياف بصرية لتقديم 405 نانومتر الضوء في القولون الفئران حديثي الولادة، وعلينا أن نبرهن أن يمكن العثور على الخلايا المكونة للدم فوتوكونفيرتيد، التي يكون منشؤها أو عبور القولون في الطحال.

Protocol

وأجريت جميع الإجراءات الحيوان مع موافقة وامتثالا "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك) في مستشفى ماساشوستس العام.

تنبيه: هذا البروتوكول ينطوي على استخدام الليزر 3b فئة (LG3). يجب دائماً استخدام نظارات واقية الليزر LG3 عندما تعمل هذه الليزر. يجب أن يتبع المبادئ التوجيهية المناسبة للتدريب والسلامة لتجنب خطر الإصابة.

1-التصميم والجمعية لليزر

1. الاتصال أدى (الصمام) (405 نانومتر، 19.3 ميغاواط، وماجستير 1400، إلى جانب الألياف) للصمام سائق عن طريق تولي M8 4-دبوس موصل الكابل الذي يأتي للصمام. تشديد المسمار ربط الاتصال بعناية.
2. قبل إرفاق كبل تصحيح أوبتوجينيتيكس للصمام، اضغط الرابط الانفتاح للصمام الضوء للتأكد من وجود أية عوائق مرئية. ضربة في حفرة لإزالة أي عوائق إذا لزم الأمر وإدراج كبل تصحيح أوبتوجينيتيكس في فتح.
3. الاتصال قنية الألياف البصرية إلى كبل تصحيح أوبتوجينيتيكس بإدراج القنية في أما نهاية الأكمام موصل. إرفاق الطرف الآخر من الأكمام موصل الكبل التصحيح.  تطبيق ما يكفي من الضغط تأمين الاتصال ولكن يجب الحرص على عدم ثني أو كسر الألياف الضوئية في القنية.
   ملاحظة: قنية الهشة الألياف البصرية مغطى بغطاء الحماية كلما الليزر ليس قيد الاستخدام.
4. تعيين برنامج تشغيل مجموعة LED للوضع (CW) موجات مستمرة مع إدارة مقبض الضبط المستمر في 0 والحد الحالي إلى 1.2 ألف

2-فوتوكونفيرسيون للخلايا في القولون

ملاحظة: الفئران الذكور والإناث قد تعرضت إينتراكولونيك 405 نانومتر الضوء 1-2 أيام بعد ولادتهم، وضحى بها قبل أسبوع واحد من العمر.

1. تأمين مكان الظلام مع وصول إلى مخرج كهربائي. قم بتوصيل برنامج تشغيل الصمام بالمأخذ.
   ملاحظة: يتم تنفيذ هذا الإجراء في ضوء أبيض الحد الأدنى قد يسبب تعرض لفترة طويلة من الفئران للضوء المحيط فوتوكونفيرسيون غير المرغوب فيها من الخلايا. الضوء الأحمر كبديل لذلك.
   تحذير: الخطوة التالية تنطوي على استخدام الحيوان مخدر. إدارة المخدر تجري في غطاء "الطبقة الثانية" أو بواسطة استخدام نظام المسح مناسب آخر. قد يسبب استنشاق المخدر الدوخة، النعاس، أو حتى فقدان الوعي.
2. تخدير الماوس بالتعرض إلى إيسوفلوراني 4-5% في 100 ٪ O2 في مربع التعريفي. التحقق من العمق الصحيح للتخدير معسر بقوة باو هند (أي استجابة). المحافظة على التخدير عن طريق الآنف مخروط في حوالي 2% إيسوفلوراني. منع التعرض معالج إلى إيسوفلوراني باستخدام غطاء مناسباً أو جهاز المسح مخدر.
3. ضع الماوس أنيسثيتيزيد للتعرض إينتراكولونيك باستخدام اليد 1 إلى القفا الجزء الخلفي الماوس بلطف بواسطة السبابة والإبهام. اقلب الماوس لفضح البطن. تخفيف القبضة إذا كان الماوس يبدأ يفقد لونه الوردي، أو إذا كان معدل التنفس يبدأ ببطء. آمنة ذيل الماوس بين الدائري والأصابع قليلاً.
4. باليد الأخرى، انزع الغطاء واقية من القنية. مع الإبقاء على إدراج طويلة محور قنية موازيا لخط الوسط للماوس، بلطف قنية الألياف البصرية من خلال فتحه الشرج في القولون حيث تكون كل 5 مم من الألياف الضوئية داخل الماوس.
   ملاحظة: يتم تنفيذ هذا الإجراء ببطء ومع الرعاية لا التسلخات الجدار colonic. دقيقة التلوي والتواء من القنية الإيدز النهوض في القولون.
5. ارتداء نظارات واقية وزيادة الليزر الحالية إلى الحد الأقصى للقيمة (جميع الطريق عكس اتجاه عقارب الساعة). تأكيد وجود ضوء الأشعة فوق البنفسجية من خلال النظر في البطن شفافة للماوس.
   ملاحظة: نظارات واقية الليزر LG3 كبير انخفاض الرؤية. لقد زميل (ارتداء المعدات الواقية) مساعدة في ارتداء نظارات واقية وتحول على الليزر.
6. كشف القولون بأشعة الليزر لما مجموعة 2 دقيقة سحب قنية حوالي 1 مم كل 30 ثانية تحقيق أقصى قدر من منطقة لومينال المعرضة للضوء. في نهاية 2 دقيقة، قم بإيقاف تشغيل الليزر.
7. ببطء بإزالة القنية من الماوس. بعد تعافيه من التخدير في قفص حارة فارغ، العودة الماوس إلى القفص المنزل.

