JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نقدم هنا بروتوكول الجماعي القائم على قياس الطيف الكتلي جنبا إلى جنب للتحديد الكمي للمضادات الحيوية المستخدمة بشكل متكرر في وحدات العناية المركزة، هما cefepime الميروبينيم والسيبروفلوكساسين، موكسيفلوكساسين، لنزوليد، والبيبراسيللين.

Abstract

هناك طلب متزايد لرصد العقاقير العلاجية للمضادات الحيوية في العديد من المرافق السريرية، خاصة فيما يتعلق بتنفيذ برامج الإشراف على المضادات الحيوية في المستشفى.

في العمل الحالي، نقدم بروتوكول متعدد عالية الأداء سائل اللوني-جنبا إلى جنب الكتلي (البترول-MS/MS) للتحديد الكمي سيفيبيمي، الميروبينيم، سيبروفلوكساسين، موكسيفلوكساسين، لنزوليد، والبيبراسيللين، ويشيع استخدام المضادات الحيوية في وحدات العناية المركزة. قبل التحقق من الأسلوب شامل طبقاً للمبادئ التوجيهية لوكالة الأدوية الأوروبية.

بعد تنظيف عينة سريع، فصل على عمود [هبلك] عكس مرحلة C8 في غضون 4 دقائق تحليلها وكمياً مع مستقرة النظائر المسمى الداخلية المعايير المقابلة في اليكتروسبراي الكتلي التأين (ESI +) في رد فعل متعددة وقت الرصد (MRM). يستخدم الأسلوب قدم أجهزة بسيطة الإعداد مع شروط الكروماتوغرافي موحدة، بما يسمح للرصد اليومي وقوى العقاقير العلاجية المضادات الحيوية في المختبرات السريرية. منحنى المعايرة يمتد نطاق التركيز الحرائك الدوائية، وبالتالي بما في ذلك المبالغ المضادات الحيوية القريبة من تركيز الحد الأدنى المثبطة (MIC) البكتيريا عرضه والتركيزات القصوى (جكحد أقصى) التي يتم الحصول عليها مع بولس أنظمة الإدارة. دون الحاجة إلى تمييع المصل قبل تنظيف العينة، يمكن الحصول على المنطقة الواقعة تحت المنحنى للمضادات الحيوية التي تدار من خلال قياسات متعددة.

Introduction

على الرغم من أن المضادات الحيوية قد أحدثت ثورة في ممارسة الطب، تظل شديدة العدوى البكتيرية سببا رئيسيا للمراضة والوفيات في الأمراض الحرجة1. وفي هذا الصدد، الإدارة الفورية لمدى مناسبة في جرعة كافية أهمية العلوي ل مراقبة المرض2.

مجموعة متزايدة من الأدلة تثبت أن العلاج التجريبي بالمضادات الحيوية واسعة الطيف أصبح يمثل مشكلة متزايدة مع الطابع المعقد للسكان المريض. وهذا صحيح بشكل خاص لوحدات العناية المركزة (اتحاد المحاكم الإسلامية)، حيث كثيرا ما يلاحظ هائلة تقلب فردية بين المعلمات (PK) الحرائك الدوائية الرئيسية3،4. تبعاً لذلك، مرضى العناية المركزة معرضة لخطر وشيك من المستويات الفرعية العلاجية مع خطر نجاح العلاج غير كافية5،6. ثم مرة أخرى، يتعرض المرضى دون داع لتركيزات المضادات الحيوية الباهظة التي قد تسفر عن الأحداث الضائرة الخطيرة مع لا فوائد سريرية7. إساءة استخدام المضادات الحيوية والجرعات غير كافية قد غذت أيضا نشر المقاومة للمضادات الحيوية، التي أصبحت تشكل تهديدا متزايداً للصحة العامة8.

تحسين استخدام المضادات الحيوية والحفاظ على افيكتيفينيساس أطول فترة ممكنة، "منظمة الصحة العالمية" بدأت خطة عمل عالمية في مقاومة مضادات الميكروبات في 20159. برامج الإشراف على المضادات الحيوية تشكل ركنا أساسيا من الحكمة استخدام مضادات الميكروبات في الصحة العامة الوطنية استراتيجيات10، مساعدة الأطباء لتحسين نوعية رعاية المرضى11 ، وفي الوقت نفسه، إلى حد كبير الحد من مقاومة المضادات الحيوية12. مضادات الميكروبات الجرعات في كل مريض على حدة من خلال تطبيق العقاقير العلاجية الرصد (TDM) أداة رئيسية في هذا السياق13.

