كريسبر دليل الحمض النووي الريبي استنساخ الثدييات بالأنظمة

Summary

ويرد هنا، بسيطة، تتسم بالكفاءة، وطريقة فعالة من حيث التكلفة لاستنساخ سجرنا.

Abstract

البروتوكول المحدد وصف أساليب مبسطة لتوليد تتسم بالكفاءة والفعالية من حيث التكلفة المرتبطة Cas9 دليل الكشف. وترد اثنين من الاستراتيجيات البديلة لاستنساخ الحمض النووي الريبي (جرنا) دليل استناداً إلى استخدام إنزيم التقييد IIS نوع بسمبي في تركيبة مع مجموعة من ناقلات متوافقة. خارج الوصول إلى خدمات سانغر التسلسل للتحقق من صحة المتجهات التي تم إنشاؤها، لا معدات خاصة أو الكواشف مطلوبة وبصرف النظر عن تلك التي المعيار لمختبرات البيولوجيا الجزيئية الحديثة. الأسلوب المبين المقصود في المقام الأول لاستنساخ جرنة واحد واحد أو واحد متجه مقترن بالتعبير عن جرنة في وقت واحد. هذا الإجراء غير مقياس جيد لجيل المكتبات التي تحتوي على آلاف جرناس. لهذه الأغراض، يوصي بإيجاد مصادر بديلة لتوليف اليغنوكليوتيد مثل رقاقة اليغو التوليف. وأخيراً، بينما يركز هذا البروتوكول على مجموعة من الثدييات ناقلات، الاستراتيجية العامة من البلاستيك وهو ينطبق على أي كائن حي إذا كان ناقل جرنة المناسب متاح.

Introduction

البروتينات المرتبطة كريسبر 9 (Cas9) هو اندونوكلياسي الموجهة بالحمض النووي الريبي التي تتجه نحو هدف الجينوم المطلوب عند الرصاصية مع دليل الحمض النووي الريبي (جرنا)^1،2صغيرة مصممة بشكل مناسب. جرناس تشمل 20-النوكليوتيدات تسلسل (بروتوسباسير)، ومكملة لتسلسل الجينوم المستهدفة. إلى جانب الهدف الجينوم هو تسلسل 3 ' المرتبطة بروتوسباسير عزر (بام)، التي تلزم لربط Cas9. وفي حالة العقدية المقيّحة Cas9 (SpCas9)، هذا وقد تسلسل نج. عند ربط الهدف الحمض النووي، كليفس Cas9 كل خيوط من الحمض النووي، مما حفز إصلاح الآليات التي يمكن استغلالها لتعديل موضع الاهتمام. تفعيل المسار (نج) الانضمام إلى نهاية عرضه للخطأ غير-مثلى يمكن أن يسبب تعطل الجين المستهدف. بدلاً من ذلك، الإصلاحات التي أجريت عن طريق التثب مثلى يمكن أن تحفز إدماج المستهدفة من تسلسل الحمض النووي المطلوب إذا لم يتم توفير قالب مانحة⁶. Cas9 نوكلاس-الميت المتغيرات (dCas9) يمكن أيضا أن يتم إنشاؤه³ بتحور المخلفات داخل Cas9 التي تعتبر أساسية للنشاط اندونوكليوليتيك. dCas9 تبقى مختصة للحمض النووي ملزم ولكن لا تقطع هدفها منضم. بالصمامات مختلف المجالات المستجيب ل dCas9 وتوجيهها قرب موقع بدء النسخي للجينات، يمكن استخدام dCas9 لتحريض الجينات انتقائية أو الجينات الجزئية إسكات^4،5.

بينما قوية بشكل لا يصدق، يتطلب القدرة على استخدام Cas9 لاستهداف تسلسل الجينوم من المصلحة أن مستخدم يقوم بأول جرنة فريدة من نوعها للمواقع المستهدفة. مجموعة متنوعة من أساليب لبناء ناقلات التعبير جرنا سابقا تم وصف العديد من الكفاءة متفاوتة وتكلفة^6،،من⁷⁸. قائمة بذاتها بكر أمبليكونس يمكن استخدامها جرناس للفرز السريع، الانتقال من التسليم اليغنوكليوتيد إلى تعداء حدود عدة ساعات؛ ومع ذلك، يتطلب هذا أولترامير (ما يزيد على 100 شركة بريتيش بتروليوم) التوليف اليغو، وهي مكلفة⁹. من الممكن أيضا لشراء جبلوكس التي أكثر فعالية من حيث التكلفة من أولتراميرس. كما Cas9 سرعان ما أصبحت جزءا لا يتجزأ من مجموعة الأدوات الحديثة في مجال البيولوجيا الجزيئية، سيكون وسيلة بسيطة وغير مكلفة، وذات كفاءة عالية لاستنساخ جرنة نعمة للحقل. وقد استخدمت الأسلوب الموصوفة هنا في المجموعة والمختبرات المتعاونة لسنوات عدة لتوليد جرناس فريد 2,000 ما يزيد على⁴.