3-عزل الخلايا اللمفية المعوية

1. إعداد 1 لتر هانك حل "متوازن الملح"/العجل المصل (حبس/CS) المخزن المؤقت و 200 مل من المخزن المؤقت لقطاع الظهارية، 500 مل من الإعلام غسل و 200 مل من حمض الإيثيلين (يدتا)-يغسل وسائل الإعلام الحرة.
   ملاحظة: يتم حساب وحدات التخزين كاشف لحجم عينة من 9.
   1. جعل المخزن المؤقت حبس/CS (حبس؛ CS 5%) بإضافة 50 مل CS إلى 950 مل حبس. تخزينها على الجليد.
   2. إعداد المخزن المؤقت قطاع الظهارية [حبس؛ CS 5%؛ ديثيوثريتول 1 مم (DTT)؛ يدتا 5 مم؛ 15 ملم حمض الببرازين-1-اثانيسولفونيك 4-(2-Hydroxyethyl) (حبيس) (الرقم الهيدروجيني 7.2-7.5)] بإضافة 10 مل CS، 200 ميليلتر DTT م 1، 2 مل يدتا 0.5 م ومل 3 م 1 حبيس المخزن المؤقت لمل 185 من هبس. وضع المخزن المؤقت قطاع الظهارية في حمام مائي 37 درجة مئوية.
   3. جعل الوسائط يغسل (حبس؛ CS 1% 1 مم يدتا) بإضافة 5 مل CS و 1 مل يدتا 0.5 M إلى 494 مل حبس. احفظه في درجة حرارة الغرفة.
   4. تحضير الوسائط أغسل يدتا خالية (حبس؛ CS 1% 15 ملم حبيس) بإضافة 2 مل من CS و 3 مل 1 م حبيس إلى 195 مل حبس. احفظه في درجة حرارة الغرفة.
   5. إجراء مخزن مؤقت نظام مراقبة الأصول الميدانية [1 × الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) (pH = 7.2)؛ CS 2%] بإضافة 10 مل CS لمل 490 من برنامج تلفزيوني. تخزينها على الجليد.
2. تحضير طبق جمع الأنسجة بوضع مصفاة خلية ميكرومتر 70 داخل طبق ثقافة 60 × 10 مم. إضافة 10 مل من المخزن المؤقت حبس/CS (حبس؛ العازلة CS 5% في خطوة 3.1.1 وتخزينها على الجليد) إلى الطبق ووضعه على الجليد.
3. Euthanize الماوس عن طريق جرعة زائدة من استنشاق إيسوفلوراني باستخدام المسح المناسب من مخدر (تعرض دقيقة تقريبا 3 > إيسوفلوراني 4 ٪ في هواء الغرفة أو في 100% O₂). بعد وقف الظاهر للتنفس ومنعكس الحركة، والتحقق من عدم وجود الألم العميق بشدة معسر مخلب هند (من المستحسن استخدام الملقط). ضمان القتل الرحيم عن طريق قطع رأس استخدام زوج من مقص الجراحة أو الشفرة مباشرة جديدة.
   ملاحظة: لا ينصح خلع عنق الرحم لهذه الخطوة نظراً لحجم وسن الحيوان. هذه الأساليب وتتسق مع المبادئ "التوجيهية وبرايتون" عام 2013 بشأن القتل الرحيم، وأقرت MGH IACUC.
4. حصاد القولون باستخدام الملقط نظيفة ومقص لفتح البطن. وتعكس الأمعاء إلى الجانب 1 من البطن الماوس لفضح القولون. إزالة القولون كله بأول ترانسيكتينج أنه مجرد البعيدة (باتجاه فتحه الشرج) للأعور. ثم، حين تتشبث بشدة القولون مع الملقط، استخدام مقص لقطع طريق مجرى البول للمستقيم. قطع القولون بالقرب من فتحه الشرج ممكن. حصاد الطحال بعد إزالة القولون (انظر الخطوات 4.1-4.2 أدناه).