حتى الآن، ايتنين المتاحة تجارياً فحوصات متوفرة فقط للمضادات الحيوية جليكوبيبتيدي والامينوجليكوزيدات. عادة يتطلب التحديد الكمي للمواد من فئات أخرى تطوير أسلوب داخلية أو التحقق من الصحة التي يمكن أن تكون مرهقة. ولذلك، نحن، يقدم بالتفصيل البروتوكول المتعلق بفحص الشامل القائم على قياس الطيف الكتلي قوية التي يمكن استخدامها للتقدير الكمي للمضادات الحيوية الأكثر صلة في العناية المركزة داخل نطاقات التركيز السريرية ذات الصلة بهم14. الأسلوب الذي أنشئ مؤخرا في منشآتنا الكتلي وطبق لروتين TDM في العناية المركزة منذ ذلك الحين. يستخدم الإجراء إعداد تحليلية واضحة وبسيطة مع تنظيف نماذج موحدة، مما يسمح للتنفيذ السريع ايتنين المضادات الحيوية في العديد من المرافق مع قدرات الكتلي.

البروتوكول الموصوفة هنا هو الأمثل للتحديد الكمي سيفيبيمي، الميروبينيم، سيبروفلوكساسين، موكسيفلوكساسين، لنزوليد، والبيبراسيللين في مصل الدم البشري، استخدام النظائر تمييع اللوني السائل (ش) في تركيبة مع جنبا إلى جنب كتلة قياس الطيف الكتلي (MS/MS). تخفيف تركيز النظائر منهجية LC-MS/MS، تتم إضافة المركبات المسماة النظائر المستقرة لعينة من الاهتمام مع مصفوفة محددة (مثلاً، المصل). ويمكن تمييز المعايير المسماة النظائر من نظيرتها غير مسمى، إلا وهي أكثر الاهتمام، بسبب الأوزان الجزيئية مختلفة من الجزيئات الطبيعية ومنتجاتها التجزؤ، وصف انتقال الأصل أيون لابنه أيون. كما المركبات المسماة النظائر سلوك عموما الفيزيائية متطابقة تقريبا مقارنة بنظيرتها غير مسمى، فمعايير داخلية مثالية ل MS/MS، مما يتيح إجراء تقييم كمي أكثر تقريبا مستقلة عن مصفوفة بدرجة عالية من 15من الدقة. في الوقت الحاضر، العديد من استقرارا النظائر المسمى الداخلية المعايير التي يمكن استخدامها للتقدير الكمي جزيء صغير، بما في ذلك دي أم لمضادات الميكروبات، متاحة تجارياً.

يتم تنفيذ الفصل الكروماتوغرافي لتحليلها المضادات الحيوية في وصف البروتوكول مع C8 الكيل-سلسلة-طول عكس-مرحلة تحليلية عمود (100 مم × 2.1 ملم، 3 ميكرومتر-حجم الجسيمات). أثناء تطوير الأسلوب، كان العوامل الداخلية مصفوفة تطبيع القياسية لجميع التحاليل بين 94.6% % 105.4، مع معامل التغير ≤8.3%14.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

ملاحظة: من المستحسن أن تعمل في غطاء دخان عند التعامل مع المذيبات العضوية، مثل الميثانول. إعداد كافة المخازن المؤقتة ومراحل المتنقلة في قوارير الحجمي. إذا لم يتم تحديدها، يمكن تخزين الحلول في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى شهر واحد بعد التحضير.

1-إعداد عينات مراقبة الجودة وآله لفرز

ملاحظة: يرد ورقة تحليل بيانات مقابلة لإعداد حلول الأسهم وارتفاع في ملف إضافي. لأسباب تتعلق بالتتبع، إدراج الشركة المصنعة ورقم الكتالوج، وعدد الكثير من كل المضادات الحيوية في الأعمدة المقابلة. حل كل المضادات الحيوية في تخزين الباردة عند 4 درجة مئوية، والحفاظ على وقت العمل قصيرة قدر الإمكان.

