الاشتقاق وتمايز الخلايا الجذعية الوسيطة المبيض الكلاب

Summary

هنا، نحن تصف طريقة للعزل والتوسع، وتمايز الخلايا الجذعية الوسيطة من أنسجة المبيض الكلاب البوليسية.

Abstract

وقد تزايد الاهتمام بالخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) على مدى العقد الماضي بسبب سهولة العزل والتوسع، والثقافة. في الآونة الأخيرة، أظهرت الدراسات قدرة التمييز على نطاق واسع التي تمتلك هذه الخلايا. المبيض يمثل مرشح واعدة للعلاجات المستندة إلى خلية يرجع ذلك إلى حقيقة أن غنية في MSCs، وأنه كثيرا ما يتم تجاهلها بعد العمليات الجراحية أوفاريكتومي كالنفايات البيولوجية. توضح هذه المقالة الإجراءات للعزلة، التوسع، والتفريق بين MSCs المستمدة من المبيض الكلاب البوليسية، دون الحاجة إلى فرز الخلايا التقنيات. ويمثل هذا البروتوكول أداة هامة للطب التجديدي بسبب انطباق واسع النطاق لهذه الخلايا اختلاف الغاية في التجارب السريرية والأغراض العلاجية.

Introduction

عدد الدراسات المنشورة التي تركز على الخلايا الجذعية قد زاد زيادة كبيرة على مدى العقد الماضي، مجهود بحثي قد تم تغذيها الهدف الجماعي لاكتشاف علاجات الطب التجديدي قوية. الخلايا الجذعية لديها علامات تعريف الأساسي هما: التجديد الذاتي والتمايز. الخلايا الجذعية الوسيطة هي المسؤولة عن دوران الأنسجة العادية وقدرة أكثر تقييداً من التمايز عند مقارنة بالخلايا الجذعية الجنينية¹. في الآونة الأخيرة، وقد أظهرت العديد من الدراسات مجموعة واسعة من التفريق بين MSCs، وموضوع قيد المناقشة عما إذا كانت هناك اختلافات بين الخلايا الجذعية الجنينية والكبار في كل².

ظهارة سطح أوفاريوم هو غير ملتزم بها طبقة من الخلايا، أقل نسبيا المتباينة، التي تعبر عن كل علامات الظهارية والوسيطة³، الاحتفاظ بالقدرة على التفريق في أنواع مختلفة من الخلايا في الاستجابة إلى ⁴من الإشارات البيئية. الموقع الدقيق للخلايا الجذعية في المبيض ليست معروفة جيدا؛ ومع ذلك، اقترح أن المتكفل بيبوتينتيال في الباجينا الغلالة تثير الخلايا الجرثومية⁵. الدراسات المناعية يكون الافتراض بأن هذه الخلايا اللحمية من أصل⁶ أو يقع في أو الدانية إلى سطح المبيض⁷. أن الخلايا الجذعية الوسيطة التعبير عن مستقبلات العديدة التي تلعب دوراً هاما في الخلية الالتصاق⁸، تجربة صمم لاختبار فرضية أن تحديد عدد الخلايا التي تحتوي على الانضمام السريع أن عزل أن خلايا وضوح تشاراكتيريزابل كالوسيطة في الطبيعة. في الآونة الأخيرة، ذكرت مجموعتنا اشتقاق MSCs من أنسجة المبيض استناداً إلى قدرتها على الانضمام إلى سطح البلاستيك طبق الثقافة في ح 3 الأول للثقافة، من أجل الحصول على عدد سكان المنقي للخلايا العارضة التصاق السريع⁹. وهنا يصف لنا الطريقة المتقدمة لعزل الخلايا الجذعية الوسيطة من أنسجة المبيض.

Protocol

وأجريت هذه التجربة مع المبايض أربعة كلاب أنثى مهجنة تبرعت بعد الجراحة الاختيارية في برنامج تعقيم الكلاب البوليسية. وأقر هذا تجربة "لجنة الأخلاقيات" في استخدام الحيوانات في أونيسب-فكاف (البروتوكول رقم 026991/13).

