Cre-لوكس الفائق تنشيط الإنزيم الانصهار الغشاء الفيروسي التعرف على مثبطات للانصهار الغشاء الفيروسي فيروس نقص المناعة البشرية-1

Summary

يصف لنا تحليل يستند إلى الخلية تقرير بشأن فيروس نقص المناعة البشرية-1 الانصهار عبر التعبير عن البروتين الفلورية الخضراء القابلة للكشف المجهري التدفق الخلوي أو الأسفار. ويمكن استخدامه لاختبار مثبطات دخول الفيروسية (على وجه التحديد في الخطوة الانصهار) في نظم خالية من خلية وخلية إلى الإصابة.

Abstract

هذا التحليل يهدف إلى تحديداً تقرير بشأن فيروس نقص المناعة البشرية-1 الانصهار عبر التعبير عن البروتين الفلورية الخضراء (التجارة والنقل) يمكن كشفها بالفحص المجهري التدفق الخلوي أو الأسفار. فيروس نقص المناعة البشرية-1 مراسل فيروس (فيروس نقص المناعة البشرية-1 هفوة-الجماعات) تم إنشاؤه بواسطة إدراج recombinase لجنة المساواة العرقية في جينوم فيروس نقص المناعة البشرية-1 بين المصفوفة وبروتينات قفيصه من بوليبروتين اسكت. هذه النتائج في عبوة من ريكومبيناسي لجنة المساواة العرقية إلى جزيئات الفيروس، الذي صدر بعد ذلك في خلية مستهدفة خط ثابت معربا عن لجنة المساواة العرقية تنشيط recombinase أحمر نيون بروتين (RFP) إلى كاسيت التبديل بروتينات فلورية خضراء. في الدولة القاعدية، ويعرب هذا الكاسيت عن طلب تقديم العروض فقط. عقب تسليم recombinase لجنة المساواة العرقية إلى الخلية الهدف، طلب تقديم العروض، يحف به مواقع لوكسب، المكوس، أسفر عن تعبير بروتينات فلورية خضراء. هذا التحليل يمكن استخدامها لاختبار أي مثبطات دخول الفيروسية (على وجه التحديد في الخطوة الانصهار) في نظم خالية من خلية وخلية إلى الإصابة، وقد استخدمت لتحديد فئة من الخصوم مستقبلات بورينيرجيك كمثبطات جديدة لفيروس نقص المناعة البشرية-1 الغشاء الفيروسي الانصهار.

Introduction

ودفعت الحاجة إلى العلاج المضاد للفيروسات الرجعية رواية تطوير شاشات الفائق لمثبطات دخول فيروس نقص المناعة البشرية-1. هو وضع مقايسة مراسل هفوة-الجماعات تحديد مثبطات دخول الفيروسية في الخطوة الانصهار في نظام خلية إلى إصابة بقياس الانصهار الغشاء الفيروسي مع غشاء الخلية المضيفة¹على وجه التحديد. تم وضع فحص على الشاشة لمثبطات الرواية التي تصرف على وجه التحديد في المراحل المبكرة من الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية-1 حتى نقطة الانصهار الغشاء الفيروسي. تحدي واحد لقياس عدوى خلية خلية أن العدوى الأولية يحتوي على خلايا المانحين المصابة والخلايا الهدف إينينفيكتيد، ذلك قياس الإصابات الجديدة من الصعب أن تميز من خلايا الإدخال. النظام المثالي ينطوي على علامة مغايرة جينات التي يمكن أن يتسبب قبل الشروع في عدوى الخلية المستهدفة وهي غير موجودة في الخلية المانحة. محتويات فيروسية شعبية خلط المقايسة استناداً إلى انصهار إنزيم بروتين فيروسي، BlaM-Vpr، يمكن أن تكون فعالة، ولكن القيود لارتفاع الإنتاجية، فحص الخلايا². ويشمل هذا التحليل جين مراسل بيتا-lactamase (BlaM) التي تنصهر فيها فيروس نقص المناعة البشرية-1 Vpr، في فيريونس وتعبئتها، وتسليمها إلى خلايا الهدف عند الانصهار الغشاء الفيروسي. الركيزة CCF2-صباحا تم تحميله إلى السيتوبلازم للخلايا المستهدفة ويخضع لتحول الأسفار عند الانقسام. الركيزة صباحا CCF2 مكلفة ويمكن أن تكون باهظة بالنسبة للشاشات الفائق. لتمييز الخلايا المستهدفة والجهات المانحة، من الضروري أن صبغ-تسمية السكان المستهدفين. وأخيراً، البروتوكول يتطلب العديد من الخطوات الغسيل والحضانة التي يمكن أن تكون مرهقة ومكلفة عند اختبار عدد كبير من المركبات.