  1. تحضير 100 مل ميثانول 25% في المياه: بريفيل قارورة حجمية 100 مل مع 25 مل ميثانول المطلق وملئه يصل إلى 100 مل بالماء المقطر.
  2. إعداد 10 مل حمض الخليك 200 ملم في المياه: بريفيل دورق حجمي 10 مل مع 9 مل مياه الصف [هبلك]، إضافة ميليلتر 115 من حمض الخليك الجليدية (99.5 ٪ النقاء، 17.4 متر)، وإضافة الماء المقطر يصل إلى 10 مل.
  3. إعداد 25 مل ميثانول 25% في المياه مع حمض الخليك 20 ملم: بريفيل دورق حجمي 25 مل مع 2.5 مل الحل حمض الخليك مائي 200 ملم، إضافة مل 6.25 من الميثانول المطلق، وملء قارورة إلى 25 مل بالماء المقطر.
  4. استخدم مقياس دقة لوزن المبالغ المناسبة من المضادات الحيوية في أنابيب مخروطية الشكل 15 مل كما هو موضح في ملف إضافي في عمود الوزن الأولى.
  5. إعداد حلول الأسهم فلوروكوينولونيس، سيبروفلوكساسين، وموكسيفلوكساسين في 25 ٪ الميثانول-المياه بما في ذلك 20 حمض الخليك ملم. للقيام بذلك، إضافة وحدة التخزين المطابقة لكميات مرجح كما هو موضح في ملف إضافي في العمود "الحجم النهائي". سرعة حل المضادات الحيوية مجموعة الفلوروكوينولون في حمام الموجات فوق الصوتية لمدة 2 دقيقة ومكثفة فورتيكسينج.
  6. إعداد حلول الأسهم سيفيبيمي، الميروبينيم، لنزوليد، والبيبراسيللين في 25 ٪ الميثانول-الماء. للقيام بذلك، إضافة إلى حجم المقابلة لكميات مرجح كما هو موضح في ملف إضافي في العمود الحجم النهائي وسرعة حل المضادات الحيوية بواسطة فورتيكسينج مكثفة. حل الميروبينيم كمضمون آخر.
  7. الجمع بين الحلول الأسهم جميع المضادات الحيوية كما هو موضح في المخطط المقابل حجم الأسهم الحل في ملف إضافي تسفر عن عشرة إضعاف مركزة سبايك-حلول.
  8. ارتفاع كميات تسعة من المصل خالية من المخدرات بحجم واحد من عشرة إضعاف سبايك مركزة والحلول للحصول آلة لفرز المصل 0 – 7 وضوابط الجودة (QC) ألف – دال على سبيل المثال، بإضافة 0.5 مل من محلول سبايك إلى 4.5 مل مصل في أنبوب البولي بروبلين 10 مل واحتضان عليه لمدة 15 دقيقة في التخزين البارد في 4 درجات مئوية في خلاط الرول 50 لفة في الدقيقة.
  9. استخدام ماصة متكررة لتوليد 100 ميليلتر مختبرين للتحقق، المقاييس الموجية وجمعية قطر الخيرية في أنابيب البولي بروبلين 1.5 مل.
  10. تخزين المعدات تنظيف ومعايرة وضوابط الجودة، والحلول مخزون المضادات الحيوية في-80 درجة مئوية لمدة تصل إلى ستة أشهر.
  11. لكل المضادات الحيوية، كما تعد تكتنف حل يتضمن 1,000 مغ/لتر المضادات الحيوية واحد. تمييع الحل الأسهم المقابلة مع مخفف ملائمة (مثلاً، السيبروفلوكساسين، استخدام 25 ٪ الميثانول-المياه بما في ذلك 20 حمض الخليك مم).
    ملاحظة: الحلول المضادات الحيوية التي تكتنف مطلوبة لضبط الصك فقط.

2-إعداد مزيج المعايير الداخلية

ملاحظة: هي معايير الداخلية المسمى النظائر النظراء من تحليلها للفائدة التي يتم إضافتها إلى نموذج أثناء تنظيف العينة. المعايير الداخلية لديها الخصائص الفيزيائية الكيميائية عموما متطابقة تقريبا إلى نظرائهم غير مسمى، التعويض عن الآثار مصفوفة لنموذج معين.

  1. إعداد 10 مل ميثانول 50% في المياه بإضافة 5 مل ميثانول المطلق قارورة اهتزاز 10 مل وملئه يصل إلى 10 مل بالماء المقطر.
  2. إعداد 10 مل ميثانول 50% في المياه بما في ذلك حمض الخليك 20 مم. للقيام بذلك، إضافة 1 مل حامض الخليك 200 ملم قارورة 10 مل وإضافة 5 مل ميثانول المطلق، وملء أنه يصل إلى 10 مل بالماء المقطر.
  3. توليد حلول الأسهم من المعايير الداخلية (ق. أ) مع 1,000 مغ/لتر مباشرة في قارورة توفيرها من قبل الشركة المصنعة. حل سيفيبيمي-13ج12د3 كبريتات في الماء المقطر والميروبينيم-د6، لنزوليد-د3والبيبراسيللين-د5 في حل ميثانول-مياه 50%. حل السيبروفلوكساسين-د8 في 50 ٪ الميثانول-المياه مع 20 مم خلات وموكسيفلوكساسين هيدروكلوريد-13ج1د3 في الماء المقطر مع خلات 20 مم.
  4. الجمع بين الحلول هو المخزون في أنبوب البولي بروبلين 1.5 مل تسفر عن مزيج قياسية داخلية تتركز خمسة إضعاف. إضافة 10 ميليلتر cefepime-13ج12د3، 10 ميليلتر الميروبينيم-د6، 1 ميليلتر من السيبروفلوكساسين-د8، 2 ميليلتر موكسيفلوكساسين هيدروكلوريد-13ج1د3، 2 ميليلتر لنزوليد-د 3، و 10 ميليلتر من البيبراسيللين-د5 ميليلتر 965 25 ٪ الميثانول بالمياه.
  5. تخزين الحلول الأسهم القياسية الداخلية وهذا المزيج هو خمسة إضعاف مركزة في-80 درجة مئوية.