   ملاحظة: بينما يستهدف البروتوكول فوتوكونفيرسيون فقط ~ 25% من القولون في حديثي الولادة (5 ملم قنية الألياف البصرية)، يتم حصاد القولون الكامل للمساعدة في عزل الخلية.
5. تنظيف القولون باستخدام الملقط لدفع محتويات الخروج من القولون وعلى منشفة ورقية جافة. مجانسة الأنسجة باستخدام شفرات الحلاقة لختم ناعما القولون في لصق على غلاف طبق الثقافة ومن ثم نقل هذا اللصق إلى مصفاة الخلية في طبق بتري.
6. إضافة شريط إثارة مغناطيسية طويلة نظيفة 8 مم إلى المصفاة ووضع الطبق على لوحة 9-موقف محرض مغناطيسية. تعيين سرعة شريط إثارة المغناطيسية إلى 800 لفة في الدقيقة واحتضان الخلايا لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تجاهل المخزن المؤقت وتكرار الغسيل باستخدام 10 مل من حبس/CS (حبس؛ العازلة CS 5% في خطوة 3.1.1 وتخزينها على الجليد). تجاهل المخزن المؤقت في نهاية الغسيل.
7. فصل الخلايا الظهارية بإضافة 10 مل من قطاع طلائي بريوارميد المخزن المؤقت (حبس CS 5% 1 مم DTT؛ يدتا 5 مم; 15 ملم حبيس [الرقم الهيدروجيني 7.2-7.5] المخزن المؤقت الذي تم في الخطوة 3.1.2 وتخزينها في حمام مائي 37 درجة مئوية) إلى مصفاة الخلية ويحرك 800 لفة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة في 3 حاضنة 7 درجة مئوية. في نهاية الحضانة، نقل المخزن المؤقت الذي أثري في الكسر الظهارية في أنبوب نظيف 15 مل.
   ملاحظة: ظهارة والخلايا المرتبطة بها (الخلايا الظهارية المعوية والخلايا الظهارية المعوية) تم إصدارها في المخزن المؤقت، بينما تبقى الخلايا في سليمة بروبريا الصفيحة في مصفاة الخلية أثناء هذه الخطوة¹¹.
   1. الطرد المركزي الكسر الظهارية المعوية المخصب (IELs) في 700 x ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تجاهل المادة طافية وريسوسبيند بيليه الخلية في 1 مل من المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية. تخزينها على الجليد للاستخدام في الخطوة 3، 15.
8. تغسل الصفيحة بروبريا الكسر داخل مصفاة الخلية 2 x مع حبس/CS. للقيام بذلك، بإضافة 10 مل من محلول حبس/CS (حبس؛ 5% CS المخزن المؤقت التي تم إجراؤها في الخطوة 3.1.1 الذي تم تخزينه على الجليد) إلى مصفاة الخلية ويقلب 800 لفة في الدقيقة لمدة 5 دقائق في حاضنة 37 درجة مئوية. تجاهل المخزن المؤقت بعد كل غسل.
9. تغسل العينة 2 x في الغسيل وسائل الإعلام. إضافة 10 مل الإعلام يغسل (حبس؛ CS 1% 1 مم يدتا المخزن المؤقت الذي تم في الخطوة 3.1.3 وتخزينها في درجة حرارة الغرفة) إلى مصفاة الخلية وآثاره من 800 لفة في الدقيقة لمدة 15 دقيقة في حاضنة 37 درجة مئوية. تجاهل المخزن المؤقت بعد كل غسل.
   1. بعد استخدام وسائط الإعلام الغسيل، قم بتخزينها على الجليد للاستخدام في الخطوة 3.14.
