تحقيق قوة مباشرة لقياس التكامل الميكانيكية بين النواة وسيتوسكيليتون

Summary

في هذا البروتوكول، يصف لنا طريقة ميكروبيبيتي لمباشرة تطبيق قوة الخاضعة للرقابة على النواة في خلية حية. ويسمح هذا الفحص الاستجواب للخصائص الميكانيكية النووية في الخلية الحية، وملتصقة.

Abstract

تحديد الخواص الميكانيكية للنواة ردها إلى القوات الميكانيكية المتولدة في الخلايا. نظراً لأن النواة جزيئيا المستمر مع سيتوسكيليتون، يلزم أساليب التحقيق سلوكها الميكانيكي في الخلايا ملتصقة. وهنا نناقش المسبار القوة المباشرة (منسقي) كأداة لتطبيق القوة مباشرة إلى النواة في خلية حية ملتصقة. أننا نعلق ميكروبيبيتي ضيقة على السطح النووي مع الشفط. وتترجم في ميكروبيبيتي بعيداً عن النواة، الذي يسبب النواة تشوه وترجمة. عند استعادة قوة مساوية لقوة الشفط، النواة يفصل ويرتاح الاستيكالي. لأن الضغط شفط هو يعرف على وجه التحديد، المعروف قوة على السطح النووي. هذا الأسلوب وكشفت أن قوات نانو الحجم كافية لتشوه وترجمة النواة في خلايا ملتصقة، وحددت العناصر سيتوسكيليتال التي تمكن النواة مقاومة القوات. يمكن استخدامها منسقي تشريح مساهمات المكونات الخلوية والنووية للخصائص الميكانيكية النووية في الخلايا الحية.

Introduction

الأمراض مثل السرطان تنطوي على تعديلات على الشكل النووي وهيكل^1،2، التي تقترن عادة ب 'تليين'^3،نواة⁴. المقاومة النووية إلى تشوه الميكانيكية اتسمت عموما بتطبيق قوة على نواة معزولة⁵.

النواة في الخلايا متصل جزيئيا cytoskeleton "رابط نوكليوسكيليتون" وسيتوسكيليتون (اللغوي) مجمع^6،7،،من⁸⁹. نتيجة لذلك تم دمج النواة ميكانيكيا مع سيتوسكيليتون، ومن خلال خلية التحتية الالتصاقات، المصفوفة خارج الخلية. ميكانيكيا السبر النواة داخل الخلايا ملتصقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة هذا التكامل الميكانيكية. وتشمل أساليب التلاعب بالنوى في الخلايا الحية ميكروبيبيتي تطلع^10،11، والقوة الذرية مجهرية^12،،من¹³¹⁴. ونحن مؤخرا وصف قوة مباشرة تحقيق (منسقي) الذي ينطبق على القوات الميكانيكية مباشرة على النواة في خلية ملتصقة معيشة¹⁵.

هنا، فإننا مخطط الإجراء المتعلق باستخدام نظام microinjection التي تتوفر عادة في مرافق الفحص المجهري لتطبيق قوة ميكانيكية نانو نطاق معروفة، مباشرة إلى النواة في زنزانة ملتصقة. فيمتوتيب (القطر ميكروبيبيتي نصيحة 0.5 ميكرومتر) شنت ومتصلا بالنظام microinjection بأنبوب. تلميح، المتمركزة بزاوية 45 درجة بالنسبة إلى سطح الطبق الثقافة، خفضت حتى المتاخمة لسطح النووية. ثم قطع الأنبوب وفتحه في الغلاف الجوي، مما يخلق ضغط شفط سلبي على السطح النووي والأختام نصيحة ميكروبيبيتي ضد السطح النووية. من خلال ترجمة طرف ميكروبيبيتي، النواة مشوهاً وفي نهاية المطاف (تبعاً لحجم القوة المطبقة)، بعيدة عن ميكروبيبيتي. هذه المفرزة عند تساوي القوى (مقاومة) استعادة، تمارسه خلية ونواة قوة الشفط تطبقها ميكروبيبيتي. يمكن إجراء التحليل بقياس تشريد النواة، سلالة طول (المعادلة 1)، أو سلالة المنطقة (الشكل 1A).

Protocol

1. إعداد الخلايا للتصوير

ملاحظة: يمكن استخدام المسبار القوة المباشرة (منسقي) لأي نوع من الخلايا ملتصقة. هنا، والمعاهد الوطنية للصحة 3T3 الماوس الليفية تستخدم كخط الخلية النموذجية لهذا البروتوكول.

1. الثقافة المعاهد الوطنية للصحة 3T3 تنتجها الخلايا الليفية الخلايا في المتوسطة (دميم "تعديل النسر" دولبيكو) وتستكمل مع المصل البقري المانحة 10% و 1% ستربتوميسين البنسلين في أسفل زجاج 35 مم طبق حتى كونفلوينسي المطلوب. الحفاظ على الخلايا في 37 درجة مئوية و 5% CO₂.
   1. من المؤكد أن معطف جميع الأطباق أسفل الزجاج 35 ملم مع 5 ميكروغرام/مل فيبرونيكتين (أو بروتين ECM مماثلة)، قبل البذر الخلايا 3T3 المعاهد الوطنية للصحة للتصوير.
      ملاحظة: الخلايا يجب أن يكون كاملا تنتشر وملتصقة على الطبق للتجربة. لا توجد أي قيود من حيث كونفلوينسي لمنسقي أسلوب للعمل.
2. فورا قبل التجربة، غسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني تليها يغسل واحدة مع متوسط النمو الكامل.
3. أضف 3 مل متوسط النمو الكامل للطبق أسفل الزجاج.