3-المريض عينة التخزين

ملاحظة: تأكد من الحصول على المصل أسرع وقت ممكن وأن يتم الحفاظ على سلسلة التبريد للعينات المجمدة.

  1. جمع الدم كله في أنابيب جمع المصل.
  2. واسمحوا تجلط الدم لمدة 20 – 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  3. فصل المصل من الدم بالطرد المركزي في 2,000 س ز لمدة 10 دقائق.
  4. نقل المادة طافية إلى أنبوب البولي بروبلين نظيفة.
  5. تخزين المصل إلى ستة أشهر في-80 درجة مئوية حتى أنه هو جزيئي. وبدلاً من ذلك، تخزين العينات ما يصل إلى 3 أيام في-20 درجة مئوية.

4-المخزن المؤقت إعداد اللوني

  1. لتحضير 1 م فورمات الأمونيوم في الماء، حل 6.306 ز فورمات الأمونيوم في 100 مل مياه الصف [هبلك] استخدام قارورة يهز 100 مل. الحل تخزين ما يصل إلى 1 في الشهر في 4 درجات مئوية.
  2. إعداد الهاتف النقال المرحلة [فورمات أمونيوم 10 ملم في حمض الفورميك المياه (99.9:0.1 v/v)]. بريفيل مل 1,000 دورق حجمي مع حوالي 500 مل الماء [هبلك] الصف وإضافة 1 مل حمض الفورميك و 10 مل من الحل فورمات الأمونيوم 1 م، وتعبئته لمل 1,000 مع المياه الصف [هبلك]. نقل المرحلة المتنقلة ألف زجاجة زجاجية نظيفة وتوصيله إلى النظام [هبلك]. تخزين المرحلة متنقلة تصل إلى 2 أسابيع في درجة حرارة الغرفة.
  3. التحضير لمرحلة الجوال نقل باء [هبلك]-الصف الميثانول المطلق في زجاجة زجاج نظيفة وتوصيله إلى النظام [هبلك].
  4. استخدام الميثانول المطلق الإبرة غسل المذيبات وتوصيل الأنبوب المقابلة بزجاجة تحتوي على النقالة المرحلة باء
  5. إنشاء الختم وتطهير مذيب لحمض الفورميك الميثانول المياه (7:92.9:0.1، v/v/v). بريفيل مل 1,000 دورق حجمي مع حوالي 500 مل ماء المقطر وأضف 70 مل ميثانول المطلق، 1 مل حمض الفورميك، وإضافة الماء المقطر لمل 1,000. نقل المذيب إلى زجاجة زجاجية نظيفة وتوصيله بالنظام [هبلك].
    ملاحظة: استخدام مختلف أوتوسامبلير أنظمة قوية ومذيب يغسل إبرة ضعيفة. وفي هذه حالة، تعد الحلول يغسل وفقا لتوصيات الشركة المصنعة. على سبيل المثال، تغسل الغسيل قوية مع الكحول الميثانول-المياه-إيسوبروبيليك (70:20:10، v/v/v)، والضعفاء بالمياه-الميثانول (نمط، v/v).

5-أداة ضبط

ملاحظة: يتم تنفيذ هذه الخطوة لإنشاء أسلوب على مطياف كتلة محددة.

  1. تمييع أكثر أنيق 1,000 مغ/لتر، والحلول القياسية الداخلية 01:10 أو 1: 100 في خليط مرحلة المتنقلة A و B (50/50، v/v)، اعتماداً على كثافة إشارة كاشف. لحن مطياف كتلة مع الدالة autotune أو القيام ضبط يدوي ل التحولات الوالد أن ابنه الأيونات التالية14: سيفيبيمي (481.0 > 167.0/395.7)، سيفيبيمي-13ج12د3 (485.1 > 167.1/ 400.0)، الميروبينيم (384.1 > 114.0/141.0)، الميروبينيم-د6 (390.1 > 114.0/147.2)، سيبروفلوكساسين (332.0 > 231.0/245.0)، سيبروفلوكساسين-د8 (340.1 > 235.1/249.3)، موكسيفلوكساسين (402.0 > 261.0/383.9)، موكسيفلوكساسين-13 ج1د3 (406.1 > 265.1/388.0)، لنزوليد (338.0 > 235.0/296.0)، لنزوليد-د3 (341.1 > 235.1/297.1)، البيبراسيللين (518.0 > 143.0/358.9)، والبيبراسيللين-د5 (523.1 > 142.8/364.1).
  2. للصكوك مع autotuning، استخدم الدالة autotune لضبط تلقائياً في الجهد وإعدادات من مدخل MS من خلال كاشفات.
  3. للصكوك مع ضبط يدوي، وضبط الإعدادات (مثل، الاصطدام والجهد والطاقة الاصطدام) حتى الأمثل (عادة الحد الأقصى) هو الحصول على كثافة إشارة الكاشف لكل أيون الوالد وابنه. على سبيل المثال، توصيل نقطة الانطلاق خلط وتسليم المرحلة المتنقلة A و B (50/50، v/v) في 0.5 مل/دقيقة، ولبث معيار المضادات الحيوية أو الداخلية نظيفة باستمرار بمعدل تدفق 0.1 مل/دقيقة.