10. تغسل العينة 2 x مع حبس CS. بإضافة 10 مل من المخزن المؤقت حبس/CS (حبس؛ العازلة CS 5% في خطوة 3.1.1 الذي تم تخزينه على الجليد) إلى مصفاة الخلية وآثاره من 800 لفة في الدقيقة لمدة 5 دقائق في حاضنة 37 درجة مئوية. تجاهل المخزن المؤقت بعد كل غسل.
11. احتضان الأنسجة في المخزن المؤقت ليغسل يدتا مجاناً. إضافة 10 مل من الغسيل خالية يدتا العازلة (حبس؛ CS 1% 15 ملم حبيس المخزن المؤقت الذي تم في الخطوة 3.1.4 وتخزينها في درجة حرارة الغرفة) إلى مصفاة الخلية واحتضان لوحة لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة دون إثارة. تجاهل المخزن المؤقت في نهاية هذه الخطوة.
12. تغسل العينة 2 x مع حبس/CS وإعداد الحل الإنزيم. أضف 10 مل من حبس/CS (حبس؛ العازلة CS 5% في خطوة 3.1.1 الذي تم تخزينه على الجليد) المخزن المؤقت إلى مصفاة الخلية ويقلب من 800 لفة في الدقيقة لمدة 10 دقيقة في حاضنة 37 درجة مئوية. تجاهل المخزن المؤقت بعد كل غسل.
    1. إعداد الحل إنزيم (خالية من يدتا غسل العازلة؛ 0.1 مغ/مل الدناز الأول؛ كولاجيناز 167 ملغ/مل) خلال الفترة الثانية للمياه والصرف الصحي: إضافة 9 ملغ من الدناز أنا و 15 ملغ من كولاجيناز المجففة بالتبريد إلى 90 مل خالية يدتا يغسل المخزن المؤقت. تخزين الحل في درجة حرارة الغرفة.
13. هضم كسر الصفيحة بروبريا الواردة في مصفاة الخلية للحصول على الصفيحة بروبريا اللمفاويات (لبلس). أضف 10 مل الحل إنزيم (خالية يدتا المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي؛ 0.1 مغ/مل الدناز الأول؛ 167 ملغ/مل كولاجيناز المخزن المؤقت في خطوة 3.12.1 وتخزينها في درجة حرارة الغرفة) إلى مصفاة الخلية وآثاره من 800 لفة في الدقيقة لمدة 45 دقيقة في حاضنة 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: يتم إصدار لبلس إلى الحل بعد الهضم الأنزيمي.
    1. جمع الحل إنزيم تحتوي على الخلايا وتصفية من خلال مصفاة خلية جديدة في أنبوب 50 مل مخروطية الشكل.
14. إضافة 20 مل الإعلام الغسيل البارد (حبس; CS 1% 1 مم يدتا المخزن المؤقت في خطوة 3.1.3 والمخزنة على الجليد في الخطوة 3.9.1) في الخلايا التي تمت تصفيتها لحظر نشاط كولاجيناز في حل الإنزيم. الطرد المركزي الأنبوب في 700 غ س لمدة 6 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تجاهل المادة طافية وريسوسبيند بيليه الذي يحتوي على لبلس في 1 مل من المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية.
15. الجمع بين IEL (من الخطوة 3.7.1) والكسور LPL (من الخطوة 3.14) ووصمة عار لهم مع الأجسام المضادة مترافق الفلورسنت لتحليل تدفق سيتوميتريك (راجع الخطوة 5).
    ملاحظة: الكسور IEL و LPL قد تكون ملطخة بشكل منفصل إذا كان المطلوب هو معلومات المقصورة.