الطريقة المحددة التي تركز على تقنيات لاستنساخ متجهات متوافق مع لينتيفيرال التي تحتوي على جرنة واحد أو اثنين جرناس في معظم. وينصح النهج البديلة للجيل من البلازميدات المحتوية على جرناس اثنين أو أكثر، أو لاستنساخ مكتبة جرناس،^9،10،،من¹¹¹².

Protocol

ملاحظة: يحدد البروتوكول التالية كيفية تنفيذ تصميم جرنة باستخدام أدوات الإنترنت (الخطوات 1، 1، 1-4)، التي مشتركة بين جميع أساليب البناء بلازميد جرنة بالتفصيل في هذه المخطوطة. حالما يتم تحديد جرناس المطلوب، يتم وصف الخطوات لترتيب النوكليوتيد اللازمة جنبا إلى جنب مع العديد من الطرق المختلفة لإدخال النوكليوتيد في ناقلات التعبير (مثلاً، pSB700). عرض طرق 2 لاستنساخ ناقلات معربا عن دليل واحد على أساس أما ربط إلى ناقل تعبير مهضوم (الخطوات 2-7.3) أو البوابة الذهبية الاستنساخ (الخطوات 8-8.4). كذلك المبين استراتيجية لناقلات التعبير عن دليل مقترن بالاستنساخ باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) تليها البوابة الذهبية الاستنساخ (الخطوات 11-16). وأخيراً، يرد أيضا الأساليب الشائعة للقيام تحول الكيميائي كولاي (الخطوات 9-9.6) وتعبير ناقلات التحقق من تسلسل (الخطوات 10 إلى 10.2.3).