6-[هبلك]-MS/MS الإعداد

ملاحظة: يتميز مطياف الشامل ونظام [هبلك] (بما في ذلك في أوتوسامبلير)، وبرنامج المقابلة يعتمد على الشركة المصنعة. التكيف مع المعلمات مطياف الشامل وإجراءات الغسيل وفقا لتوصيات الشركة المصنعة.

  1. تخزين معلمات مطياف كتلة في المقابلة 'مرض التصلب العصبي المتعدد اللحن الملف'. استخدام اليكتروسبراي التأين في وضع إيجابي (ESI +) لجميع التحاليل. التكيف مع أيون المصدر إعدادات الأداة المستخدمة (مثلاً، جهد شعرية 1.5 كيلوفولت ودرجة حرارة مصدر من 120 درجة مئوية ودرجة حرارة ديسولفيشن 400 درجة مئوية، بمعدل تدفق غاز ديسولفيشن 600 لتر في الساعة، جهد RF عدسة 0.1 V ووقت يسكن 80 مللي ثانية).
  2. تحديد أكثر والمعايير الداخلية توليف معلمات (مثلاً، الجهد الشعرية، الطاقة الاصطدام) في 'ملف MS'.
  3. تعيين الشروط أوتوسامبلير على النحو التالي في 'مدخل الملف': درجة حرارة العينة 10 درجة مئوية، مع حد ± 5 درجة مئوية؛ التسلسل الغسيل في 1 x التصريف-المياه والصرف الصحي-تطهير مع 600 ميليلتر تطهير استبدال وحدة التخزين.
  4. في المذكورة أعلاه 'مدخل الملف'، وتعيين معدل التدفق إلى 0.4 أو 0.5 مل/دقيقة، وقت التشغيل إلى 4 دقيقة، الحد من ارتفاع الضغط إلى شريط 345، وعمود درجة الحرارة إلى 30 درجة مئوية، مع حد ± 5 درجة مئوية. إضافة اسم المذيبات من مراحل المتنقلة A و B ومجموعة منهم إلى أ B/93% 7 في المائة، على التوالي.
  5. برنامج التدرج الكروماتوغرافي في 'ملف مدخل' كما يلي: 0.00 – 0.10 دقيقة مع المرحلة المحمول 7% B/93% A، 0.11 – 0.60 دقيقة مع 65% المرحلة المتنقلة B/35% A، 0.61 – 2.10 دقيقة مع المرحلة المتنقلة B/5% A، 2.11 – 4.00 دقيقة 95% مع 7% النقالة المرحلة ألف B/93%
    ملاحظة: حساب حجم عمود إضافي، وحجم السطو لمنهاج العمل مفيداً، والعوامل استبقاء أكثر كما هو موضح في الفصل اللوني لجامعة جنوب المحيط الهادئ < 621 > المبدأ التوجيهي رقم16.

7-نموذج قياس ماجستير الملف

ملاحظة: مع 'عينة قياس الملف الرئيسي'ويتم تحديد عينات المرضى وبدأ التحليل [هبلك]-MS/MS، ويتم إجراء تقييم البيانات. يتم إنشاء ملفات قالب منفصل اثنين بما في ذلك زوج تحكم منخفضة وعالية جودة؛ يتضمن قالب واحد زوج QC ألف وجيم، واحد QC الزوج الأخرى B و D.

  1. إنشاء جديد 'عينة قياس الملف الرئيسي'. حدد المشار إليها أعلاه 'MS لحن ملف'، 'ملف MS'، 'مدخل الملف' (المادة 6)، بإدراجها في كل سطر عينة، وتعيين وحدة التخزين بالحقن مع 15 ميليلتر.
  2. في ترتيب تصاعدي، إضافة "نموذج نص" لالة لفرز 0 – 7 ومراقبة النوعية (QC) زوج المكيفات أو زوج QC برميل في اليوم.
  3. تحديد نوع العينة. حدد نوع نموذج "معيار" لالة لفرز و "مراقبة الجودة" لأزواج مراقبة الجودة.
  4. تحديد تركيز كل مادة المضادات الحيوية للتحقق، المقاييس الموجية المقابلة وضوابط الجودة (انظر جدول البيانات، تركيز [ميكروغرام/مل] كال 0 7 – كال، والمكيفات ومراقبة الجودة أو برميل يوميا،).
  5. البرنامج 'أسلوب التقييم البيانات'. استخدام الانتقالات التي تم تحسينها خلال أداة ضبط (القسم 5). تطابق كل المضادات الحيوية مع المعيار المقابل النظائر المسمى (مثلاً، الميروبينيم-الميروبينيم-د6).