1-إعداد التجريبية

1. إعداد أو شراء 500 مل من مخزنة الفوسفات المالحة العقيمة دولبيكو (دببس) دون الكالسيوم أو المغنيسيوم.
2. إعداد كولاجيناز أنا الأسهم الحل عن طريق خلط 40 ميكروغرام للانزيم في 1 مل دببس. التصفية باستخدام عامل تصفية حقنه 0.2 ميكرون، وتخزين مختبرين 2 مل في-20 درجة مئوية.
3. تعد وسائل الإعلام ثقافة من المتوسطة (دميم) الجلوكوز تعديل النسر دولبيكو منخفضة مع المصل الجنيني 10% و 1% من المضادات الحيوية.
4. جمع مواد معقمة: الأطباق المقص والملقط، قارورة زراعة الأنسجة، وأنابيب ماصات 10 مل و 5 مل.
5. استخدام معدات المختبرات ثقافة الخلية القياسية: سلامة بيولوجية مجلس الوزراء (BSC)، حاضنة ثقافة خلية المحددة في 5% CO₂ و 38 درجة مئوية، ومن أجهزة الطرد مركزي.
6. تنظيف بكالوريوس العلوم: مع الأيدي القفاز، وتعقيم مع 70% EtOH، باستخدام مصابيح الأشعة فوق البنفسجية.

2-عزل الخلايا الجذعية الوسيطة من المبيض

1. بعد الجراحة، وإبقاء المبيض في برنامج تلفزيوني على الجليد في أنبوب مخروطي، حتى وصولها إلى المختبر.
2. شغل اثنان من أطباق بيتري 100 ملم مع 10 مل من برنامج تلفزيوني.
3. إزالة المبايض من الأنبوب ونقلها إلى طبق بتري الأول مع برنامج تلفزيوني. غسلها بخلط الحركات.
4. بلطف استرداد المبيض ووضعه في طبق آخر. مع ملاقط معقمة ومقص، فرم الأنسجة إلى قطع صغيرة جداً، حوالي 1 ملم في الحجم.
5. نقل أنسجة المبيض إلى 35 مم طبق بيتري وإضافة 2 مل كولاجيناز. فرم الأنسجة أكثر قليلاً.
6. ضع طبق بيتري في الحاضنة عند 38 درجة مئوية ح 3 وهزه بلطف طبق بيتري مع حركات دائرية كل 20 دقيقة.
7. بعد ح 3، إزالة طبق بيتري من الحاضنة.
8. نقل محتويات الطبق إلى أنبوب 15 مل. إضافة 5 مل من التوسع في وسائل الإعلام.
9. برفق عكس الأنبوب قبل الطرد المركزي. الطرد المركزي الأنبوب في ز 2100 x للحد الأدنى 7 إزالة المادة طافية وريسوسبيند بيليه مع 3 مل من التوسع في وسائل الإعلام.
10. نقل بيليه إلى زجاجة T25. ضع الزجاجة في الحاضنة مع 5% CO₂ في 38 درجة مئوية ح 3.
    ملاحظة: أهم جزء من الإجراءات لتغيير وسائل الإعلام بعد ح 3 من الحضانة.
11. قم بإزالة الزجاجة من الحاضنة ووسائط الإعلام مع الأنسجة المتبقية. إضافة 3 مل من توسع جديدة وسائل الإعلام إلى الزجاجة.
12. تغيير وسائل الإعلام كل 48 ساعة ومراقبة الزجاجة لالتقاء الخلوية.
    ملاحظة: يمكن ملاحظة الخطوات الرئيسية لهذا الإجراء في الشكل 1.

3-توسيع نطاق خلايا الجذعية الوسيطة من المبيض

1. مرور الخلية
   1. عندما تصل الخلايا إلى التقاء، قم بإزالة الوسائط من الزجاجة.
   2. تغسل الزجاجة مع 3 مل من برنامج تلفزيوني. قم بإزالة برنامج تلفزيوني.
   3. إضافة 1.5 مل التربسين ووضع الزجاجة في الحاضنة عند 38 درجة مئوية للحد الأدنى 3 اضغط برفق زجاجة لمساعدة الخلايا لفصل.
      ملاحظة: الخلايا ينبغي التوصل إلى التقاء ما يقرب من 5-7 د بعد الطلاء الأولى.
   4. أضف 3 مل من التوسع في وسائل الإعلام ونقل المحتويات إلى أنبوب مخروطي.
   5. الطرد المركزي الأنبوب في 2100 س ز للحد الأدنى 7 إزالة المادة طافية وإضافة 1 مل من التوسع في وسائل الإعلام.
   6. مجانسة محتويات الأنبوبة برفق.
   7. تأخذ قاسمة 10 ميليلتر من العينة لأداء الخلية العد ووضع الأنبوب مع الخلايا في الحاضنة.
   8. المكان 10 ميليلتر من هذا المزيج إلى هيموسيتوميتير.
2. عد الخلايا
   1. استخدام 10 X الهدف المجهر والتركيز على خطوط الشبكة هيموسيتوميتير.
   2. عد الخلايا الموجودة في المربعات الصغيرة الخمس (الشكل 2).
   3. مضاعفة عدد الأصوات التي تم فرزها حسب 50,000 لتقدير عدد الخلايا في المليلتر.

4-التفريق بين الخلايا الجذعية الوسيطة من المبيض

ملاحظة: أجريت فحوصات التفريق وفقا للمبادئ التوجيهية المحددة في تلة et al. ⁹.

1. البذور 1.0 × 10⁴ خلايا كل جيدا، في ثلاث نسخ، استخدام طبق ثقافة 4-جيدا.
2. أضف 1 مل من التوسع في وسائل الإعلام.
3. تحرض الطبق مع حركات دائرية بلطف.
4. بعد 24 ساعة، استبدال الوسائط الثقافة مع وسائط الإعلام التمايز المرغوب فيه.
5. أوستيوجينيك، أديبوجينيك، والتفريق بين تشوندروجينيك، احتضان الخلايا مع وسائط الإعلام التعريفي لمد 30، مع استبدال الوسائط واستخدمت كل مجموعات محددة التمايز دال 3 لكل من هذه الاختبارات.
6. للتفريق بين النسب العصبية، احتضان الخلايا د 10 في وسائط الإعلام التعريفي، مع استبدال الوسائط كل 3 د. الوسائط المستخدمة هنا الواردة دميم الجلوكوز منخفضة حمض فالبرويك مم 2، 1 ميكرومتر الهيدروكورتيزون، 10 فورسكولين ميكرومتر، كلوريد البوتاسيوم 5 مم، 5 ميكروغرام/مل الأنسولين و hydroxyanisole بوتيل 200 ميكرومتر.
7. للسلائف الأنسجة، واحتضان لمد 5 في وسائل الإعلام الأنسجة وفقا لإرشادات الشركة المصنعة كاشف.
8. للتفريق بين نسب الخلايا البدائية، احتضان الخلايا في وسائط الإعلام التعريفي لمد 14، مع استبدال الوسائط كل 3 د. الوسائط المستخدمة هنا الواردة دميم، 10% FBS، بيروفات صوديوم 1 مم، 10 نانوغرام/مل ليف، الأحماض الأمينية غير الأساسية 1 مم، 2 مم L-الجلوتامين، 5 ميكروغرام/مل الأنسولين، مم 0.1 بيتا-ميركابتوثانول، 60 ميكرومتر بوتريسسيني، 20 ميكروغرام/مل ترانسفيرين، 10 نانوغرام/مل الماوس البشرة النمو عامل، 1 نانوغرام/مليلتر البشرية عامل النمو تنتجها الخلايا الليفية الأساسية، 40 نانوغرام/مليلتر الإنسان الدبقية الخلية المستمدة من خط نيوروتروفيك عامل، والبنسلين 15 مغ/لتر.

النتائج

عزل الخلايا الجذعية الوسيطة من الكلاب المبيض:

ويرد الإجراء عزلة MSC المبيض في الشكل 1. بعد الجراحة، وتنميق الأنسجة، والهضم كولاجيناز، وتغيير الإعلام ح 3 بعد بداية الثقافة، كان عدد سكانها MSC المفترضة مع خصا...

Discussion

وهنا نحن نقدم الأدلة أن MSCs يمكن أن تكون معزولة من أنسجة المبيض الكلاب البوليسية، التي تعتبر النفايات البيولوجية بعد أوفاريكتومي. يرجع ذلك إلى حقيقة أن العديد من أنواع الخلايا ويمكن الاطلاع في المبيض، اقترحنا بروتوكول لتحديد MSCs على أساس على الانضمام السريع للبلاستيك، والتي نجحت بتحديد ال...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DPBS	Thermo Fisher	14190144
Collagenase I	Thermo Fisher	17100017
Tissue flask	Corning	CLS3056
DMEM low glucose	Thermo Fisher	11054020
FBS	Thermo Fisher	12484-010
TrypLE express	Thermo Fisher	12604021
StemPro Adipogenesis Differentiation Kit	Thermo Fisher	A1007001
StemPro Chondrogenesis Differentiation Kit	Thermo Fisher	A1007101
StemPro Osteogenesis Differentiation Kit	Thermo Fisher	A1007201
STEMdiff Definitive Endoderm Kit	StemCell	5110
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher	15070063
CD45	AbD Serotec	MCA 2035S
CD34	AbD Serotec	MCA 2411GA
CD90	AbD Serotec	MCA 1036G
CD44	AbD Serotec	MCA 1041
Nestin	Milipore	MAB353
β-Tubulin	Milipore	MAB1637
DDX4	Invitrogen	PA5 -23378
IgG- FITC	AbD Serotec	STAR80F
IgG- FITC	AbD Serotec	STAR120F