4-عزل الخلايا الليمفاوية من الطحال

1. إعداد أنبوب جمع بإضافة 500 ميليلتر من المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية في أنبوب ميكروسينتريفوجي. تخزينها على الجليد.
2. بعد إزالة القولون (الخطوة 3، 4)، حصاد الطحال كله ووضعه في أنبوب جمع. تخزين الأنسجة على الجليد.
3. باستخدام الخالطون أنسجة كهربائية، مجانسة الطحال في أنبوب ميكروسينتريفوجي لحوالي 1 دقيقة للطرد المركزي العينة على 300 غرام x [الطرد المركزي الصغرى] لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة و aspirate قبالة المادة طافية.
4. إجراء تحلل خلايا الدم الحمراء عن طريق ريسوسبيندينج العينة في 500 ميليلتر الأمونيوم-كلوريد البوتاسيوم (ACK) تحلل المخزن المؤقت الشروع في موت الخلايا التي تحلل ناضح. تسمح العينة لاحتضان 1-2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة وثم ريسوسبيند أنه في 725 ميليلتر من المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية.
5. الطرد المركزي العينة على 300 غرام x [الطرد المركزي الصغرى] لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة و aspirate قبالة المادة طافية. ريسوسبيند بيليه في 500 ميليلتر من المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية وتصفيتها من خلال مصفاة خلية 40 ميكرومتر في أنبوب ميكروسينتريفوجي جديدة. نقل العينة كلها إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي جديدة ووصمة عار مع الأجسام المضادة مترافق الفلورسنت لتحليل تدفق سيتوميتريك (راجع الخطوة 5).

5-تحديد ديندرا-r⁺ "الخلايا باستخدام التدفق الخلوي"

1. الطرد المركزي في عينات 300 x ز [الطرد المركزي الصغرى] لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة و aspirate قبالة المادة طافية IEL/LPL والطحال.
2. ريسوسبيند الكريات في 100 ميليلتر من جسم تلطيخ المزيج. إعداد جسم تلطيخ المزيج بإضافة 1 ميليلتر من الأجسام المضادة مترافق فلوريسسينتلي-CD45 إلى 100 ميليلتر من نظام مراقبة الأصول الميدانية المخزن المؤقت كل عينة.
   ملاحظة: من المهم تيتراتي الأجسام المضادة التي تستخدم لقياس التدفق قبل التجربة لتحديد تركيز المثلى التي يحدث فيها الربط تشبع.
3. احتضان هذه العينات لمدة 35 دقيقة على الجليد (في مكان مظلم).
4. ريسوسبيند العينات في 300 ميليلتر من نظام مراقبة الأصول الميدانية المخزن المؤقت والطرد المركزي لهم في ز 300 x [الطرد المركزي الصغرى] لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. نضح المادة طافية وريسوسبيند العينات في 325 ميليلتر من المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية. تحليل العينات في سيتوميتير تدفق.

النتائج

استخدم كبل الألياف الضوئية لتوصيل 405 نانومتر الضوء إلى النقطتين الفئران^اقتطعت أم 2-القديمة يوم. في التجارب السابقة، تعرض s 30 مصممة على إعطاء فوتوكونفيرسيون قصوى لخلايا القولون مع سيتوتوكسيسيتي الحد الأدنى (الشكل 1أ). ولذلك، التعرض s 30 متسلسل...

Discussion

تحديد وتوصيف الخلايا التي تتفاعل مع وتتأثر الحجمية في القولون مهمة وينبغي أن تيسر فهم كيف يتم ترحيل المعلومات من المكروية المخاطية إلى بقية الجسم. ويتطلب أسلوب واحد لدراسة الهجرة الخلية المتصلة بالقناة الهضمية عزل الخلايا المرتبطة بالقناة الهضمية متبوعاً نقل التبني في الفئران المستفيد?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Laser
Light Emitting Diode (LED)	THORLABS	M405FP1	CAUTION: this is a Class 3b laser. Safety goggles must be worn when using the laser. It emits a 405 nm wavelength with a current of 1400 mA. It is fiber-coupled. It accepts SMA connector. https://www.thorlabs.com/thorproduct.cfm?partnumber=M405FP1
LED driver	THORLABS	LEDD1B	Drives a constant current of 1200 mA through the laser. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=2616
Optogenetics patch cable	THORLABS	M87L01	1 m long cable with an SMA connector. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=11405&pn=M87L01#11454
Fiber optic cannula	Doric lenses	MFC_480/500-0.5_5mm_ZF1.25_C45	5 mm long cannula with an outer diameter of 500 µm and an inner diameter of 480 µm. The NA value is 0.5. The ferrule is zirconia, 1.25 mm OD. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=6036
Power supply	THORLABS	KPS101	Supplies 15 V with a current of 2.4 A https://www.thorlabs.com/search/thorsearch.cfm?search=KPS101
LG3 laser safety goggles	THORLABS	LG3	Orange lenses with 47% visible light transmission https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=762&pn=LG3#2523
Red light	Electron Microscopy Sciences	74327-10	15 W lamp https://us.vwr.com/store/product/12360027/paterson-safelight-electron-microscopy-sciences
Intestinal cell isolation
Isoflurane	Patterson Veterinary	07-893-1389	CAUTION: inhalation of this anesthetic may cause dizziness, drowsiness, or even unconsciousness. This anesthetic should be used in a Class II hood.  https://www.pattersonvet.com/Supplies/ProductFamilyDetails/PIF_762328?carouselPageNumber=3
1X HBSS	Gibco	14025076	Ca/Mg free https://www.fishersci.com/shop/products/gibco-hbss-calcium-magnesium-no-phenol-red-4/14025076?searchHijack=true&searchTerm=14025076&searchType=RAPID&matchedCatNo=14025076
Calf Serum	Hyclone AZM	197696
EDTA	Invitrogen	15575020	0.5 M concentration https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15575020?SID=srch-srp-15575020
DTT	Sigma	10197777001	CAUTION: harmful if swallowed and causes skin irritation. 1 M concentration https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/dttro?lang=en&region=US
HEPES	Gibco	15630080	1 M concentration https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15630080?SID=srch-hj-15630080
Petri dish	Corning	353004	https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-easy-grip-tissue-culture-dishes-2/08772f?searchHijack=true&searchTerm=08772F&searchType=RAPID&matchedCatNo=08772F
70 micron cell strainer	Falcon	352350	https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/087712
Micro magnetic stir bar	Fisherbrand	1451364	Rinse in 70% ethanol after each use. Rinse several times in distilled water prior to each use. The bar is 8 mm long with an octagonal shape. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-octagonal-magnetic-stir-bars-12/1451364#?keyword=1451364
Magnetic stir plate	Corning Laboratory Stirrers	440826	https://www.coleparmer.com/i/corning-440826-nine-position-stirrer-120-vac-60-hz/8430420?PubID=UX&persist=true&ip=no&gclid=CjwKCAiAqbvTBRAPEiwANEkyCLPLrWABXmOUI0QE53NLV0Owxlcs2V1K6rWbRPOwlcVVDq000FBiQxoCqQAQAvD_BwE
Collagenase	Roche	5401020001	https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/05401020001?lang=en&region=US&gclid=CjwKCAiAjuPRBRBxEiwAeQ2QPhE44qlvxjmo1PYu3zCas3w-_d6P9gKjXW82-c1EOm6NjPHCc5WuixoC_0IQAvD_BwE
DNase I	Sigma	10104159001	https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/10104159001?lang=en&region=US
1X PBS	Gibco	20012-027	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/20012027?SID=srch-hj-20012-027
Pipet aid	Thermo Scientific	14387165	https://www.fishersci.com/shop/products/s1-pipette-fillers/14387165#?keyword=14387165
10 mL serological pipet	Falcon	357530	https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-serological-pipets-bulk-pack-5/p-163659
25 mL serological pipet	Falcon	357515	https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-serological-pipets-bulk-pack-5/p-163659
15 mL conical centrifuge tube	Thermo Scientific	339651	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/339650
50 mL conical centrifuge tube	Thermo Scientific	339653	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/339650
Single cell suspension
Eppendorf tubes	Seal-Rite	1615-5500	Holds 1.5 mL. https://www.usascientific.com/Seal-Rite-1.5-ml-tube.aspx
Tissue homogenizer	Kimble	K7495400000	Requires 2 AA batteries. https://www.fishersci.com/shop/products/kontes-pellet-pestle-cordless-motor-cordless-motor/k7495400000
Homogenizer tips	Kimble	7495210590	Plastic, 0.5 mL tips https://www.fishersci.com/shop/products/kimble-chase-kontes-pellet-pestle-14/k7495210590#?keyword=7495210590
ACK lysing buffer	Gibco	A10492-01	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A1049201?SID=srch-hj-A10492-01
40 micron cell strainer	Falcon	08-771-1	https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/087711
Antibodies
BV786 anti-mouse CD45	BD	564225	Clone 3O-F11 https://www.bdbiosciences.com/us/reagents/research/antibodies-buffers/immunology-reagents/anti-mouse-antibodies/cell-surface-antigens/bv786-rat-anti-mouse-cd45-30-f11/p/564225
Live/Dead	Invitrogen	L34962	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/L34962
Other
Razor blades	VWR	55411-050	Use for decapitation. https://us.vwr.com/store/product/4548306/vwr-razor-blades