8-عينة من تنظيف والتحليل [هبلك]-MS/MS

ملاحظة: لكل دفعة عينة، هو معالجة وتحليل عنصر تحكم الجودة مقترنة مع تركيز المضادات الحيوية المنخفضة والعالية (المكيفات ومراقبة الجودة أو مراقبة الجودة برميل في اليوم). بين دفعات مختلفة، وتستخدم عينات مراقبة الجودة المزدوجة في تسلسل بديل (مثلاًفي اليوم 1، حدد 'عينة قياس الملف الرئيسي' بما في ذلك مراقبة الجودة زوج المكيفات؛ وفي اليوم 2، حدد زوج مراقبة الجودة بما في ذلك واحد برميل في اليوم. تجهيز عينات مصلية يتضح في الشكل 1.

  1. إعداد الوكيل هطول الأمطار 10% الميثيل-ثالثي-بوتيل الاثير في الميثانول (10:90، v/v) (مثلاً، دورق حجمي بريفيل 25 مل مع 2.5 مل من الميثيل-ثالثي-بوتيل الاثير وملئه إلى 25 مل مع الميثانول المطلق).
  2. ضع المرحلة عكس C8 في قاعة العمود. توصيله إلى [هبلك] ومطياف كتلة في اتجاه التدفق.
  3. إنشاء نموذج قائمة. فتح المناظرة 'عينة قياس الملف الرئيسي' القالب وإضافة عينات المرضى يعني بحيث تتم معالجتها إلى القائمة. إنشاء مجموعات من عينات المرضى يصل إلى 20 والجناح لهم مع زوج مراقبة الجودة المطابق.
  4. الرطب--رئيس الوزراء باستخدام نظام البترول 'مدخل الملف' التحكم في البرنامج: تعيين وظيفة "رئيس الوزراء الرطب" إلى مرحلة المحمول 50% ب A/50%، والرطب--رئيس الوزراء لمدة 2 دقيقة مع معدل تدفق من 1 مل/دقيقة.
  5. تحديث المحاقن. للقيام بذلك، تنفيذ ضربات 6 من 600 ميليلتر في برامج التحكم.
  6. حجته العمود المرحلة عكس C8. باستخدام البرنامج، قم بتشغيل التدفق في 'مدخل الملف' وطرد مع 7% النقالة المرحلة B/93% A لحد أدنى من 5 دقيقة، بمعدل 0.5 مل/دقيقة تحقق تدفق باستخدام عمود درجة حرارة 30 درجة مئوية.
  7. ذوبان الجليد عينات المرضى وقاسمه واحدة للتحقق، المقاييس الموجية 0 – 7 وزوج مراقبة الجودة (أما A/B أو فرعي).
  8. مع ماصة متكررة، إضافة 25 ميليلتر من مزيج القياسية الداخلية إلى 100 ميليلتر معير، وعينه مراقبة الجودة أو مصل المريض في الأنبوب البولي بروبلين 1.5 مل، ودوامه الأنبوب لبضع ثوان.
  9. احتضان هذا الخليط لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة على شاكر benchtop (مثلاً، 1,200 لفة في الدقيقة).
  10. مع ماصة متكررة، إضافة 150 ميليلتر من كاشف هطول الأمطار إلى مزيج قياسي عينة الداخلية.
  11. مرة أخرى، دوامة الأنبوب لبضع ثوان واحتضان عليه لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة على شاكر benchtop (مثلاً، 1,200 لفة في الدقيقة).
  12. الطرد المركزي من التعليق في 20,000 x ز في أجهزة الطرد مركزي منضدية لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية.
  13. تمييع المادة طافية 1:3 مع المياه الصف [هبلك] باستخدام قنينة زجاجية مع مايكرو-إدراج وتحميله المجهزة عينات أوتوسامبلير.
  14. بدء التحليل [هبلك]-MS/MS يدوياً 'نموذج قياس عنصر تحكم ملف'.
    ملاحظة: لتخزين طويلة، دقة استواء العمود التحليلي وفقا لتوصية الشركة المصنعة [مثلالميثانول 0.5 مل/دقيقة-المياه (50/50، v/v)] لمنع انهيار المرحلة.

figure-protocol-14162
رقم 1: التمثيل التخطيطي لتنظيف العينة. ترسيب البروتين في قوة الطرد المركزي عالية يعطي بيليه كثيفة وطاف واضحة، وتشير إلى أن ترسيب البروتين كاملة. وقت التجهيز بأكمله حوالي 30 دقيقة، بما في ذلك تنظيف العينة، الفصل الكروماتوغرافي، وتحليل MS/MS. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