وقد وضعت المقايسة هفوة-الجماعات كحل لهذه المسائل، لتطوير الفائق الفرز لمثبطات للانصهار في خلية إلى انتقال. لا يتطلب هذا النظام الركازة تحميلها إلى الخلايا. يمكن أن تستخدم أيضا لدراسات الخلية الحرة المقايسة وقابل للتكيف إلى دراسات أخرى الانصهار الفيروسية باستخدام جزيئات الفيروس فيروس نقص المناعة البشرية-1 هفوة-الجماعات شبه مكتوب. يمكن قياس فيروس نقص المناعة البشرية الحياة الفطرية بوساطة خلية خلية الانصهار فحوصات فيروس الحياة الفطرية الخلية البروتين بوساطة الانصهار، بيد أن هذه لا تستخدم جزيئات الفيروس الفعلية كما يفعل فحص فيروس نقص المناعة البشرية-1 هفوة-الجماعات^3،،من⁴⁵. ويمكن قراءة هذا التحليل مع التدفق الخلوي أو الأسفار مجهرية. قد تم استخدمت بنجاح شاشة المكتبة إدارة الأغذية والعقاقير، فضلا عن مكتبة صغيرة بورينيرجيك مثبطات^1،6. غيرها من المحققين قد حددت أيضا مثبطات بورينيرجيك في الانصهار فيروس نقص المناعة البشرية-1 استخدام مقايسة انصهار الفائق تكييف والأمثل أن التقارير عن نقل الفيروس مغلفة بيتا-lactamase إلى^7،السيتوبلازم⁸ .

وقد صمم الفيروس هفوة-الجماعات مع نهج مماثل للفيروس هفوة-إيجفب، وإدراج recombinase لجنة المساواة العرقية بين المصفوفة وقفيصه، الذي كان واقفاً إلى جانب فيروس نقص المناعة البشرية-1 مبطلات مواقع⁹. يرصد الإنزيم لجنة المساواة العرقية كسلائف إدراجها ضمن بوليبروتين هفوة أن ينضج عندما يتم تنشيط فيروس نقص المناعة البشرية-1 مبطلات داخل جسيمات الفيروس الوليدة. وهكذا، تسليم لجنة المساواة العرقية تعتمد على إيصال محتويات الجسيمات فيروس نقص المناعة البشرية-1 المنشط في حوزتي في هدف خلية عن طريق عملية انصهار غشاء فيروسي. وترد هنا إصدارين من البروتوكول. يستخدم الأول سكان المصابين بفيروس نقص المناعة البشرية-1 لتصيب الخلايا الهدف، لدراسة انتقال الفيروس مباشرة من خلية إلى خلية. يستخدم الإصدار الثاني فيروس الخلية الحرة لدراسة التهاب فيروسي خالية من الخلية. والرزن نقل خلية إلى خلية يأخذ 7 أيام كاملة من اليوم الذي يتم إذابة الخلايا، أو 5 أيام إذا كان الفعل إذابة الخلايا وباساجيد. يمكن إجراء فحص الإصابة بالخلية الحرة في 5 أيام إذا كانت الخلايا بحاجة إلى أن يكون مذاب و 3 أيام إذا إذابة الخلايا وباساجيد. كما تعطي تعليمات لإنشاء خط خلية مستهدفة (من الأحمر إلى الأخضر) النمو الحقيقي في نوع الخلايا المطلوب (إذا لم يتم استخدام خط خلية هدف الحقيقي الموجودة مسبقاً) باستخدام بلازميد تم إنشاؤها بواسطة مختبر كليفيرس¹⁰. من المستحسن اتخاذ احتياطات السلامة المناسبة مع الفيروس والخلايا معربا عن الفيروس في هذا التحليل. نقوم بإجراء الجزء المعدية لهذا الفحص في منشأة لزراعة الأنسجة BSL2 +. بعد أن يتم إصلاح الخلايا، يمكن أن تحلل في المرافق القياسية التدفق الخلوي والفحص المجهري.

هنا يصف لنا تطبيق هذا التحليل على الشاشة لرواية المركبات التي تثبط فيروس نقص المناعة البشرية-1 الغشاء الفيروسي الانصهار (الشكل 1). مستقبلات بورينيرجيك من الوسطاء المحترفين التحريضية. لدينا مختبر أظهرت أن مثبطات غير انتقائي لمستقبلات بورينيرجيك تعمل كمثبطات لفيروس نقص المناعة البشرية-1 الغشاء الفيروسي الانصهار⁶. ونحن التقرير أن الاستفادة من هذا التحليل في إنتاجية عالية يمكن التعرف على رواية مثبطات الانصهار في الغشاء الفيروسي فيروس نقص المناعة البشرية-1. علينا أن نظهر أن المانع الفئة بورينيرجيك مستقبلات يمثل فئة جديدة من فيروس نقص المناعة البشرية-1 الغشاء الفيروسي الانصهار مثبطات.

Protocol

1-جيل خطوط الخلايا المستهدفة

ملاحظة: هذه الخطوة اختيارية؛ في حالة استخدام خط خلية هدف الحقيقي موجود، ابدأ في الخطوة 2.

1. كوترانسفيكت لوحة المتلاقية 10 سم 70% من الخلايا 293T¹¹ ] في 10 مل من المتوسطة تعديل النسر دولبيكو (دميم) مع 10% مصل بقرى الجنين (FBS)] مع بمسكفلوكسبدسريدلوكسبيجفببورووبري¹⁰ و pCL-10A1¹² (التغليف بلازميد) في باستخدام نسبة 1:1 (مجموع 20 ميكروغرام) المستندة إلى الكالسيوم تعداء¹³.
2. حصاد 10 مل تعداء الفيروسية طافية 48 ساعة بعد بيبيتينج وسائل الإعلام من اللوحة في أنبوب مخروطي 15 مل وسينتريفوجينج الأنبوبة في 3,000 س ز لمدة 5 دقائق في 23 درجة مئوية بيليه أي حطام الخلايا.
3. إرفاق عامل تصفية 0.45 ميكرومتر حقنه 10 مل. بعد الطرد المركزي، اتخاذ الكامل طافية وتحميل المحاقن. تشغيل العينة من خلال في أنبوب نظيف 15 مل.
4. قاسمة المادة طافية الفيروسية التي تمت تصفيتها إلى أحجام مناسبة (عادة 0.5-1 مل مختبرين). وهذه يمكن استخدامها مباشرة في الخطوة التالية أو يمكن المجمدة في-80 درجة مئوية وتخزينها.
5. استخدام 50 – 100 ميليلتر من المادة طافية الفيروسية لتصيب خط خلية المختارة في لوحة 96-جيدا. ثقافة الخلايا عند 37 درجة مئوية مع شركة 5%₂. إشارة طلب تقديم العروض يجب أن تظهر في أقرب وقت ممكن 24 ساعة تحت مجهر فلورية (40 X التكبير، 532 nm الإثارة، 588 نانومتر الانبعاثات) ولكن قد يستغرق مدة تصل إلى 72 ح.
   ملاحظة: في هذه التجارب، جوركات تم استخدام الخلايا، ولكن يمكن استخدام الأنواع الأخرى كذلك.
6. حدد الخلايا ترانسدوسيد مع بوروميسين بإعداد سلسلة من 10 آبار وإضافة بوروميسين إلى كل منها، تاركاً على الأقل 1 جيدا دون علاج كعنصر تحكم (استخدام مجموعة واسعة من تركيزات من 0.5 ميكروغرام/مل إلى 5 ميكروغرام/مل؛ وهذا قد تختلف حسب نوع الخلية). مراقبة صلاحية خلية (سوف يحدث تحلل الخلية في الخلايا دون المقاومة بوروميسين) على مدى عدة أيام مقارنة بمراقبة غير المعالجة واستخدام تركيز بوروميسين حيث البقاء فقط الخلايا الإعراب عن طلب تقديم العروض.
   ملاحظة: تحديد تركيز حيث يتم قتل الخلايا أونترانسفيكتيد بينما transfected الخلايا البقاء على قيد الحياة.
7. باستخدام أما من خلية واحدة التدفق الخلوي الفرز أو إضعاف الحد (انظر الخطوات 1.8 – 1.10)، تنمو الثقافات المستمدة من الخلايا المفردة¹ لتطوير خط خلية الاستنساخ (قد يستغرق هذا عدة أسابيع لتنمو).
8. في حالة استخدام أسلوب تمييع، عد الخلايا باستخدام هيموسيتوميتير وتمييع عينة لحوالي 500 مل/الخلايا.
9. في صفيحة 96، حسنا، "الماصة؛" 50 ميليلتر لتمييع الخلية إلى 50 ميليلتر لوسائل الإعلام [المتوسطة معهد ميموريال بارك في روزويل (ربمي) مع 10% FBS و 2% البنسلين-ستربتوميسين، إذا كان استخدام الخلايا جوركات] والقيام بتخفيف المسلسل 1:1 إلى 11 بئرا يحتوي على 50 ميليلتر من وسائل الإعلام. للحصول على أفضل النتائج، أداء replicates 10 على الأقل.
10. رصد نمو الخلية عن طريق الفحص المجهري (40 X) لوحة حاضنة استنبات الأنسجة (37 درجة مئوية، مع 5% CO₂) أو 4 أسابيع تقريبا. اختر الثقافات من أدنى تركيز بوروميسين مع النمو (كما ينظر إليها عبر المجهر، 40 س) للثقافات الاستنساخ.
11. تجميد في مختبرين سينتريفوجينج 20 مل الثقافة (500,000 خلايا/مل، عد مع هيموسيتوميتير) في 800 x ز لمدة 5 دقائق في 23 درجة مئوية وريسوسبيندينج أنه في 500 ميليلتر من FBS مع [دمس] 10%. ووضعه في-80 درجة مئوية باستخدام حاوية تجميد الخلايا وثم تخزينها في نيتروجين سائل.