2-الفحص المجهري، والحصول على الصور

ملاحظة: المقلوب fluorescence المجهر (أو ما يعادلها) مع ميكرومانيبولاتور مثبتة على الذراع الجانب، وفقا لتوصيات الشركة المصنعة. كما يمكن تجهيزه المجهر دائرة البيئة للإبقاء على درجة حرارة 37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون₂ مستوى 5%. مطلوب أيضا ميكرومانيبولاتور وميكروينجيكتور تعلق بالمجهر. زيت غمر x 40/1.3 60 x أو NA/1.49 NA (أو ما يعادل أهداف) ينصح للتجارب. وينبغي أن شنت المجهر على طاولة عزل الاهتزازات.

الشكل 1 . التشوه النووية وتركيز المجهر
أ أقصى تشوه النووية وتخفيف التشوه النووية. قبل حساب الحد الأقصى تشوه النووية، كانت أولاً تزامن حواف الأشكال النووية مرة أخرى لتصحيح لترجمة نواة مشوه. كان مضافين على شكل النواة في هذه لحظة مفرزة نصيحة ميكروبيبيتي على شكل النووية الأولى قبل أن تنسحب. وتم قياس الفرق بين الشكلين في المنطقة ك Δ₁. وعرف أنه Δأ₁ مقسوماً على المجال النووي الأصلي تشوه النووية الحد الأقصى. وبالمثل، معلمة ثانية، Δأ₂، يمكن تعريف التي تتراكب الشكل النهائي ثابت الدولة النووية بعد مفرزة ميكروبيبيتي على الشكل النووي الأصلي. باء-التركيز الخلية عند بالطائرة، ثم قم بنقل المستوى البؤري يصل إلى الطائرة ب للبحث عن هذه المعلومة ميكروبيبيتي. أثناء التصوير، وقد ترجم في ميكروبيبيتي إلى اليمين (باتجاه السهم البرتقالي). وقد تم تعديل هذا الرقم من نيلام et al. ¹⁵- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

1. قم بتشغيل ميكروينجيكتور في البروتوكول الخاص بالشركة المصنعة.
2. استخدام قطارة زيت غمر، تطبيق قطره واحدة من زيت الغمر أعلى العدسة الهدف.
3. المشبك الطبق محكم في حامل الطبق وتحميل صاحب الطبق على خشبة المسرح.
   ملاحظة: يجب المحافظة على الخلايا في 37 درجة مئوية و 5% CO₂ طوال التجربة.
4. ضبط ارتفاع الهدف لإحضار الخلايا إلى التركيز (بالطائرة، الشكل 1B).
5. نقل مرحلة مجهر للعثور على خلية للفائدة.
6. قم بتدوير عصا التحكم في ميكرومانيبولاتور لنقل صاحب بيبيت إلى المرتبة الأولى. تحميل ميكروبيبيتي نصيحة قطرها 0.5 ميكرومتر على حامل بيبيت.
   1. لتجنب التصاق الخلية إلى ميكروبيبيتي، قبل علاج نصيحة ميكروبيبيتي مع 0.3 ملغ/مل الحل PLL-ز-شماعة ح 1 في درجة حرارة الغرفة. اختبار الالتصاق بلمس ميكروبيبيتي إلى النواة دون أي ضغط الشفط ومن ثم ترجمة ميكروبيبيتي بعيداً عن النواة. ويمكن تمييز نظراً لعدم التصاق من انعدام تام لتشوه النووية والترجمة.
      ملاحظة: الرجاء اتباع اقتراحات صنعها لفتح الحزمة.
7. رفع المستوى البؤري موضوعي أعلاه بالطائرة والجزء العلوي من الخلية إلى "ب الطائرة" عن طريق ضبط عنصر التحكم غرامة (الشكل 1B، راجع الخطوة 2، 4).
8. تعيين ميكرومانيبولاتور للتحكم ردئ . جلب ميكروبيبيتي وصولاً إلى "الطائرة ب" ببطء عن طريق لمشاهدة صورة ظلية ميكروبيبيتي، حتى ميكروبيبيتي يأتي تماما في التركيز.
9. مجرد نصيحة ميكروبيبيتي في التركيز، تعيين في ميكرومانيبولاتور للمراقبة الدقيقة .
10. أدنى الهدف للطائرة الاستوائي للخلية (ألف طائرة، الشكل 1B) وأقل ميكروبيبيتي إلى حوالي 15 ميكرون فوق الطائرة A (الشكل 1B، ميكروبيبيتي متقطع).
11. تعيين الضغط التعويض (ف_ج) في ميكروينجيكتور للضغط المطلوب؛ انتظر عدة ثوان للضغط من أجل تحقيق الاستقرار.
    ملاحظة: هذه النقطة مجموعة الضغط الأمثل يعتمد على نوع الخلية والأهداف المحددة لهذه التجربة. لمعظم الحالات، سيكون 300 hPa نقطة انطلاق جيدة.
12. ضمان أن لا انسداد في ميكروبيبيتي باستخدام الإعداد نظيفة على لوحة ميكرومانيبولاتور والتحقق للتأكد من ظهور فقاعات الهواء من طرف ميكروبيبيتي.
13. إدراج التلميح في الخلية بخفض تدريجيا في ميكروبيبيتي حتى التلميح طفيفة لمس السطح النووية.
    ملاحظة: عند تخفيض ميكروبيبيتي، سوف تصبح صورة ظلية طرف ميكروبيبيتي واضح أنها تأتي إلى التركيز. قبل ميكروبيبيتي تلامس النواة، زيادة التركيز الموضوعي ومحاذاة الحافة ميكروبيبيتي مع نواة (إحداثيات س ص نفس، أعلى z-طائرة). إرجاع التركيز إلى الطائرة الاستوائية من النواة (ألف طائرة، الشكل 1B) وتدريجيا أقل نصيحة ميكروبيبيتي.
14. إنشاء ختم بين نصيحة ميكروبيبيتي والغشاء النووي عن طريق قطع أنابيب الإمداد بضغط من النظام microinjection، مما يفتح نهاية الأنبوب ميكروبيبيتي في الغلاف الجوي. هذه الخطوة بإنشاء ضغط سلبي يساوي ف_ج على السطح النووي.
15. الحصول على الصور مع برنامج جمع الصور مجاهر. إقامة أفي-اقتناء (فيديو) أو nd-اقتناء (صور) في برنامج جمع الصور.
    ملاحظة: لتصوير أي الحصول على البرمجيات، قم بإعداد تصوير الفيديو في الوقت الحقيقي أو امتلاك الوقت الفاصل بين الصورة مع فاصل زمني قصير.
16. تبديل إلى فلوري المقابلة التصوير قناة (أي التجارة والنقل، طلب تقديم العروض، إلخ) والبدء في التصوير.
17. ترجمة نصيحة ميكروبيبيتي بعيداً عن جسم الخلية (بالحق، الشكل 1B) حتى ينفصل النواة من ميكروبيبيتي.
    ملاحظة: سحب الحافة على طول x-الاتجاه الإيجابي (إلى اليمين في طريقة العرض للحقل). معدل سحب يمكن برمجتها والتحكم بجهاز الكمبيوتر أو يمكن نقل مقبض التحكم يدوياً. أننا لم نجد أي علاقة متبادلة بين سحب معدل وتشوه النووية¹⁵ تشير إلى استجابة مرنة أساسا إلى القوة.

3-بيانات التحليل

1. القيام بتحليل الصورة مع أي برنامج معالجة الصور الأساسية المتاحة. يمكن قياس مدى تشوه النووية سلالة طول (Ɛ) أو سلالة المنطقة (الشكل 1A). التحديد الكمي لسلالة طول استخدام المعادلة 1، حيث L و L₀ تمثل أطوال النواة في تشوه الحد الأقصى والموقف المبدئي، على التوالي.
   (المعادلة 1)

النتائج

ويبين الشكل 2 ألف إرغام المعاهد الوطنية للصحة 3T3 الماوس تنتجها الخلايا الليفية نواة. كما تتم ترجمة نصيحة ميكروبيبيتي إلى اليمين، النواة تبعثر ويفصل في نهاية المطاف من طرف ميكروبيبيتي. ويعتبر سلالة طول نواة يزيد مع زيادة قوة الشفط (الشكل 2). ...

Discussion

قياس تكامل الميكانيكية نواة مع سيتوسكيليتون تحد للأساليب الأكثر حداثة، مثل ميكروبيبيتي تطلع¹⁶، لأنها تتطلب أما نواة معزولة (حيث النواة decoupled من cytoskeleton) أو النواة في الخلايا مع وقف التنفيذ (حيث توجد القوات خارج الخلية، مثل قوي الجر،). طبق النواة القوة عن طريق تطبيق سلالة بياكسي?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
FluoroDish	WPI	FD35
SYTO 59	ThermoFisher Scientific	S11341
Femtotips	Eppendorf	930000043
InjectMan NI2	Eppendorf	NA	discontinued, current equivalent model: InjectMan 4
FemtoJet	Eppendorf	NA	Current model FemtoJet 4i
Plan Fluor oil immersion 40x	Nikon	NA
Apo TIRF oil immersion 60x	Nikon	NA
Donor Bovine Serum (DBS)	ThermoFisher Scientific	16030074	NIH 3T3 serum
Dulbecco's Modification of Eagle's (DMEM)	Mediatech cellgro	MT10013CVRF	NIH 3T3 medium
Penicillin-Streptomycin	Mediatech	MT30004CIRF	NIH 3T3 medium supplement
Immersion Oil Type LDF Non-Fluorescing	Nikon	77007	Immersion oil for objective lens