9-نوعية التقييم والتقدير الكمي

  1. لتجهيز العينات، فتح المناظرة 'نموذج قياس عنصر التحكم ملف'وحدد آلة لفرز ومراقبة الجودة، وعينات المرضى وتقييم لهم مع 'الأسلوب الكمي المضادات الحيوية'.
  2. التحقق من ما إذا كان على قمم لأكثر محددة تتكامل بشكل صحيح. تفتيش على قمم لكل معير، ومراقبة الجودة، وعينه المريض، وإعادة دمجهم يدوياً في الأساس إذا لزم الأمر.
  3. دراسة منحنى المعايرة وفحص ما إذا كان أنها تفي بالمعايير النوعية التالية: أ) الخطي على نطاق كامل المعايرة، ب) معايرة معامل r2 > 0.995، ج) انحراف كل المعايرة القياسية داخل ± 15% من القيمة الاسمية، باستثناء الحد الأدنى للقياس الكمي (لوك)، حيث يكون مطلوباً ± 20%.
  4. إعادة تقييم منحنى المعايرة، بما في ذلك تحليل الانحدار، ورفض معيار معايرة لا تمتثل للمعايير المذكورة أعلاه.
  5. دراسة ضوابط الجودة وبحث ما إذا كانت الانحرافات داخل ± 15% من القيمة الاسمية.
  6. إذا كان تركيز عينة المريض يتجاوز تركيز معايرة أعلى، تخفف العينة مع الماء المقطر، يصل إلى 1:5(مثلاً 100 ميليلتر من المصل بالإضافة إلى 400 ميليلتر من الماء المقطر)قبل تنظيف العينة. ريبيرفورم خطوات 8.8 – 8.14 لأن عينة محددة وإعادة معالجة ذلك.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

استخدام بروتوكول وصف، chromatogram نموذجي هو مبين في الشكل 2. وفقا للمبادئ التوجيهية لدستور الولايات المتحدة (جامعة جنوب المحيط الهادئ) اللوني16، تم تحديد حجم العمود ميتة في النظام الحالي مع مل ~0.22 وحجم عمود إضافي (بما في ذلك حاقن، والأنابيب، وموصلا?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

في هذه المخطوطة، يمكننا تقرير البروتوكول المتعلق بطريقة جماعية على أساس قياس الطيف الكتلي جنبا إلى جنب بسيطة وقوية للتحديد الكمي للمضادات الحيوية المستخدمة بشكل متكرر في العناية المركزة19، إلا وهي سيفيبيمي، الميروبينيم، سيبروفلوكساسين، موكسيفلوكساسين، لنزوليد، و البيبرا?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

يشكر المؤلفون Schütze الدكتور لمساعدته مع إنشاء طريقة عرض والدكتور زولر للمدخلات القيمة فيما يتعلق بنطاق المعايرة الصحيحة. كما تقر المؤلفين الموظفين التقنيين مرفق الكتلي.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
cefepime hydrochlorideSigma-Aldrich1097636USP Reference Standard
meropenem trihydrateSigma-AldrichY0001252EP Reference Standard
ciprofloxacinSigma-Aldrich17850
moxifloxacin hydrochlorideSigma-AldrichSML1581
linezolidToronto Research ChemicalsL466500
piperacillin sodium saltSigma-Aldrich93129
cefepime-13C12D3 sulfateAlsachimC1297Isotope labelled internal standard for cefepime
meropenem-D6Toronto Research ChemicalsM225617Isotope labelled internal standard for meropenem
ciprofloxacin-D8Toronto Research ChemicalsC482501Isotope labelled internal standard for ciprofloxacin
moxifloxacin-13C1D3 hydrochlorideToronto Research ChemicalsM745003Isotope labelled internal standard for moxifloxacin
linezolid-D3Toronto Research ChemicalsL466502Isotope labelled internal standard for linezolid
piperacillin-D5Toronto Research ChemicalsP479952Isotope labelled internal standard for piperacillin
methanolJT Baker8402
HPLC grade waterJT Baker4218
formic acidBiosolve6914132
acetic acidBiosolve1070501
ammonium formateSigma-Aldrich70221-25G-F
tert-Butyl methyl etherMerck101845
Fortis 3 μm C8 100 * 2.1 mmFortisF08-020503
Ti-PEEK-encased Prifilter (2 μm)Chromsystems15011
2795 Alliance HPLC systemWaters176000491
Quattro micro API Tandem Quadrupole SystemWaters720000338
QuanLynx 4.1 softwareWaters/Data evaluation software provided by the mass spectrometer manufacturer
Supplemental FileStock Solutions