1. تصميم النوكليوتيد جرنة باستخدام أدوات الإنترنت كما يلي.
   1. جرناس التصميم باستخدام أدوات الإنترنت مثل أداة على الإنترنت (https://crispr.med.harvard.edu/sgRNAScorerV2/) سجرنا 2.0 هداف¹³ أو البدائل مثل أداة تصميم سجرنا واسعة (http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/ سجرنا-تصميم)¹⁴ والعديد غيرها¹⁵.
   2. استخدم اسم الجينات، الرمز، أو تسلسل الهدف الحمض الخام لتوليد متواليات جرنة المحتملة.
      ملاحظة: يتم إنشاء ملف جدول بيانات (.csv/.xls) مع كل جرناس المحتملة ضد الجينات أو تسلسل المقدمة. وستبلغ جودة جرناس المحتملة نقاط في حالة استخدام هذه الأداة على الإنترنت سجرنا 2.0 هداف أو % على الكفاءة المستهدفة إذا يتم استخدام أداة تصميم سجرنا واسع النطاق. يتم اشتقاق كل التدابير في استناداً إلى نشاط قطع على الهدف.
   3. تنظر النشاط المستهدف في اختيار جرنة عند ترتيب جرناس.
      ملاحظة: أدلة المثلى تلك مع أكبر قدر من الكفاءة في الهدف والنشاط الأقل خارج الهدف. التنشيط (كريسبرا)، جرناس المصممة لاستهداف المنطقة من 1-200 bp المنبع ابدأ النسخي^4،موقع (TSS)¹⁵. لتثبيط (كريسبري)، تم تصميم جرناس لاستهداف المنطقة من 50 شركة بريتيش بتروليوم المنبع لخدمات الدعم التقني حتى 300 bp المصب المرفق⁵. لتعطيل جين باستخدام قطع Cas9، صممت جرناس لاستهداف أول 10-50% من تسلسل الترميز المصب كودون (كاستهداف جرناس 3 ' نهاية الجين قد أظهرت أن تكون أقل فعالية) بدء¹³.
   4. التأكد من لا مواقع بسمبي الداخلية الحالية إذا النوكليوتيد المستخدمة لاستنساخ البوابة الذهبية، كما سيؤدي هذا النوكليوتيد ملدنة يجري هضمها¹³.
2. حدد تسلسل الجينوم المستهدفة وإزالة 3 ' نج بام (ترك التسلسل بروتوسباسير فقط) لتعديل تسلسل اليغنوكليوتيد جرنة واحد (مثلاً، يبدأ التسلسل: كجكجتجكتكتكككتكاتككاتج).
   ملاحظة: إذا كان استخدام جدول بيانات، سيتم إزالة الصيغة التالية 3 ' نج: =LEFT(A2,LEN(A2)-3)، حيث هو A2 الخلية التي تحتوي على تسلسل المستهدفة بام.
   1. إلحاق كاككج إلى نهاية 5 ' اليغو.
      ملاحظة: عند ربط للعمود الفقري pSB700، سيضم هذا التسلسل 3 ' نهاية المروج U6 يقود النسخ من جرنة. يضمن التسلسل "كاكك" متوافقة مع يتدلى ناقلات هضمها بسمبي pSB700 اليغو. "G" هو شرط للمروجين "الثالث بوليميريز" ويضمن بدء نسخ جرنة كفاءة. تستخدم الصيغة التالية في جدول بيانات للقيام بهذه المهمة: =CONCATENATE("CACCG",(B2))، حيث هو B2 الخلية التي تحتوي على تسلسل بروتوسباسير [مثلاً، إضافة 5 ' كاككج تسلسل إلى بروتوسباسير: كاككجكجكجتجكتكتكككتكاتككا (وهذا هو اليغو الأمام النهائية التي يتم طلبها)].
   2. إنشاء تكملة عكس التسلسل بروتوسباسير (اتفاقية روتردام).
      ملاحظة: على سبيل المثال، عكس تكمل بروتوسباسير المذكور أعلاه هو تجاتجاججاجاجكاكجكج.
   3. قم بإلحاق AAAC 5 ' نهاية بروتوسباسير اتفاقية روتردام. قم بإلحاق ج إضافية نهاية 3 ' بروتوسباسير اتفاقية روتردام (عكس اليغو).
      ملاحظة: تسلسل "آآك" يضمن اليغو متوافقة للاستنساخ في ناقلات هضمها بسمبي pSB700. "ج" إضافية في نهاية 3 'مطلوب يصلب التسلسل لبدء"G" إضافة إلى اليغو إلى الأمام. استخدام الصيغة التالية في جدول بيانات القيام بهذه المهمة =CONCATENATE("AAAC",(C2),"C")، حيث C2 هي الخلية التي تحتوي على تسلسل تكملة عكس [مثلاً، آآكتجاتجاججاجاجكاكجكجك (هذا هو اليغو عكس النهائي هو أمرت)].
3. تأمر النوكليوتيد، مع لا تعديلات إضافية على النوكليوتيد.
   1. نظام الحد الأدنى من اليغو المطلوبة، كما هناك حاجة إلى كميات صغيرة جداً فقط لردود فعل الاستنساخ.
4. تمييع الإشعال المجففة بالتبريد بتركيز نهائي من 100 ميكرومتر في 1 × المخزن المؤقت للشركة المصرية للاتصالات (10 ملم تريس Cl، درجة الحموضة 7.5 مع 1 مم يدتا).
5. الكوة 1:1 إلى الأمام وعكس النوكليوتيد (مثلاً، 10 ميكروليتر كل) إلى بكر الحد الأقصى لقطاع الأنابيب.
   ملاحظة: هذا سوف يسمح السريع استنساخ العديد من جرناس في وقت باستخدام ماصة الأقنية.
   1. دوامة وتدور أسفل الخلائط اليغو (ز 100 x لمدة 15 ثانية). تبني رد الفعل في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق قبل إعداد الربط.
      ملاحظة: ليس الضرورية الحرارة وبارد ثم الخلائط اليغو تيسيرا على الصلب. تجدر الإشارة إلى أنه قد تجمع 3-4 أزواج من النوكليوتيد جرنة وتعتيق في رد فعل واحد (مثلاً، ميكروليتر ميكس 3 إلى الأمام وميكروليتر 3 من عكس النوكليوتيد معا من يصل إلى 4 أزواج اليغو جرنة، إعطاء إجمالي حجم 24 ميكروليتر). يمكن تعديل حجم النوكليوتيد المستخدمة للصلب لاستيعاب احتياجات المستخدم.
      ملاحظة: تصف الخطوات 6-7.3 بريديجيسشن pSB700. للحصول على أسلوب بديل، راجع الخطوة 8، الذي يصف ربط قيد بسمبي خطوة واحدة.
6. هضم 1-5 ميكروغرام من ناقلات التعبير الدليل المحدد pSB700 مع بسمبي (ميكروليتر 0.5 الواحدة 1 ميكروغرام) ح 1 في¹⁵من 55 درجة مئوية. إجراء عملية هضم ناقلات التعبير جرنة pSB700 في إجمالي حجم 40 ميكروليتر (الجدول 1).
   1. تشغيل منتجات الهضم على 1.5% (wt/المجلد) ذوبان منخفضة [اغروس] هلام.
   2. قطع الفرقة هضمها ناقلات العمود الفقري الذي يتوافق مع جزء من ~ 9 كيلو بايت في الحجم، ومكان الشريحة جل في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل (الشكل 1).
   3. استخدام أدوات تنقية جل تجاري لاستخراج الحمض النووي من [اغروس] هلام وفقا لإرشادات الشركة المصنعة.
   4. الوت الحمض النووي إلى 10-15 ميكروليتر من المخزن المؤقت للشركة المصرية للاتصالات (10 ملم تريس، درجة الحموضة 7.5؛ 10 مم تريس، pH 8.0) للحصول على النذرة مركزة.
7. سد النوكليوتيد جرنا الملدنة من الخطوة 4 إلى ناقل التعبير دليل هضمها بسمبي pSB700 في رد فعل 20 ميكروليتر (الجدول 2) لاستنساخ النوكليوتيد جرنا إلى ناقل التعبير pSB700 ما قبل هضمها.
   1. أولاً، إضافة الماء، المخزن المؤقت، والحمض النووي، ثم دوامة الخليط وإضافة الإنزيم، دوامة 1 الوقت النهائي بعد إضافة الإنزيم وتدور أسفل الحل (ز 100 x لمدة 15 ثانية). احتضان ردود الفعل في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها.
   2. وتشمل فعل مراقبة سلبية لا إدراج يحتوي على ناقل هضمها بسمبي وحدها، دون إدراج اليغو جرنا ملدنة. يمكن استخدام 1 ميكروليتر من المياه بدلاً من 1 ميكروليتر من النوكليوتيد جرنة للا إدراج عنصر التحكم السلبي.
   3. المضي قدما في تحويل (الخطوة رقم 9).
      ملاحظة: الخطوة 8 أسلوب بديل بريديجيسشن pSB700 كما هو موضح في الخطوات 7، 6-3.
8. إدخال النوكليوتيد جرنة (الموضحة في الخطوات 1-5.1) إلى ناقل pSB700 عن طريق استخدام استنساخ البوابة الذهبية لربط القيد بسمبي خطوة واحدة.
   1. تجميع مزيج الرئيسي (س 1) — إذا كان يتم يتم استنساخ جرناس متعددة، إعداد مزيج الرئيسي دون إدراج النوكليوتيد المضافة (الجدول 3). الكوة سيد مزيج في أنابيب PCR واستخدام ماصة متعددة القنوات لإضافة النوكليوتيد جرنة من الخطوة 4، 2. تضمين عنصر تحكم لا إدراج استخدام 1 ميكروليتر من المياه.
   2. بما فيها الإنزيم بسمبي وليجاسي T4 الحمض النووي داخل نفس رد الفعل، والهضم تقييد المتزامنة وربط تتحقق (أياستنساخ البوابة الذهبية). باستخدام بروتوكول "بوابة البسيطة" التالية لهضم الناقل واضطر يدرج في الرد 1: الحفاظ على رد الفعل في 37 درجة مئوية ح 2، عند 50 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، عند 65 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة، عند 80 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة، وأخيراً ، أنه عقد في 4 درجات مئوية.
      1. من المذكرة، تحقق من أن النوكليوتيد لا تحتوي على مواقع بسمبي قبل استخدام هذا الأسلوب. إذا احتوت على جرناس التي هي يجري استنساخ بسمبي تقييد مواقع، أنهم سوف يهضم عند إضافة بسمبي. وهذا سوف يمنع المستخدم من الحصول على أي ترانسفورمانتس.
   3. بعد رد الفعل الأولى "بوابة بسيطة"، إضافة ميكروليتر 0.5 إضافية لأنزيم بسمبي لكل رد فعل ووضعها مرة أخرى في 55 درجة مئوية ح 1. بعد الهضم، عقد في رد فعل على 4 درجة مئوية أو تجميدها حتى على استعداد لتحويل. هذه الجولة الثانية من حضانة إنزيم التقييد يزيل أي عسر الهضم أو ريليجاتيد البرية من نوع pSB700 ناقلات العمود الفقري من خليط رد فعل حيث أن الناقلة الوحيدة التي تلقت إدراج اليغو تظل على حالها، وسوف تسفر عن ترانسفورمانتس.
   4. المضي قدما في تحويل (الخطوة رقم 9).
9. تحويل ميكروليتر 0.5 من خليط رد فعل إلى 8 ميكروليتر من المختصة كولاي [مثلاً، NEB DH5a (1-3 × 10⁹ زيمبابوي/ميكروغرام من الحمض النووي pUC19) أو NEB مستقرة 1-3 × 10⁹ زيمبابوي/ميكروغرام من الحمض النووي pUC19). البلازميدات لينتيفيرال، سيوفر خلايا مستقرة NEB أكثر اتساقا بلازميد الغلال.
   1. إزالة كولاي من مخزن في-80 درجة مئوية وذوبان الجليد من على الجليد لمدة 5-10 دقائق.
   2. إضافة 0.5 ميكروليتر من مزيج رد فعل إلى 8 ميكروليتر من المختصة كولاي والحفاظ على الخليط على الجليد لمدة 30 دقيقة.
   3. صدمة الحرارة المخلوط في 42 درجة مئوية ل 45 ثانية.
   4. ثم ضعه على الجليد لمدة 2 دقيقة.
   5. استعادة الثقافة في شاكر روتاري في 250 ميكروليتر من وسائل الإعلام في شركة نفط الجنوب ح 1 في 37 درجة مئوية ل NEB DH5a وعند 30 درجة مئوية لإسطبلات NEB.
   6. لوحة 80 ميكروليتر من الثقافة في مقاومة المضادات الحيوية مناسبة لوحة ليسوجيني مرق (رطل) واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية ل NEB DH5a وعند 30 درجة مئوية لإسطبلات NEB [مثلاً، pSB700 هو مطلي على رطل مع لوحات الأمبيسلّين (100 ميكروغرام/مل)] (الشكل 3).
10. التحقق من صحة تسلسل جرنة التعبير بلازميد: التحقق من تسلسل كل مستعمرة من سانغر التسلسل باستخدام التمهيدي 5 '-جاججككتاتتكككاتجاتكك-3' الذي يعبي في المروج U6 المنبع من اليغو جرنة إدراج.
    1. اختيار المستعمرات 2-3 كل رد فعل للتسلسل (الجدول 4).
       ملاحظة: يمكن تنفيذ العديد من موفري التسلسل الآن عرض الخدمات التي سانغر التسلسل مباشرة من المستعمرات البكتيرية، مما يقلل كثيرا من الوقت والتكاليف من خلال القضاء على الحاجة إلى تنقية والبلازميدات قبل التسلسل. وبدلاً من ذلك، يمكن استخدام مجموعة عزل بلازميد استرداد بلازميد الحمض النووي من المستنسخين البكتيرية الفردية. ثم يمكن تقديم والبلازميدات المنقي لتسلسلها. إذا كان يتم تنفيذ فعل ربط مجمعة، استخدم الجدول 4 كدليل لعدد المستعمرات التي ينبغي تحديدها والمقدمة للتسلسل.
    2. وبعد تأكيد تسلسل، عزل والبلازميدات التعبير جرنة.
       1. استخدام تلميح ماصة معقمة لتطعيم مستعمرة المنشود في ثقافة مل 5 رطل المتوسطة التي تحتوي على 100 ميكروغرام/مل من الأمبيسلّين لناقلات التعبير pSB700.
       2. تنمو الخلايا في حاضنة روتاري 100 لفة في الدقيقة في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها (30 درجة مئوية إذا كانت مستخدمة إسطبلات NEB).
       3. عزل بلازميد الحمض النووي من الثقافات استخدام عدة بلازميد الإعدادية، يتبع البروتوكول الخاص بالشركة المصنعة.
          ملاحظة: بينما الأساليب المذكورة أعلاه تمكين المستخدمين من إنشاء ناقلات المحتوية على جرنة واحد، هذا البروتوكول سيتم السماح للمستخدمين بإنشاء المتجهات التي تحتوي على جرناس 2، بعضها مدفوعا بالمروج الثالث بوليميراز الرنا الخاصة بهم.
11. لتصميم جرنة المزدوجة، استخدم ملف الإخراج من أدوات التصميم سجرنا المبينة أعلاه (الخطوات 1، 1، 1-4) وحدد أدلة 2 من الفائدة.
    1. للتنشيط أو القمع، حدد أزواج من الأدلة التي هي على الأقل 30 nt أربا.
    2. جرناس المستخدمة لقطع، تحديد الأدلة التي تستهدف 2 exons مختلفة داخل الجينات.
12. للإرشادات أدناه، أن يعين جرنة الأول في الصفيف، جرنة وجرنة الثاني في صفيف جرنة-ب، لإنشاء تعديل تسلسل اليغنوكليوتيد جرنة المزدوجة.
    ملاحظة: سوف يطلق اليغو المستخدمة لإنشاء جرنة من اتحاد كرة القدم، واليغو العكسية تستخدم لإدخال جرنة-ب وسوف يشار إليها باسم الميزانية العادية. الأسلوب الاستنساخ أدناه يقوم تلقائياً بإلحاق ز المبادر في نهاية 5 ' كل من جرناس.
    1. إنشاء اليغو fA المناسبة كما يلي.
       ملاحظة: تشكل النيوكليوتيدات 20 تتألف من جرنة استهداف تسلسل لإرادة جرنة-أ تسلسل فا الأولى التي ستبني الخطوات التالية (مثلاً، بروتوسباسير-أجججكتاكاككاكتكاتج).
       1. إلحاق تتتكجتكتكتكاككج إلى النهاية 5 ' لكرة القدم (مثلاً، في التسلسل تتتكجتكتكتكاككجاجججكتاكاككاكتكاتج).
       2. إلحاق جتتتاجاجكتاتجكتجاااجكا إلى النهاية 3 ' لكرة القدم (مثلاً، في التسلسل تتتكجتكتكتكاككجاجججكتاكاككاكتكاتججتتتاجاجكتاتجكتجاااجكا). هذا هو الإصدار النهائي من اليغو اتحاد كرة القدم التي سيتم طلبها.
    2. إنشاء اليغو rB اللازمة كما يلي.
       ملاحظة: سوف تشكل النيوكليوتيدات 20 تتألف من تسلسل استهداف جرنة جرنة-ب التسلسل الميزانية العادية الأولى التي ستبني الخطوات التالية (مثلاً، من جتككككتككاككككاكاجتج تسلسل البداية).
       1. أن تكمل عكس الميزانية العادية = (ريفكوم) م ع (مثلاً، كاكتجتجججتجاجججاك).
       2. إلحاق تتتكجتكتكتااك إلى نهاية 5 ' (ريفكوم) الميزانية العادية (على سبيل المثال., تتتكجتكتكتااككاكتجتجججتجاجججاك).
       3. إلحاق كجتجاكككاجكجكجكاكاج إلى نهاية 3 ' (ريفكوم) م ع (مثلاً، تتتكجتكتكتااككاكتجتجججتجاجججاككجتجاكككاجكجكجكاكاج). هذا هو الإصدار النهائي من اليغو الميزانية العادية التي سيتم طلبها.
          ملاحظة: يمكن استخدام الصيغ التالية مع برنامج جداول البيانات المشتركة لتحرير تلقائياً في تسلسل اليغو: = CONCATENATE("TTTTCGTCTCTCACCG",(A2)، "جتتتاجاجكتاتجكتجاااجكا")، حيث A2 هي الخلية التي تحتوي على تسلسل اتحاد كرة القدم، و = CONCATENATE("TTTTCGTCTCTAAAC",(B2)، "كجتجاكككاجكجكجكاكاج")، حيث B2 الخلية التي تحتوي على تسلسل الميزانية العادية (ريفكوم).
13. تأمر النوكليوتيد من مورد توليف للاختيار. لا تعديلات إضافية مطلوبة.
14. استخدام بلازميد استعداد الحمض النووي لإجراء PCR مع الإشعال اتحاد كرة القدم والممولة من الميزانية العادية. هذا وسوف نعلق على حد سواء إلى الأمام وجرناس عكس إلى [بكر] جزء المتولدة من هذا بلازميد وسوف تسمح لكل منهما أن يعبر من تلقاء المروج (المروجين U6 و 7SK – المروجين مختلفة تستخدم في هذا التصميم لمنع جزئ فيروسي).
    1. استخدام "بروتوكول بكر فوسيون GC الخاصة" لإنشاء الجزء المطلوب: إبقاء الخليط عند 98 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة (المرحلة 1)، عند 98 درجة مئوية لمدة 15 ثانية، في 53 درجة مئوية لمدة 15 s، 65 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة، وإلى 72 درجة مئوية لمدة 4 دقائق (30 دورة) ، ثم اضغط عليه عند 4 درجة مئوية (الجدول 5).
    2. تشغيل المنتج بكر على 1% [اغروس] هلام والتحقق من أن الفرقة 1 ينظر في ~ 490 شركة بريتيش بتروليوم (الشكل 2).
    3. قص واستخراج هذا المنتج PCR باستخدام مجموعة أدوات استخراج هلام الاختيار. الوت الحمض النووي في 15 ميكروليتر من المخزن المؤقت للشركة المصرية للاتصالات (10 ملم تريس، درجة الحموضة 7.5؛ 10 مم تريس، pH 8.0) أو ماء مقطر.
    4. قياس تركيز المنتج المستخرج جنبا إلى جنب مع ناقل pSB700 مع جهاز المطياف الضوئي لحساب molarity الحمض النووي. تطبيع المنتج بكر ومتجه إلى تركيز 40 فيمتوموليس/ميكروليتر.
       ملاحظة: تتوفر العديد من المواقع للمساعدة في حساب molarity حل الحمض النووي معين استناداً إلى طول الحمض النووي وتركيزها في الحل (مثلاً، بروميجا: http://www.promega.com/a/apps/biomath/index.html?calc=ugpmols). آلة حاسبة تستخدم الصيغة:
       
       وهنا، N هو طول تسلسل النوكليوتيدات.
15. إعداد تقييد متزامنة الهضم ربط فعل واستخدام بروتوكول الموضحة في الخطوات 8-8.4 إلى استنساخ جزء بكر إلى ناقل pSB700.
    1. بدلاً من إضافة 1 ميكروليتر من حل التمهيدي إلى رد فعل، إضافة 1 ميكروليتر من 40 فمولي/ميكروليتر من المنتج PCR. وبالإضافة إلى ذلك، استخدم ميكروليتر 1 ناقل pSB700 بتركيز 40 فمولي/ميكروليتر.
       ملاحظة: نسب المولى المساواة تؤدي إلى نتائج متسقة، على الرغم من أن حتى في الحالات التي لا تستخدم فيها النسب الدقيقة، ويمكن الحصول على المستعمرات.
16. عند الانتهاء من عملية رد فعل البوابة الذهبية (الخطوات 8-8.4)، المضي قدما بالتحول وتسلسل التحقق (الخطوات من 9-10.2.3).

النتائج

الأساليب المذكورة في هذا البروتوكول بإنشاء أما ناقلات التعبير جرنة فردي أو زوجي. جرنة واحد معربا عن ناقلات يمكن إنشاؤها بواسطة أما بريديجيستينج ناقلات العمود الفقري (الشكل 1) تليها ليجاتينج أنه في سلسلة من النوكليوتيد قصيرة أو استخدام البوابة الذهبية الاستنساخ لهضم ناقلات العمود الفقري في وقت واحد، واضطر في سلسلة قصيرة النوكليوتيد في رد فعل واحد. وقدمت أيضا هو أسلوب إنتاج النواقل التي تحتوي على جرناس 2، بعضها يقودها المروج المستقلة الخاصة به، باستنساخ جزء PCR مخصص (الشكل 2).

الاستنساخ الناجح لأي من البروتوكولات المحددة سيؤدي إلى ظهور مستعمرات أكثر بشكل ملحوظ للتحولات مع الحمض النووي إدراج المناسبة من على لوحة التحكم لا في إدراج (الشكل 3).

رقم 1: هضم ناقل التعبير جرنة pSB700. ويستخدم 1% [اغروس] هلام. لين 1: pSB700 غير مقطوع. لين 2: قطع pSB700 مع بسمبي.

رقم 2: إقران جرنة PCR. ويستخدم 1% [اغروس] هلام. لين 1: دليل إقران بكر جزء من ~ 490 بي بي.

الشكل 3: استنساخ ناجحة والتحول من بلازميد جرنة. ترك الفريق يظهر رطل، ونجحت في تحويل لوحة الأمبيسلّين مع المستعمرات. اللوحة اليسرى تظهر لوحة تحكم لا في إدراج عرض لا المستعمرات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

ناقل التعبير دليل pSB700	1-5 ميكروغرام
المخزن المؤقت NEB 3.1	4 ميكروليتر
بسمبي	1 ميكروليتر
الماء المقطر	ما يصل إلى 40 ميكروليتر
الحجم الإجمالي	40 ميكروليتر

الجدول 1: هضم تقييد ناقل التعبير جرنة pSB700 مع بسمبي.

جرنة ملدن أوليجوس (رد فعل أما بمفرده أو مجمعة)	1 ميكروليتر
ناقل التعبير دليل هضمها بسمبي pSB700	1 ميكروليتر (~ 100-250 نانوغرام)
10 × T4 الحمض النووي ليجاسى رد فعل المخزن المؤقت	2 ميكروليتر (1 × التركيز النهائي)
T4 ليجاسى الحمض النووي	1 ميكروليتر (120 وحدة)
الماء المقطر	15 ميكروليتر
الحجم الإجمالي	20 ميكروليتر

جدول 2: ربط فعل النوكليوتيد جرنا إلى ناقل تعبير جرنا pSB700 مهضوم.

كاشف	وحدة التخزين (س 1)
ح2س	ميكروليتر 6
ليجاسى T4	ميكروليتر 0.5
ATP	1 ميكروليتر
بسمبي	ميكروليتر 0.5
المخزن المؤقت NEB 3.1	1 ميكروليتر
ناقلات (مثلاً، pSB700) (فمول 40)	1 μlL
إدراج-إلى الأمام وعكس أوليجوس أو بلغة PCR لدليل المزدوجة (40fmol)	1 ميكروليتر (0.5 ميكروليتر إلى الأمام وعكس 0.5 ميكروليتر)

جدول 3: خطوة واحدة بسمبي جرنة وتقييد عملية ربط رد فعل مزيج.

لدليل 1	المستعمرات تسلسل 3
للحصول على أدلة 2	تسلسل المستعمرات 5-10
للحصول على أدلة 3	تسلسل المستعمرات 10-15
للحصول على أدلة 4	تسلسل المستعمرات 15-20

الجدول 4: أوصى عدد المستعمرات إلى تسلسل للمجمعة جرنة استنساخ ردود الفعل.

مكون بكر	رد 50 ميليلتر
التمهيدي إلى الأمام 10 ميكرومتر	ميليلتر 2.5
10 ميكرون عكس التمهيدي	ميليلتر 2.5
5 x Phusion التردد أو المخزن المؤقت GC	10 ميليلتر
دنتبس 10 ملم	1 ميليلتر
قالب الحمض النووي	100 نانوغرام
بوليميراز الدنا فوسيون	0.5 ميليلتر
المياه خالية من نوكلاس	ما يصل إلى 50 ميليلتر

جدول 5: مزيج PCR جرنة المزدوجة.

Discussion

بذلت عددا من التعديلات الموفرة للوقت والتكلفة لبناء ناقلات التعبير جرنة. ويرد بروتوكول التقييد وربط خطوة واحدة فضلا عن أسلوب بناء ناقلات التعبير جرنة المزدوجة. يتحقق التعبير جرنا المزدوجة من خلال تضخيم PCR استخدام النوكليوتيد التي تحتوي على تسلسل هدف جرنا إلى الأمام (n20) وتكمل هدفا آخر (n20) عكس. هذا ثم يدخل مروج رنا بول الثالث ثانوي (7SK) فضلا عن ذيل سجرنا تقليديا معربا عن جرنة واحدة التعبير والبلازميدات.

سوف يضمن تصميم دقيق اليغنوكليوتيد بكر ناجحة لبناء جرنة المزدوجة، فضلا عن ربط نهاية لزجة. وسيكفل بعد تقييد خطوة واحدة وربط الرد، إضافة المزيد من بسمبي يتم قطع جميع ناقلات التعبير غير معدلة في رد فعل. وهذا سيقلص الخلفية عند التحويل. استخدام المختصة مستقرة NEB كولاي ونمو عند 30 درجة مئوية سيزيد غلة تحولاً ناجحاً.

وتشمل مزايا هذا الأسلوب قد أكثر الممارسات شيوعاً تبسيط عملية اليغنوكليوتيد الصلب، قيداً خطوة واحدة من ناقلات التعبير جرنا وربط النوكليوتيد، والقدرة على الاستفادة من التقليدية ناقلات التعبير جرنة واحدة للتعبير عن أدلة المزدوجة. بينما وصف البروتوكول هنا يركز على مجموعة من الثدييات ناقلات، الاستراتيجية العامة من البلاستيك ولا ينطبق على أي كائن حي، شريطة أن يتوفر ناقل جرنة المناسبة. وعموما، البروتوكول وصف يوفر الوقت والتكاليف.

ومع ذلك، تجدر الإشارة إلى أن الإجراء المبين لشراء النوكليوتيد الفردي غير مقياس جيد لجيل المكتبات التي تحتوي على آلاف جرناس. لهذه الأغراض، يوصي بإيجاد مصادر بديلة لتوليف اليغنوكليوتيد مثل اليغو رقاقة التوليف.

أنه مفيد لتضمين عنصر تحكم لا إدراج عند استنساخ جرناس. رد الفعل هذا يمكن بسهولة إعداد جنبا إلى جنب مع ردود فعل الفائدة، ويمكن استخدامها لتحديد ما إذا كان هضم غير مكتملة من انطلاق الموجه قد ساهم في المستعمرات ولاحظ في نهاية الإجراء. وعلاوة على ذلك، وإذا لم يقم أحد البروتوكولات الاستنساخ أعلاه سبب غير كامل الهضم ناقلات العمود الفقري أو ربط ضعف الكفاءة، نقترح محاولة البديل استنساخ الطريقة التي ذكرناها.

عند استخدام البوابة الذهبية استنساخ هضم الناقل واضطر في النوكليوتيد الصغيرة داخل فعل واحد في الوقت نفسه، من المهم التحقق من أن جرنا التي هي يجري استنساخ إلى الناقل ليس لديه موقع بسمبي داخله، كما سيؤدي ذلك إلى t جرنة أنه يجري قطع وغياب المستعمرات على التحول.

جرنة استنساخ استراتيجية قد اوجزنا تمكن جيل سريعة وفعالة من حيث التكلفة من جرناس في ~ 10 دولار أمريكي للدليل، مع الجزء الأكبر تكاليف قادمة من التوليف اليغنوكليوتيد وتسلسل عملية التحقق. بينما الأسلوب المبين صمم للسماح للمستخدمين بإنشاء جرناس للاستخدام مع SpCas9، البروتوكول يمكن تكييفها للاستخدام مع أورثولوجويس Cas9 أو اندونوكليسيس الموجهة بالحمض النووي الريبي الأخرى مثل Cpf1 أو C2C2، مع تعديلات طفيفة على ناقلات العمود الفقري بسهولة استفحال اليغنوكليوتيد تسلسل^16،17.

ستوفر البروتوكول المشار إليها أعلاه جرنة التحقق من تسلسل والبلازميدات التعبير في 3 د (بدءاً من النوكليوتيد مصممة بشكل مناسب)، وأسرع بكثير من الطرق الحالية. ويشمل ذلك تصميم جرنة ح 1 (الخطوات 1-2، 3)، وتمييع وقاسمه النوكليوتيد 10 دقيقة (الخطوات من 3-5، 1)، والهضم وتنقية لناقل التعبير جرنة pSB700 ح 2 (الخطوات 6-6.4)، استنساخ النوكليوتيد جرنة إلى بريدي pSB700 جيستيد جرنة ناقل التعبير بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة (الخطوات 7-7.3)، وربط القيد بسمبي خطوة واحدة من 3 ساعات و 40 دقيقة (الخطوات 8-8.4)، تحول ح 16 (الخطوات 9-9.6)، والتحقق من تسلسل بلازميد التعبير جرنة 24 ساعة (مع المدة تبعاً لتوافر التسلسل سانغر والسرعة عقب تقديم هذه المستعمرة البكتيرية؛ الخطوة 10). تصميم جرنة المزدوجة وتعديل تسلسل يأخذ ح 1 (الخطوات 11-13). جرنة زوجي بكر يأخذ ح 3.5 (الخطوات 14-14.4). استنساخ جزء بكر إلى ناقل pSB700 يأخذ 3 ساعات و 40 دقيقة (الخطوة 15-16).

المسائل الأكثر احتمالاً التي قد تواجه هذا البروتوكول تتعلق بعدم الكفاءة في الجمعية البوابة الذهبية والتحول. تضمين عنصر تحكم لا إدراج أثناء الجمعية العامة البوابة الذهبية لتصور كفاءة الجمعية العامة. أثناء التحويل، وستوفر مراقبة إيجابية puc19 عنصر تحكم كفاءة تحويل. ينبغي أن تستخدم والبلازميدات متوافق مع لينتيفيرال مستقرة NEB كولاي وكثيراً ما تتطلب حتى > 16 ساعة في 30 درجة مئوية إلى العائد المستعمرات مرئية.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
BsmBI	New England Biolabs	R0580L
T4 DNA ligase	Enzymatic/New England Biolabs	L6030-LC-L/M0202S
Buffer 3.1	New England Biolabs	B7203S
Adenosine 5'-Triphosphate (ATP)	New England Biolabs	P0756S
QIAprep spin miniprep kit	Qiagen	27104
Chemically competent E. coli	New England Biolabs	C3019l, C2987l, or C3040H
Standard microcentrifuge tubes, 1.5 mL	Eppendorf	0030 125.150
Axygen 8-Strip PCR tubes	Fischer Scientific	14-222-250
Thermocycler with programmable temperature-stepping control	BioRad,	1851148
UV spectrophotometer (NanoDrop 2000c)	Thermo Scientific
pSB700 plasmid	Addgene	#64046
NEB Stable Competent E. coli (High Efficiency)	New England Biolabs	c3040
Lysogeny broth (LB)
Ampicillin
TE buffer (1 mM EDTA, 10 mM Tris-Cl, pH 7.5)
pSN007 plasmid	Addgene	102440