2-انتقال الفيروس خلية إلى خلية

1. إعداد الخلايا الهدف
   1. ذوبان الجليد واحد 500 ميليلتر قنينة من خلايا مراسل جوركات النمو الحقيقي بوضعه في حمام مائي 37 درجة مئوية. "الماصة؛" الخلايا من القنينة في 10 مل من ربمي المتوسطة كاملة وثم الطرد المركزي المخلوط في 800 x ز لمدة 5 دقائق في 23 درجة مئوية. ريسوسبيند بيليه في 20 مل متوسطة ربمي كاملة في قارورة T-75. احتضان قارورة بين عشية وضحاها (37 درجة مئوية و 5 في المائة من أول أكسيد الكربون₂).
      ملاحظة: يتضمن ربمي المتوسطة كاملة RPMI 1640 10% FBS، 2 مم الجلوتامين L، 100 وحدة/مل البنسلين وستربتوميسين 100 ملغ/مل.
   2. وفي اليوم التالي إضافة 0.5 ميكروغرام/مل من بوروميسين (ميكروليتر 1 من الأسهم 2 مغ/مل كل 8 مل من وسائل الإعلام). ثقافة الخلايا، والحفاظ على كثافة خلايا/مل 200,000 – 800,000 (تحسب عن طريق هيموسيتوميتير).
   3. في اليوم قبل إعداد المقايسة نقل، تقسيم الخلايا وصولاً إلى 200,000 – 400,000 خلايا/مل في المتوسط ربمي الطازجة التي تحتوي على 0.5 ميكروغرام/مل من بوروميسين.
2. إعداد الخلايا المانحة
   1. ذوبان الجليد أونترانسدوسيد الخلايا جوركات والثقافة لهم في قارورة T-75 مع 20 مل ربمي إكمال المتوسطة (كما هو موضح في الخطوة 2، 1)، الحفاظ على كثافة خلايا/مل 200,000 – 800,000.
   2. الطرد المركزي خلايا 7,500,000 (800 x ز لمدة 5 دقائق) وريسوسبيند لهم في 120 ميليلتر لحل نوكليوفيكشن الخامس مع الملحق (انظر الجدول للمواد). نقل الخلايا إلى ومبومو انهانسر وإضافة 4.5 ميكروغرام من الجماعات هفوة¹ الحمض النووي. ترانسفيكت الخلايا (عن طريق نهج المستندة إلى انهانسر، انظر الجدول للمواد) استخدام برنامج مناسب (مثلاً، S-18) وبعد ذلك فورا نقلها إلى 3 مل متوسطة ربمي (مع 10% FBS).
   3. السماح باسترداد التي تفرخ منها بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع 5% CO₂في الخلايا.
   4. في صباح اليوم التالي، الطرد المركزي الخلايا في 800 x ز لمدة 5 دقائق في 23 درجة مئوية وريسوسبيند لهم في 3 مل من ربمي المتوسطة كاملة، مما يتيح لهم ح 2 لاسترداد عند 37 درجة مئوية (5% CO₂) قبل المتابعة مع إعداد المقايسة.
3. ثقافة المشارك
   1. عد الخلايا باستخدام حد هيموسيتوميتير ثم تدور أسفل الخلايا 50,000 (800 x ز لمدة 5 دقائق في 23 درجة مئوية) الواحدة وكذلك تكون جزيئي (من خلايا كل من المانحين والهدف). ريسوسبيندينج 1 × 10⁶ خلية/مل في ربمي كاملة بدون بوروميسين.
   2. في لوحة واحدة، وإضافة 25 ميليلتر من تعليق الخلية المانحة لكل بئر؛ في لوحة أخرى، وإضافة 25 ميليلتر من الخلايا المستهدفة.
   3. لكل بئر، إضافة 25 ميليلتر اختبار مجمع المخفف في المتوسط ربمي كاملة بتركيز مناسب. احتضان الخلايا المستهدفة والجهات المانحة مع المجمع لمدة 30 دقيقة.
      ملاحظة: يختلف التركيز كل المخدرات. إذا كان IC معروفة₅₀، استخدم هذا كنقطة انطلاق، المعايرة أعلاه وأدناه. إذا كان IC₅₀ غير معروف، إعداد مخزون 200 ميكرومتر لتركيز نهائي من 10 ميكرون.
   4. بعد المعالجة المسبقة، بدمج الخلايا المانحة مع الخلايا المستهدفة بيبيتينج محتويات لوح واحد إلى الآخر واحتضان الخلايا ح 40 في حاضنة استنبات الأنسجة في 37 درجة مئوية مع شركة 5%₂.
4. التدفق الخلوي
   1. إضافة بارافورمالدهيد (PFA) لكل بئر بتركيز نهائي 2%.
      ملاحظة: لحل أسهم 16%، هذا هو ميليلتر 14 الواحد 100 ميليلتر جيدا.
   2. تنبيه: منهاج عمل بيجين مضر للجلد والعيون. ارتداء معطف مختبر، والقفازات، ونظارات واقية، والتعامل مع الحل الأسهم في غطاء سلامة.
   3. قراءة الخلايا على سيتوميتير تدفق مشري وقنوات فيتك.
      ملاحظة: من الممكن أن نرى 5 – 20% الخلايا معربا عن التجارة والنقل فوق الخلفية في الخلايا المصابة مقابل. خلايا غير مصاب.
   4. تصور إشارة التجارة والنقل عبر الأسفار مجهرية (40 X) على القنوات الخاصة بالتجارة والنقل (باستخدام عامل تصفية إثارة من 400 نانومتر وعامل تصفية انبعاثات من 508 nm).

3-البديل البروتوكول للإصابة بعدوى فيروس الخلية الحرة

1. إعداد الخلايا الهدف
   1. ذوبان الجليد واحد 500 ميليلتر قنينة من النمو الحقيقي جوركات مراسل الخلايا عن طريق وضع في حمام مائي 37 درجة مئوية. "الماصة؛" الخلايا من القنينة في 10 مل من ربمي المتوسطة كاملة وثم الطرد المركزي المتوسطة كاملة ربمي في 800 x ز لمدة 5 دقائق في 23 درجة مئوية. ريسوسبيند بيليه في 20 مل متوسطة ربمي كاملة في قارورة T-75. احتضان قارورة بين عشية وضحاها (37 درجة مئوية و 5 في المائة من أول أكسيد الكربون₂).
   2. وفي اليوم التالي إضافة 0.5 ميكروغرام/مل من بوروميسين (ميكروليتر 1 من الأسهم 2 مغ/مل كل 8 مل من وسائل الإعلام). ثقافة الخلايا، والحفاظ على كثافة خلايا/مل 200,000 – 800,000 (تحسب عن طريق هيموسيتوميتير).
   3. في اليوم قبل إعداد المقايسة نقل، تقسيم الخلايا وصولاً إلى 200,000 – 400,000 خلايا/مل في المتوسط ربمي الطازجة التي تحتوي على 0.5 ميكروغرام/مل من بوروميسين.
2. إنتاج فيروس الخلية الحرة
   1. ترانسفيكت لوحة المتلاقية 10 سم 70% من الخلايا 293T¹¹ (في 10 مل دميم مع 10% FBS) مع 5 ميكروغرام من الجماعات هفوة بلازميد¹ استخدام المستندة إلى الكالسيوم تعداء¹³.
      ملاحظة: هذا الجدول سوف تنتج 10 مل فيروس، وما يكفي لحوالي اثنين إلى أربعة لوحات 96-جيدا، تبعاً لكفاءة تعداء.
   2. حصاد كامل المادة الفيروسية طافية في ح 48 بيبيتينج وسائل الإعلام من اللوحة في أنبوب مخروطي 15 مل وسينتريفوجينج الأنبوبة في 3,000 س ز لمدة 5 دقائق كل خلية الحطام بيليه.
   3. إرفاق عامل تصفية 0.45 ميكرومتر حقنه 10 مل. بعد الطرد المركزي، اتخاذ الكامل طافية وتحميل المحاقن. تشغيل العينة من خلال في أنبوب نظيف 15 مل.
   4. استخدام الفيروس لتصيب الخلايا الهدف فورا (الخطوة 3.3) أو تجميد وتخزين الفيروس-80 درجة مئوية (ذوبان العينة حسب الحاجة قبل الاستخدام).
3. العدوى
   1. عد الخلايا الهدف "الحقيقي جوركات" (من الخطوة 3.1.3) باستخدام هيموسيتوميتير وتدور أسفل الخلايا الهدف 50,000 كل بئر في 800 x ز لمدة 5 دقائق، ريسوسبيندينج الخلايا في 1 × 10⁶ خلايا/مل في ربمي إكمال المتوسطة دون بوروميسين.
   2. في لوحة واحدة، وإضافة 25 ميليلتر من الخلايا الهدف "الحقيقي جوركات" لكل بئر؛ في لوح منفصل، قم بإضافة 25 ميليلتر (2 نانوغرام) الفيروس لكل بئر.
   3. لكل بئر، إضافة 25 ميليلتر اختبار المركب، تضعف في وسائل الإعلام بتركيز مناسب. احتضان الخلايا والفيروسات مع المجمع لمدة 30 دقيقة.
      ملاحظة: تتنوع تركيز اختبار كل المخدرات. إذا كان IC معروفة₅₀، استخدم هذا كنقطة انطلاق، المعايرة أعلاه وأدناه. إذا كان غير معروف، تعد 200 ميكرومتر أسهم متوسطة لتركيز نهائي من 10 ميكرون.
   4. بعد المعالجة، إضافة المحتوى بالكامل (50 ميليلتر) من مزيج الفيروس/مجمع من الآبار على الخلايا المستهدفة واحتضان كل شيء من أجل ح 40 في حاضنة استنبات الأنسجة في 37 درجة مئوية مع شركة 5%₂.
4. التدفق الخلوي
   1. إضافة منهاج العمل لكل بئر بتركيز نهائي 2%.
      ملاحظة: لحل أسهم 16%، هذا هو ميليلتر 14 الواحد 100 ميليلتر جيدا.
   2. قراءة الخلايا على سيتوميتير تدفق مشري وقنوات فيتك. بروتينات فلورية خضراء إشارة يمكن أيضا تصور عن طريق الفحص المجهري fluorescence في قنوات التجارة والنقل.
      ملاحظة: مرة واحدة يمكن أن نتوقع أن نرى 5 – 20% الخلايا معربا عن التجارة والنقل فوق الخلفية في مقابلالخلايا المصابة. الخلايا غير مصاب.

النتائج

معرض RG مصابة "جوركات الخلايا" على مستوى منخفض من خلفية بروتينات فلورية خضراء إشارة (0.3 في المائة) مع إشارة قوية جداً طلب تقديم العروض (الشكل 2A، العمود غير مصاب). العدوى مع الجماعات هفوة يسبب زيادة في التجارة والنقل إشارة (24.9%)، مع وجود المانع الانصهار فيروس ن?...

Discussion

والرزن هفوة-الجماعات ثبت أن تكون مفيدة جداً لفحص المرشحين المخدرات التي قد تعوق الخطوة الانصهار للنسخ المتماثل الفيروسية. عند إجراء هذا الفحص، تتشابه الخطوات الأكثر أهمية للحصول على إشارة جيدة لفحوصات العدوى الفيروسية أكثر. أن الخطوة الحاسمة الأولى إنتاج التتر عالية من الفيروسات ذات ال?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Sigma Aldrich	D5546	Media for 293 Cells
RPMI-1640	Sigma Aldrich	R0883	Media for Jurkats
Fetal Bovine Serum Albumin	Gibco	16140-071	Serum for 293 Cells
Cosmic Calf Serum	Hyclone	SH30087.03	Serum for Jurkat Cells
Hyclone Pennecillin Streptomycin solution	GE Healthcare Life sciences	SV30010	Penn/Strep used in both media
T75 Flasks	Corning	3073	Used for Culture of Jurkat Cells
10 cm Tissue Culture Plates	Corning	430167	Used for Culture of 293 Cells
96 Well Plates (tissue culture Treated)	Corning	3595	Used for fusion assay
Polyjet Transfection Reagent	Signagen	SL100688	Used to transfect 293 Cells
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Sigma Aldrich	D8537-100ML	Used in wash steps
Hyclone Trypsin Protease	GE Healthcare Life sciences	SH30042.01	For Trypsinization of 293 cells
Amaxa Cell Line Nucleofector Kit V	Lonza	VACA-1003	For Nucleofection of Jurkats
Ficoll-Paque plus	GE Healthcare Life sciences	17144002	For Nucleofection of Jurkats
Serological Pipettes	Fisher Brand	13-678-11E	For all tissue culture
Pipettor Tips	Denville Scientific	P3020-CPS	For all tissue culture and liquid handling steps
Millex Syringe Filter (0.45 μm)	Millipore	SLHA033	For filtration of virus
BD Slip Tip Sterile syringes	BD Diagnostics	309656	For filtration of virus
Amaxa Nucleofector	Lonza	2b	for Nucleofection of Jurkats (various models available)
BD Fortessa Flow Cytometer	BD Biosciences		for flow cytometry analyss of samples
Tissue Culture Hood	Various models	Fortessa 2
pMSCV-loxp-dsRed-loxp-eGFP-Puro-W PRE	Addgene	32702	Koo BK et al. Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures. Nature Methods 9:81-83 (2011).
pCL10a1	Novus Bio	NBP2-29542	Naviaux, RK, Costanzi, E, Haas, M and Verma, I. The pCL vector system: Rapid production of helper-free, high titer, recombinant retroviruses. Journal of Virology 70: 5701-5705 (1996)
Gag-iCre	Benjamin Chen Lab		Esposito AM et al. A high throughput Cre-lox activated viral membrane fusion assay identifies pharmacological inhibitors of HIV entry. Virology 490:6-16 (2016).