References

  1. Fleischmann, C., et al. Assessment of Global Incidence and Mortality of Hospital-treated Sepsis. Current Estimates and Limitations. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 193 (3), 259-272 (2016).
  2. Dellinger, R. P., et al. Surviving Sepsis Campaign: international guidelines for management of severe sepsis and septic shock, 2012. Intensive Care Medicine. 39 (2), 165-228 (2013).
  3. Lodise, T. P., Drusano, G. L. Pharmacokinetics and pharmacodynamics: optimal antimicrobial therapy in the intensive care unit. Critical Care Clinics. 27 (1), 1-18 (2011).
  4. Macedo, R. S., Onita, J. H., Wille, M. P., Furtado, G. H. Pharmacokinetics and pharmacodynamics of antimicrobial drugs in intensive care unit patients. Shock. 39, Suppl 1. 24-28 (2013).
  5. Petersson, J., Giske, C. G., Eliasson, E. Standard dosing of piperacillin and meropenem fail to achieve adequate plasma concentrations in ICU patients. Acta Anaesthesiologica Scandinavica. 60 (10), 1425-1436 (2016).
  6. Abdul-Aziz, M. H., Lipman, J., Mouton, J. W., Hope, W. W., Roberts, J. A. Applying pharmacokinetic/pharmacodynamic principles in critically ill patients: optimizing efficacy and reducing resistance development. Seminars in Respiratory and Critical Care Medicine. 36 (1), 136-153 (2015).
  7. Imani, S., Buscher, H., Marriott, D., Gentili, S., Sandaradura, I. Too much of a good thing: a retrospective study of beta-lactam concentration-toxicity relationships. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 72 (10), 2891-2897 (2017).
  8. Ventola, C. L. The antibiotic resistance crisis: part 1: causes and threats. Pharmacy & Therapeutics. 40 (4), 277-283 (2015).
  9. World Health Organization. Global Action Plan on Antimicrobial Resistance. , Available from: http://www.who.int/antimicrobial-resistance/global-action-plan/en (2015).
  10. Pulcini, C. Antibiotic stewardship: update and perspectives. Clinical Microbiology and Infection. 23 (11), 791-792 (2017).
  11. Cairns, K. A., et al. The impact of a multidisciplinary antimicrobial stewardship team on the timeliness of antimicrobial therapy in patients with positive blood cultures: a randomized controlled trial. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 71 (11), 3276-3283 (2016).
  12. Baur, D., et al. Effect of antibiotic stewardship on the incidence of infection and colonisation with antibiotic-resistant bacteria and Clostridium difficile infection: a systematic review and meta-analysis. Lancet Infectious Diseases. 17 (9), 990-1001 (2017).
  13. Roberts, J. A., Norris, R., Paterson, D. L., Martin, J. H. Therapeutic drug monitoring of antimicrobials. British Journal of Clinical Pharmacology. 73 (1), 27-36 (2012).
  14. Paal, M., Zoller, M., Schuster, C., Vogeser, M., Schutze, G. Simultaneous quantification of cefepime, meropenem, ciprofloxacin, moxifloxacin, linezolid and piperacillin in human serum using an isotope-dilution HPLC-MS/MS method. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 152, 102-110 (2018).
  15. Vogeser, M., Seger, C. Pitfalls associated with the use of liquid chromatography-tandem mass spectrometry in the clinical laboratory. Clinical Chemistry. 56 (8), 1234-1244 (2010).
  16. United States Pharmacopeia and National Formulary. Chapter <621>. CHROMATOGRAPHY (USP 37-NF 32 S1). , United Book Press, Inc. Baltimore, MD. 6376-6385 (2014).
  17. Wong, G., Sime, F. B., Lipman, J., Roberts, J. A. How do we use therapeutic drug monitoring to improve outcomes from severe infections in critically ill patients? BMC Infectious Diseases. 14, 288(2014).
  18. EUCAST: European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing. Information on clinical breakpoint tables. , Available from: http://www.eucast.org/clinical_breakpoints/ (2017).
  19. Surveillance der Antibiotika-anwendung und der bakteriellen Resistenzen auf Intensivstationen. SARI information for antibiotic consumption 2016 of all intensive care units participating at SARI. , Available from: http://sari.eu-burden.info/auswertung/down/AD-ZEIT.pdf (2016).
  20. Cefepime hydrochloride: Highlights of prescribing information. , Available from: https://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/Label/2016/050679s040lbl.pdf (2016).
  21. Meropenem: Highlights of prescribing information. , Available from: https://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/Label/2008/050706s022lbl.pdf (2006).
  22. Ciprofloxacin hydrochloride: Highlights of prescribing information. , Available from: https://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/Label/2016/019537s086lbl.pdf (2016).
  23. Moxifloxacin hydrochloride: Highlights of prescribing information. , Available from: https://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/Label/2010/021277s038lbl.pdf (2010).
  24. Linezolid: Highlights of prescribing information. , Available from: https://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/Label/2012/021130s028lbl.pdf (2011).
  25. Piperacillin and Tazobactam: Highlighs of prescribing information. , Available from: https://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/Label/2017/050684s88s89s90_050750s37s38s39lbl.pdf (2017).
  26. Zander, J., et al. Effects of biobanking conditions on six antibiotic substances in human serum assessed by a novel evaluation protocol. Clinical Chemistry and Laboratory. 54 (2), 265-274 (2016).
  27. Zander, J., et al. Quantification of piperacillin, tazobactam, cefepime, meropenem, ciprofloxacin and linezolid in serum using an isotope dilution UHPLC-MS/MS method with semi-automated sample preparation. Clinical Chemistry and Laboratory. 53 (5), 781-791 (2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

138 TDM

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved