أساليب لتقييم دور ج-المنحدر و Dusp1 في الاعتماد على السرطاني

Summary

هنا، يمكننا وصف بروتوكولات المصادقة الوراثية والكيميائية ج-المنحدر و Dusp1 كهدف المخدرات في سرطان الدم باستخدام الماوس الوراثية وأنسنة في المختبر والمجراه في نماذج. يمكن تطبيق هذا الأسلوب لأي هدف للتحقق من الصحة الوراثية والتنمية العلاجية.

Abstract

مظاهرة تيروزين كيناز مثبطات (تكيس) في علاج سرطان الدم النقوي المزمن (CML) وقد يبشر بعهد جديد في علاجات السرطان. ومع ذلك، عدد صغير من الخلايا لا تستجيب ل TKI العلاج، أسفر عن الأمراض المتبقية الحد الأدنى (MRD)؛ فشل تكيس حتى أقوى للقضاء على هذه الخلايا. هذه الخلايا MRD بمثابة مستودع تطوير مقاومة للعلاج. ولا يعرف لماذا غير فعال ضد الخلايا MRD TKI العلاج. عامل النمو مما يشير إلى تورط في دعم بقاء الخلايا MRD أثناء TKI العلاج، ولكنها تفتقر إلى فهم ميكانيكية. الدراسات التي أجريت مؤخرا أظهرت أن المنحدر ج مرتفعة وتعبير Dusp1 نتيجة متقاربة النمطان وعامل النمو الإشارات في الخلايا MRD التوسط المقاومة TKI. يجعل التضليل الحساسة رائع تكيس تثبيط الوراثية والكيميائية ج-المنحدر و Dusp1 ويشفي التضليل في كلا النموذجين الوراثي وأنسنة الماوس. وقد حددنا هذه الجينات المستهدفة باستخدام عدة [ميكروارس] من TKI-حساسة-وخلايا مقاومة. هنا، نحن نقدم طرق للتحقق من صحة الهدف باستخدام الماوس في المختبر والمجراه في النماذج. يمكن بسهولة تطبيق هذه الأساليب على أي هدف للتحقق من الصحة الوراثية والتنمية العلاجية.

Introduction

يؤدي النشاط كيناز تيروزين التأسيسي للمركز-ABL1 الانصهار السرطاني التضليل، الذي يوفر الأساس منطقي لاستهداف النشاط كيناز بمثبطات جزيء صغير. نجاح تكيس في علاج مرضى CML أحدثت ثورة في مفهوم العلاج المستهدفة^1،2. وفي وقت لاحق، قد وضعت كيناز المضادة العلاج كدواء الدقة لعدة الأورام الخبيثة الأخرى، بما في ذلك الأورام الصلبة. وحتى الآن، أكثر من ثلاثين kinase مثبطات أقرها "المتحدة الدولة إدارة الأغذية والعقاقير" لعلاج الأورام الخبيثة المختلفة. بينما TKI العلاج فعالة جداً في القضاء على هذا المرض، إلا أنها ليست العلاجية. وعلاوة على ذلك، استمر عدد صغير من الخلايا السرطانية أثناء فترة العلاج:^4،3،5. وبقي حتى المرضى الذين أظهر مغفرة كاملة مع MRD، التي قمعت في نهاية المطاف نتائج في الانتكاس إذا لم يكن بشكل مستمر. ولذلك، يلزم القضاء على الخلايا MRD لتحقيق استجابة دائمة أو العلاجية. التضليل يمثل نموذجا قيماً لتعريف مفهوم الطب الدقة، وآليات أونكوجينيسيس والعلاجات الموجهة الهدف الرشيد، وتطور المرض والمقاومة للعقاقير. ومع ذلك، وحتى اليوم، إليه القيادة موت الخلايا المستحثة TKI في الخلايا السرطانية ليست مفهومة تماما، ولا لماذا MRD الخلايا (التي تتألف من الخلايا الجذعية ليوكيميك []) مقاومة جوهريا تكيس^4،6. على الرغم من ذلك، هو ظاهرة "السرطاني الاعتماد" إلى أونكوبروتين كيناز متحولة المتورطين في فعالية TKI حيث يسبب تثبيط السرطاني المستهدفة تكيس الحاد حدوث صدمة النمطان التي تؤدي إلى استجابة بروابوبتوتيك ضخمة أو التتابع في الخلية طريقة تعتمد على السياق^6،7،،من⁸⁹. ومع ذلك، تفتقر إلى الأساس آليا للاعتماد السرطاني. وقد تورط الدراسات الأخيرة أن إشارات عامل النمو ويلغي الاعتماد السرطاني ويضفي عليه مقاومة TKI العلاج^10،،من¹¹¹². ولذلك، للحصول على نظرة ثاقبة إليه الاعتماد السرطاني، أجرينا التعبير كل الجينوم التنميط من المركز-ABL1 مدمن والخلايا نوناديكتيد (نمت مع عوامل النمو)، التي كشفت عن أن ج-المنحدر و Dusp1 من الوسطاء الحرجة من إدمان السرطاني¹³. حذف الوراثية ج-المنحدر و Dusp1 الخلايا القاتلة للتعبير عن ABL1 بنك الاصطناعية والفئران استخدمت في التجربة لم يطور سرطان الدم. وعلاوة على ذلك، شُفي تثبيط ج-المنحدر و DUSP1 بمثبطات جزيء صغير التضليل التي يسببها ABL1 بنك في الفئران. وتبين النتائج أن مستويات التعبير ج-المنحدر و Dusp1 بتحديد عتبة أبوبتوتيك في الخلايا السرطانية، حيث أن المستويات الأدنى يضفي حساسية المخدرات بينما تسبب ارتفاع مستويات مقاومة للعلاج¹³.

تحديد الجينات القيادة الاعتماد السرطاني، أجرينا عدة التعبير كل الجينوم التنميط تجارب حضور عامل النمو و TKI (imatinib) باستخدام كلا الماوس-والتضليل المستمدة من المريض خلايا (K562). وجرى تحليل هذه البيانات بالتوازي مع التضليل المريض مجموعات البيانات التي تم الحصول عليها من CD34⁺ الخلايا الجذعية المكونة للدم قبل وبعد العلاج مع imatinib. كشف هذا التحليل عن ثلاثة جينات (عامل النسخ [ج-المنحدر]، وخصوصية المزدوج الفوسفاتيز 1 [Dusp1]، والحمض النووي الريبي ملزمة بروتين [Zfp36]) الذي يشيع أوبريجولاتيد في خلايا مقاومة TKI. للتحقق من أهمية هذه الجينات في منح المقاومة للعقاقير، قمنا بتنفيذ التحليل في المختبر و في فيفو خطوة بخطوة. وأكدت مستويات التعبير هذه الجينات قبكر في الوقت الحقيقي (RT-qPCR) وغربي النشاف في خلايا مقاومة للأدوية. علاوة على ذلك، كدنا overexpression وضربه قاضية بدبابيس الشعر شرنا من ج-المنحدر، Dusp1، و Zfp36 كشفت أن مرتفعة ج-المنحدر والتعبيرات Dusp1 الكافية واللازمة لمنح المقاومة TKI. ولذلك، أجرينا المجراة في التحقق من صحة باستخدام نماذج الماوس مع ج-المنحدر و Dusp1 فقط. للتحقق من الصحة الوراثية ج-المنحدر و Dusp1، ونحن إنشاء روساكريرت-إيندوسيبلي ج-المنحدر^fl/fl الفئران (خروج المغلوب الشرطي)¹⁴ وعبرت لهم مع Dusp1^-/- (خروج المغلوب على التوالي)¹⁵ جعل ROSACreERT2-ج--المنحدر^fl/fl Dusp1^-/- الفئران المعدلة وراثيا مزدوجة. الخلايا المشتقة من نخاع العظم ج-كيت⁺ (من ج-المنحدر^{fl/فلوريدا}-، Dusp1^--/----، وج-المنحدر^fl/flDusp1^--/--) معربا عن المركز-ABL1 قد تم تحليلها في المختبر في تشكيل مستعمرة المقايسة وحدة (زيمبابوي)، و في فيفو بزرع نخاع العظام في الفئران المشععة قاتلة، لاختبار شرط ج-المنحدر و Dusp1 منفردة أو مجتمعة في تطور سرطان الدم. وبالمثل، الموانع الكيميائية ج-المنحدر من DFC (ديفلوريناتيد الكركمين)¹⁶ و Dusp1 من BCI (benzylidene-3-(cyclohexylamino)-2,3-dihydro-1H-inden-1-one)¹⁷ تم اختبارها في المختبر والمجراه في استخدام المركز-ABL1-الإعراب عن، العظام الخلايا المشتقة من نخاع ج-كيت⁺ من الماوس (WT) البرية من نوع. لتأكيد شرط ج-المنحدر و Dusp1 في الخلايا الجذعية ليوكيميك، نحن تستخدم نموذج ماوس التضليل حيث حملت ABL1 المركز على وجه التحديد في خلاياه الجذعية الدوكسي (تعرب عن ترانساكتيفاتور تيت تحت الخلايا الجذعية موريني اللوكيميا (SCL) الجين 3 ' محسن لائحة)^18،19. قمنا باستخدام نخاع العظام لين^–الخلايا Sca⁺⁺ (LSK) ج-مجموعة من هذه الفئران في مقايسة المجراة في زرع. وعلاوة على ذلك، أنشأنا مستويات فوبشو-p38 والتعبير عن إيل-6 كالمؤشرات الحيوية الديناميكية دراسة معمقة من العقاقير Dusp1 وتثبيط ج-المنحدر، على التوالي، في فيفو. وأخيراً، توسيع نطاق الدراسة للبشرية أهمية، المستمدة من المريض CD34⁺ الخلايا (ما يعادل الخلايا ج-كيت⁺ من الفئران) كانت تعرض على المدى الطويل في المختبر الشروع في ثقافة الخلية فحوصات (لتسيك) ونموذج ماوس أنسنة المجراة في التضليل^20،21. تم زرع الفئران العوز مع التضليل CD34 + الخلايا، متبوعاً بالعلاج من تعاطي المخدرات وتحليل لبقاء الخلية ليوكيميك البشرية.

في هذا المشروع، نقوم بوضع أساليب لتحديد الهدف وعمليات التحقق من الصحة باستخدام الأدوات الجينية والكيميائية على حد سواء، باستخدام نماذج الإكلينيكية المختلفة. يمكن تطبيق هذه الأساليب بنجاح التحقق من صحة الأهداف الأخرى تطوير الطرائق الكيميائية للتنمية العلاجية.

Protocol

أجريت جميع التجارب على الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك) في المستشفى الطبي مركز (كتشمك سينسيناتي الأطفال). العينات البشرية (BM عادي وأنه من التضليل (p210-المركز-ABL +) اللوكيميا) تم الحصول عليها عن طريق البروتوكولات التي وافق عليها "مجلس المراجعة المؤسسية" (مجلس المراجعة المؤسسية: المركز الطبي في مستشفى فيديرالويدي ضمان #00002988 سينسيناتي الأطفال) و موافقة الجهات المانحة-وأبلغ من كتشمك وجامعة سينسيناتي.

1-في الوقت الحقيقي قبكر التحليل

1. عزل الحمض النووي الريبي مجموع من الخلايا BaF3 المتنامية في ربمي تكملة مع 10% FBS و 10% WEHI قضى الثقافة المتوسطة كمصدر انترلوكين-3 (إيل-3).
2. حصاد الخلايا في مرحلة لوغاريتمي (99% على قيد الحياة) من المعالجة (إيل-3 و imatinib) وكذلك من عينات غير المعالجة، والطرد المركزي لهم في 435 س ز لمدة 3 دقائق. الصحية ومراحل نمو الخلايا حاسمة لملفاتهم التعبير الجيني يمكن أن يتغير بشكل كبير.
3. عزل الحمض النووي الريبي بتنقية الحمض النووي الريبي إجمالي²². التحديد الكمي للجيش الملكي النيبالي المجموع؛ ثم، إخضاعه ل معاملة الدناز²³. تحويل كميات متساوية من خالية من الحمض النووي الريبي (2 ميكروغرام) إلى كدنا مع المنتسخة العكسية²⁴.
4. أداء قبكرس مع الإشعال الخاصة بالجينات (الجدول 1). القيام بتقارير إتمام المشروعات في 20 ميليلتر التفاعلات في 0.2 مل، رقيقة الجدران أنابيب PCR مع قبعات الضوئية، بوليميراز 1 x استخدام مزيج (انظر الجدول للمواد)، 0.5 ميكرون لكل التمهيدي، 1 ميليلتر من الحمض النووي، والمياه. ضع رد فعل في ثيرموسيكلير مع دورة التالية: الخطوة 1، 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق؛ الخطوة 2، 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية؛ الخطوة 3 في 60 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة؛ الخطوة 4، كرر الخطوات من 2-3 مرات 40. أداء جميع تقارير إتمام المشروعات في تريبليكاتيس وتطبيع البيانات في الوقت الحقيقي للتعبير β أكتين قبل التآمر.

2-الغربية النشاف

ملاحظة: أعدت مقتطفات كامل الخلية بإضافة 250 ميليلتر من 1 × تحلل المخزن المؤقت كما هو موضح في كيسارواني et al.¹³ تستكمل مع مثبط البروتياز كوكتيل، ومثبطات الفوسفاتيز 2 كوكتيل.

1. حصاد الخلايا BaF3 5 مليون في مرحلة لوغاريتمي (99% على قيد الحياة) من معاملة (إيل-3 و imatinib) فضلا عن الخلايا من BaF3 غير المعالجة بالطرد المركزي في 435 س ز لمدة 3 دقائق في 4 درجات مئوية. الخلايا الموجودة في المخزن المؤقت تحلل (250 ميليلتر) من بيبيتينج صعودا وهبوطاً x 1، متبوعاً حضانة 5 دقيقة عند 80 درجة مئوية. Sonicate لكسر جميع الحمض النووي مع البقول 5 – 6 من 5 s كل في غرفة باردة في 4 درجات مئوية.
2. نقل إلى أنبوب 1.5 مل والطرد المركزي أنه في س 16,000 ز لمدة 5 دقائق لإزالة أي مواد غير قابلة للذوبان. ويمكن تخزين الاستخراج في-80 درجة مئوية حتى الاستخدام. عينات الحرارة إلى 80 درجة مئوية لمدة 5 دقائق في كتلة حرارة قبل التحميل. تحميل 10 ميليلتر من العينة باستخدام تلميح هلام-تحميل على جل الحزب الديمقراطي الصربي صفحة 10%.
3. حل البروتينات في 150 الخامس حتى صبغ إشارة تصل إلى الجزء السفلي من الجل. نقل البروتين للأغشية النيتروسليلوز نقل الغرواني الكهربي في 1 أمبير ح 1. بعد النقل، كتلة الأغشية في 1 × تريس مخزنة المالحة + 0.1% 20 توين (تبسة) مع الحليب غير الدسم 5% ح 1 والتحقيق بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية مع الأجسام المضادة المناسبة في إضعاف 1:1,000.
4. غسل الأغشية 3 x 5 x مع تبسة لمدة 10 دقائق في كل؛ ثم، من التحقيق مع مترافق HRP مناسبة ثانوي جسم (1:5، وتمييع 000) في درجة حرارة الغرفة ح 1. مقدار تبسة المستخدمة يعتمد على حجم الحاوية. تأكد من غمر الغشاء في تبسة تماما. أغسل جسم الثانوي 3 x ل 5 دقائق مع تبسة.
5. وضع وصمة عار باستخدام كاشف الركيزة تشيميلومينيسسينت. مزيج من كميات متساوية من الركيزة والمخزن المؤقت من زجاجتين، الحق قبل الاستخدام. إضافة الركازة إلى الجزء العلوي من الغشاء الذي يغطي الغشاء كله مع ماصة 1 مل واحتضان لمدة 1 دقيقة. وينبغي أن تصويرها البقع داخل 1 – 10 دقيقة من إضافة الركازة.
6. استخدام الملقط حادة، بعناية مكان الغشاء على منصة نظام التصوير (انظر الجدول للمواد)، تجنب الكثير من السائل. حدد طريقة عرض لايف واختر البقع وتشيميلومينيسسينسي من القائمة. استخدام اقتناء اليدوي، الحصول على التعرض لأخطار متعددة في نقاط زمنية مختلفة. هذه الملفات يمكن تصور وقياسها كمياً باستخدام برامج التصوير.

3-جيل فئران خروج المغلوب

1. عبر الفئران ج-المنحدر^fl/fl مع الفئران ROSACreERT2 لتوليد المنحدر ROSACreERT2c^fl/fl الفئران¹³. لإنشاء الفئران (كو) مزدوجة-خروج المغلوب، تولد الفئران^fl/fl المنحدر ROSACreERT2c مع Dusp1^--/-- الفئران لتوليد المنحدر ROSACreERT2c^fl/fl Dusp1^--/-- الفئران¹³. النمط الوراثي الفئران بذيل القصاصات التي تليها بكر، كما هو موضح أدناه.
2. الوراثي:
   1. إعداد الحمض النووي ومقطع جزء صغير جداً من الذيل مع المقص ووضعه في أنبوب 1.5 مل. كوي الذيل مع مقص ساخنة. إضافة 200 ميليلتر من 50 مم هيدروكسيد الصوديوم بذيل المقطوعة في الأنبوب واحتضان عند 95 درجة مئوية في كتلة حرارة ح 1.
   2. دوامة الأنبوب جيدا، وتحييد ثم قم بإضافة 50 ميليلتر من 1 M HCl تريس الأس الهيدروجيني 6.8 ودوامه مرة أخرى. الطرد المركزي الأنبوب بأقصى سرعة لمدة 1 دقيقة.
   3. القيام بتقارير إتمام المشروعات في ردود الفعل ميليلتر 20 مل 0.2، رقيقة الجدران أنابيب PCR باستخدام 1 x Taq بوليميريز الرئيسي مزيج يحتوي على صبغ، 0.5 ميكرون لكل التمهيدي، 1 ميليلتر من الحمض النووي، والمياه. وضع الأنابيب في ثيرموسيكلير وتشغيل دورات المناسبة كما هو موضح في الجدول 2.
   4. تشغيل المنتج بكر على 2% [اغروس] هلام والصورة باستخدام نظام توثيق هلام.

4-عزل الخلايا ج-كيت⁺ من نخاع العظام

1. التضحية الفئران وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية.
   ملاحظة: هنا، تعرضت الفئران لثاني أكسيد الكربون (CO₂) في وفقا وبرايتون أوصت معدل التدفق حتى تقرر الموت بوقف التنفس وضربات القلب، متبوعة بخلع عنق الرحم.
2. حصاد الساقالعظام من الماوس — قصبة اثنين، وهما تيبياس، إيلياكس اثنين. نظيفة من جميع الأنسجة من العظام كشط بعيداً مع مشرط. وضع عظام الساق في برنامج تلفزيوني الباردة 1 x على الجليد – 5 مل في أنبوب 15 مل. صب محتويات الأنبوبة في قذيفة هاون وسحق مع مدقة.
3. تصفية تعليق خلية من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر في أنبوب 50 مل ملولبة مع ماصة 10 مل المرفقة، باستخدام ماصة. أغسل بقذائف الهاون والمدقة عدة مرات مع برنامج تلفزيوني الباردة x 1، جمع وإضافة تعليق خلية في أنبوب 50 مل. تدور أسفل نخاع العظام في س 1,200 ز في 4 درجات مئوية عن أدنى 5 إزالة طاف عبر فراغ مع ماصة زجاجية تعلق. تعليق بيليه الخلية في 5 مل من برنامج تلفزيوني x 1 مع ماصة.
4. مع ماصة، إضافة معلقة نخاع العظام ببطء إلى الأعلى من 5 مل من درجة حرارة الغرفة (ودرجة الحرارة الحرجة) بوليسوكروسي، أخذ عناية كبيرة ليس تعكير الواجهة. تدور في 400 x ز في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة مع إيقاف تشغيل الفرامل.
5. جمع واجهة الخلية مونو النووية مجموع غائم (تمنك) مع ماصة ووضعه في أنبوب 15 مل جديدة. جلب الحجم يصل إلى 10 مل مع برنامج تلفزيوني 1 x للغسيل، أخذ 20 ميليلتر للعد، وتدور في 1,200 س ز في 4 درجات مئوية عن أدنى 5 تجاهل المادة طافية وحفظ بيليه على الجليد للخطوة 4.6.1.
6. أداء ج-كيت⁺ خلية العزلة.
   1. متابعة بروتوكول كيت ميكروبيد ج-كيت⁺ خلية العزلة. ريسوسبيند بيليه الخلية في ميليلتر 80 1 x برنامج تلفزيوني + يدتا + جيش صرب البوسنة إلى 10⁷ الخلايا. لتعليق خلية، قم بإضافة 20 ميليلتر CD117 ميكروبيدس/10⁷ مجموع الخلايا. مزيج جيد من قبل فورتيكسينج واحتضان لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية. جلب الحجم يصل إلى 10 مل بإضافة 1 × برنامج تلفزيوني + يدتا + جيش صرب البوسنة وتدور في 1,200 س ز عند 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
   2. إزالة المادة طافية عبر فراغ وتعليق بيليه الخلية في 500 ميليلتر/10⁸ خلايا الكلية في برنامج تلفزيوني 1 x + يدتا + جيش صرب البوسنة. استخدام حامل المغناطيس مع العمود المغناطيسي المرفقة، أضف 3 مل 1 × برنامج تلفزيوني + يدتا + جيش صرب البوسنة والسماح لها بالتدفق من خلال عن طريق الجاذبية إلى أنبوب جمع 15 مل.
   3. وبمجرد الانتهاء من إضافة المخزن المؤقت الأول يمر عبر العمود، إضافة تعليق خلية في العمود، السماح لها بالتدفق من خلال عبر الجاذبية في أنبوب جمع 15 مل. فلووثروغ هذا هو الكسر الخلية غير مرغوب فيها.
   4. تغسل من العمود 3 مرات مع برنامج تلفزيوني 1 x مل 3 + يدتا + جيش صرب البوسنة في كل مرة، مما يسمح لها بالتدفق من خلال عبر الجاذبية في أنبوب جمع. إزالة العمود من المغناطيس ووضعه على الجزء العلوي من أنبوب 15 مل.
   5. إضافة 5 مل 1 × برنامج تلفزيوني + يدتا + جيش صرب البوسنة، وطرد فورا مع المكبس المقدمة مع العمود. إزالة المكبس وكرر دافق مع مل 5 إضافية من 1 × برنامج تلفزيوني + يدتا + جيش صرب البوسنة. عد الخلايا في الحجم الإجمالي باستخدام الطرق القياسية.
   6. وتدور أسفل الخلايا في 1,200 س ز في 4 درجات مئوية عن أدنى 5 إزالة المادة طافية ريسوسبيند بيليه في إيمدم كاملة (إيمدم + 10% FBS + إيل-6 [10 نانوغرام/مل] + + سوف [50 نانوغرام/مل] + [20 نانوغرام/مل] [ليغند] FLT3 إيل-3 [10 نانوغرام/مل]) للثقافة. ثقافة هذه الخلايا المبيت في 2 × 10⁶ خلايا/1 مل من الخلية إيمدم وسائل الإعلام كاملة بوضعها في حاضنة في 37 درجة مئوية و 5% CO₂.

5-توصيل

1. تعداء بلازميد النسخ العكسي
   1. طازجة إذابة الخلايا HEK293 بعد ظهر اليوم قبل في حمام مائي تعيين إلى 37 درجة مئوية. وتدور كريوتوبي تحتوي على خلايا HEK في 435 س ز في درجة حرارة الغرفة للحد الأدنى 3 إزالة طاف عبر فراغ تعليق بيليه الخلية في 1 مل دميم وتستكمل مع 10% FBS، البنسلين، ستربتوميسين، والجلوتامين.
   2. عد الخلايا، وإضافة وحدة التخزين المناسبة لطبق 10 سم تعامل (~ 4 × 10⁶ HEK293T الخلايا). إضافة 14 مل 10 دميم وسائل الإعلام إلى الطبق ومزجها جيدا قبل الانزلاق صعودا وهبوطاً للمساواة في توزيع. ضع الطبق في 37 درجة مئوية، 5% CO₂ حاضنة بين عشية وضحاها.
   3. في صباح اليوم التالي، تحقق التقاء الخلايا تحت مجهر خفيفة مقلوب (50% أو أكثر يعمل بشكل جيد).
   4. تجمع الحمض النووي (بلازميد النسخ العكسي المطلوب)، بكليكو (تغليف بلازميد)، كاكل 2 م₂وح₂0 في أنبوب 1.5 مل (= 500 ميليلتر) باستخدام ميكروبيبيتي بالمبالغ التالية: 7.5 ميكروغرام للحمض النووي (المركز-ABL1-يفب)، 7.5 ميكروغرام من بكليكو، ميليلتر 62 م 2 كاكل₂ ، والماء لوحدة تخزين نهائي من 500 ميليلتر. إضافة 500 ميليلتر من x HBS 2 إلى آخر 1.5 مل الأنبوبة.
   5. إضافة الحمض النووي مزيج dropwise إلى 1.5 مل الأنبوب الذي يحتوي على 500 ميليلتر من x HBS 2 (مم 280 كلوريد الصوديوم و 100 مم هيبيس و 1.5 مم نا₂هبو₄) بينما خلط. تحقيق ذلك عن طريق إعداد دوامة إلى أقل سرعة وأنبوب ميزانيات على أنه عقد لخلط مستمر أثناء إضافة مزيج تعداء.
   6. السماح لهذا المزيج تعداء لاحتضان لمدة 20 – 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. أثناء الاحتضان، إضافة 25 نانومتر الكلوروكين للخلايا HEK ووضعها مرة أخرى في الحاضنة. بعد الاحتضان، إضافة مزيج تعداء الخلايا HEK دروبويسي، وثم بلطف دوامة وسائل الإعلام لخلط المزيج تعداء في جميع أنحاء اللوحة.
   7. احتضان الخلايا مع هذا المزيج ح ~ 8 في 37 درجة مئوية، 5% CO₂ حاضنة. تغيير وسائط الإعلام بشأن هذه الخلايا بإضافة ببطء شديد مل 14 الطازجة 10 دميم وسائط. بيبيتينج ببطء ضد الجدار للطبق يساعد على منع أي تجريد الخلايا HEK. احتضان الخلايا بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية، 5% CO₂ حاضنة.
   8. جمع المادة طافية الفيروسية مع حقنه 10 مل ورسم المادة طافية في المحاقن، وإرفاق عامل التصفية حقنه 0.45 ميكرومتر. يغرق المادة طافية الفيروسية في أنبوب مجموعة جديدة. أن أول مجموعة من ح ~ 16 طاف الفيروسية في وقت لاحق.
2. تركيز فيبرونيكتين الفيروسية وتوصيل
   1. إضافة 2 مل جزء فيبرونيكتين البشري الماشوب 0.1 مغ في برنامج تلفزيوني 1 x إلى ألواح غير المعالجة 6-بئر الثقافة. إعداد قدر فيبرونيكتين حسب الحاجة، والذي يعتمد على العدد من الخلايا والأنماط الجينية. واحد جيد يمكن بما فيه الكفاية ترانسدوسي 10 مليون ج-كيت⁺ الخلايا. احتضان لوحة بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
   2. في اليوم التالي، إزالة فيبرونيكتين من الآبار مع ماصة, ماصة 2 مل من جيش صرب البوسنة 2% العقيمة في برنامج تلفزيوني 1 x كتلة اللوحة، واحتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. إزالة جيش صرب البوسنة عبر فراغ وتغسل جيدا قبل بيبيتينج 2 مل من 1 x برنامج تلفزيوني ثم إزالته عن طريق فراغ.
   3. فور إضافة الطازجة التي تم جمعها وتصفيتها (في 0.45 ميكرومتر) الفيروسية طافية ما يصل إلى 5 مل. الطرد المركزي في 435 س ز على 32 درجة مئوية على حاء 2 إزالة طاف عبر فراغ، وكرر هذه الخطوة مع إضافية من المادة طافية الفيروسية جمعها طازجة وتدور مرة أخرى. إزالة طافية عبر فراغ وغسل الآبار بإضافة 2 مل من 1 x PBS؛ ثم إزالته عن طريق فراغ.
   4. إضافة خلايا الماوس ج-كيت⁺ أن مثقف بين عشية وضحاها (الخطوة 4.6.6) إلى الآبار المغلفة الفيروسية خلط تعليق الخلية جيدا وبيبيتينج لهم في لوحة الفيروسية فيبرونيكتين تتركز الآن. تدور في 1,200 س ز عند 25 درجة مئوية عن 90 دقيقة وضع الخلايا في 37 درجة مئوية، 5% CO₂ حاضنة.
   5. بوستترانسدوكشن ح 48، بيليه الخلايا باستخدام الطرد المركزي في 1,200 س ز عند 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق وريسوسبيند لهم في نظام مراقبة الأصول الميدانية المخزن المؤقت #1 (برنامج تلفزيوني x 1 + 0.5% جيش صرب البوسنة) إلى 6 × 10⁶/mL. تحديد النسبة المئوية للخلايا إيجابية المركز-ABL1 بقياس النسبة المئوية يفب إيجابية باستخدام التدفق الخلوي.
   6. الحصول على الأحداث مع الإجراء القياسي. أولاً، بوابة الخلايا الحية استناداً إلى مبعثر أمامية وجانبية. ثم، بوابة الخلايا الحية الإيجابية يفب باستثناء يفب-نيجاتيفيسيلس تحددها السيطرة السلبية (الشكل 4).

6-تشكيل مستعمرة أونيتاسايس

1. ذوبان الجليد methylcellulose مع السيتوكينات للماوس في درجة حرارة الغرفة لمل حاء – 1 – 2 3 الكوة من ميثيلسيلولوسي في أنبوب نظام مراقبة الأصول الميدانية باستخدام حقنه 5 مل دون إبرة. فرز الخلايا يفب إيجابية على أرز خلية.
2. وتدور الخلايا أسفل تعليق بيليه في وسائل الإعلام كاملة إيمدم. عد الخلايا يكون مطلي وتمييع لهم الحصول على الخلايا إيجابية يفب 5,000 في 100 ميليلتر من إيمدم كاملة وسائط الإعلام.
3. إضافة 100 ميليلتر من تعليق خلية تحتوي على 5,000 يفب-إيجابية الخلايا ومثبطات مناسبة لمل 3 من ميثيلسيلولوسي (انظر الجدول للمواد). دوامة على ارتفاع مزجها على 10-30 ثانية.
4. بعد أكثر من الهواء وقد هرب فقاعات، استخدم حقنه 1 مل للوحة 1 مل من وسائل الإعلام في ثلاث نسخ متماثل سم 3 لوحات بإخراج الوسائط على جانب واحد، وآماله ببطء اللوحة في حركة دائرية ينتشر بالتساوي.
5. يتم التركيز النهائي لمثبطات لاستخدام imatinib في 3 ميكرومتر، مركز دبي للزهور في 0.2 ميكرون، وبي سي أي في 0.5 ميكرومتر، وحدها أو في مجموعات. حيثما كان ذلك مناسباً، حذف ج-المنحدر بطلاء الخلايا مع 4-هيدروكسيتاموكسيفين (1 ميكروغرام/مل) إضافة إلى ميثيلسيلولوسي.
6. بعد الطلاء، وضع اللوحات في طبق بتري كبيرة مع صحن مفتوح واحد يحتوي على 2 مل الماء المعقم في الوسط. تغطية صحن بتري كبيرة واحتضانها بعناية عند 37 درجة مئوية، 5% CO₂ حاضنة. سجل الأرقام مستعمرة بعد أسبوع واحد من الطلاء بحساب العدد الإجمالي للمستعمرات تحت مجهر.
7. تحليل المستعمرات عدد قليل من اللوحات المناسبة للحذف ج-المنحدر من بكر. جمع المستعمرات بمص لهم مع تلميح P1000. إزاحة الخلايا الموجودة في 500 ميليلتر من برنامج تلفزيوني 1 x بغسل هذه المعلومة في برنامج تلفزيوني عدة مرات. تدور تعليق خلية في 6,000 س ز لمدة 1 دقيقة واستخراج الحمض النووي من خلية بيليه استخدام عدة عزل دنا جينومي.
8. استخدام الحمض النووي الجينومي للاسترداد باستخدام كبسولة تفجير مفوس-FP3 ومفوس-RP5، كما هو موضح في الجدول 2. تحليل منتجات PCR على 2% [اغروس] هلام والصورة باستخدام نظام توثيق هلام.
9. لعرض الرسوم بيانية للمستعمرات، وصمة عار المستعمرات، باستخدام كلوريد إيودونيتروتيترازوليوم. حل 10 ملغ كلوريد إيودونيتروتيترازوليوم في 10 مل الماء للحصول على حل 1 ملغ/مل. فلتر تعقيم الحل باستخدام قفل اللوير مع مرشح 0.2 ميكرومتر تعلق بحقنه 10 مل تحت ظروف معقمة في غطاء زراعة الأنسجة.
10. في هود زراعة الأنسجة، إضافة 100 ميليلتر من حل المصبوغة dropwise حول لوحة زيمبابوي؛ احرص على عدم الانزلاق أو تخل بالمستعمرات. احتضان لوحات بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية، 5% CO₂ خلية ثقافة حاضنة. سوف تتحول المستعمرات المحمر الظلام براون. استخدام خلفية بيضاء في هود زراعة الأنسجة المعقمة، التقاط صور للوحة زيمبابوي الملون.

7-زرع وفحص معدل الوفيات

1. دكت تشعيع الفئران مع تقسيم الإشعاع استخدام 137 المستندة إلى Cs أشعة غاما في جرعة من 7.0 غراي تليها 4.75 غراي (0.5 غراي/دقيقة)، ح 3 عن بعضها قبل عملية الزرع.
2. زرع 4 × 10⁴ التي لم يتم فرزها يفب الإيجابية (يحسب استناداً إلى النسبة المئوية يفب) الخلايا التي تحتوي على 3 × 10⁵ خلايا نخاع العظم الطبيعي كناقل في كل الماوس عن طريق الذيل الوريد الحقن.
3. بعد أسبوع واحد من الزرع، تحديد انجرافتمينت عن طريق تحليل الخلايا يفب إيجابية من الدم الطرفية باستخدام نظام مراقبة الأصول الميدانية.
4. إجراء ذيل الوريد التسييل ونظام مراقبة الأصول الميدانية التحليل.
   1. الحارة من قفص الفئران تحت مصباح حرارة مع الحذر ليس إفراط أو نسخها.
   2. كبح جماح ماوس في ريسترينير ماوس ونك على المنوال ذيل بشفرة معقمة. الحليب بلطف الذيل من عرفت الخلفي، يسمح قطره دم تتراكم. جمع الدم بأنبوب شعري هيبارينيزيد حتى أنه مليء (جمع حوالي 75-100 ميليلتر). يغرق الدم من أنبوبة شعرية شغلها في أنبوب جمع دم الذي يحتوي على يدتا ومزيج جيد.
   3. كرات الدم الحمراء بإضافة 30 – 40 ميليلتر من الدم لمل 3 1 x ربك تحلل من المخزن المؤقت (150 مم كلوريد الأمونيوم وبيكربونات البوتاسيوم 10 ملم 0.13 مم يدتا). المزيج جيدا، عكس الأنبوبة عدة مرات. احتضان في درجة حرارة الغرفة عن 10 – 15 دقيقة تدور في س 1,200 ز عند 4 درجة مئوية أدنى 5 إزالة طاف عبر فراغ وتعليق بيليه في 2 مل من برنامج تلفزيوني x 1 ليغسل.
   4. تدور في 1,200 س ز في 4 درجات مئوية عن أدنى 5 إزالة المادة طافية وتعليقه في المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية #1. القيام بتحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية كما هو موضح أعلاه في الخطوة 5.2.5–5.2.66. أنبوب قصيرة الأجل مخزن الدم المتبقية في المجموعة، التي يمكن استخدامها لأغراض أخرى مختلفة، في 4 درجات مئوية.
5. واستخدمت زرع الفئران التي أظهرت 10 – 40% يفب-إيجابية الخلايا في الدم المحيطي للتجربة. الفئران التي كانت أقل من 2 ٪ خلايا إيجابية يفب استبعدت من الدراسة.
6. يعد تاموكسيفين في 20 ملغ/مل في زيت الذرة عند 60 درجة مئوية مع فورتيكسينج متقطعة حتى يذوب تماما، وتخزينها في 4 درجات مئوية في الظلام لمدة العلاج. بعد أسبوع واحد من الزرع، حذف اليل ج-المنحدر^{fl/فلوريدا} بالحقن تاموكسيفين (100 مغ/كغ في زيت الذرة) إينترابيريتونيلي (القائمة) في الفئران، كل يوم لمدة ثلاثة أيام متتالية. فمن المهم أن يتم وزنه بالفئران لتحديد مقدار تاموكسيفين لحقن. بعد علاج تاموكسيفين (عند الاقتضاء)، مجموعة الفئران للعلاج بالعقاقير (n = 5/المجموعة).
7. مراقبة الفئران لبقاء وتطور سرطان الدم وتحديد أعلى عبء ليوكيميك (يفب-إيجابية الخلايا بنظام مراقبة الأصول الميدانية) الأسبوعية إلى ثمانية أسابيع في الباقين على قيد الحياة الفئران.
8. تحليل الدم للحذف ج-المنحدر حيثما كان ذلك مناسباً، كما هو موضح أعلاه في القسم 6. سجل العدد الفئران الباقين على قيد الحياة كل يوم وارسم منحنى البقاء على قيد الحياة في نهاية التجربة استخدام برامج الرسوم البيانية.

8. نموذج الفئران المعدلة وراثيا من اللوكيميا المركز-ABL1

1. عزل LSK
   1. الحفاظ على الفئران المحورة وراثيا Scl-نقل واكتساب التكنولوجيا على تشو الدوكسيسيكلين لمنع تعبير عن المركز-ABL1. تأخذ أربعة أسابيع قبل عملية الزرع، الفئران قبالة الدوكسي تشو للتعبير المركز-ABL1.
   2. عزل تمنكس من الفئران المحورة وراثيا Scl-نقل واكتساب التكنولوجيا كما هو موضح أعلاه في القسم 4. تعليق تمنكس في المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية #2 (برنامج تلفزيوني x 1 + 0.5% جيش صرب البوسنة + 2 مم يدتا) للحصول على 10⁶ خلايا/مل.
   3. تستنفد تمنكس للنسب-إيجابية الخلايا بإضافة 10 ميليلتر من الكشف عن خلية النسب البيوتين كوكتيل (مترافق البيوتين مونوكلونل ضد CD5 [الفئران IgG2a]، CD11b [الفئران IgG2a]، CD45R [B220] [الفئران IgG2a]، مكافحة--7-4 [الجرذ IgG2a], مكافحة-غرام-1 [لي-6G/C, فأر IgG2a]، ومكافحة-ثالثا-119 [الجرذ IgG2b]) الواحدة 1 × 10⁶ خلايا. احتضان الخلايا عند 4 درجة مئوية عن 10 دقيقة في الظلام، تليها يغسل مع 5 مل من نظام مراقبة الأصول الميدانية العازلة #2، وتدور في 1,200 س ز في 4 درجات مئوية عن أدنى 5 Aspirate المادة طافية تماما ووقف الخلايا في 400 ميليلتر من نظام مراقبة الأصول الميدانية العازلة #2.
   4. إضافة 5 ميليلتر من المتقارن البيوتين المضادة الأجسام المضادة-فيتك وميليلتر 1.2 من PECy7 Ly-6A/E (Sca1) ميليلتر 2.4 CD117 الأجسام APC (ج-Kit) لتصل إلى 10⁸ ملايين الخلايا. احتضان في الظلام في درجة حرارة الغرفة عن 10 دقيقة يغسل بالحجم يصل إلى 5 مل مع المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية #2؛ ثم الطرد المركزي في س 1,200 ز في 4 درجات مئوية عن أدنى 5 إزالة المادة طافية وتعليق بيليه الخلية في 500 ميليلتر من نظام مراقبة الأصول الميدانية العازلة #2.
   5. تصفية تعليق خلية في أنبوب أزرق الحد الأقصى لتصفية نظام مراقبة الأصول الميدانية.
   6. بوابة الخلايا الحية باستخدام مبعثر الأمامية والجانبية. ثم حدد الخلايا لين^– التي أظهرت مؤسسة مونتانيار (يعني fluorescence كثافة أقل من 10²) للحصول على LSK الخلايا ج-كيت⁺ و Sca1⁺ في بيكسبونينتيال الأرض من الأصل لين^– ، وفرزها (الشكل 7 ج).
   7. جمع الخلايا تم فرزها والطرد المركزي لهم في س 1,200 ز عند 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
2. زرع الأعضاء
   1. دكت تشعيع الفئران بيج مع جرعة إشعاع انقسام غراي 7.0 تليها غراي 4.75 بعد ح 3، قبل عملية الزرع.
   2. حقن 3 × 10³ إلى 5 × 10³ المركز-ABL1-LSK الخلايا مع 0.3 × 10⁶ مساعد خلايا نخاع العظام من الفئران بيج WT عبر الذيل الوريد (رابعا) في الفئران المشععة بيج.
   3. بوستترانسبلانتيشن أربعة أسابيع، تحليل الفئران المستفيدة ل CD45.1 و CD45.2. الحصول على تمنك من الدم المحيطي بذيل نزيف الوريد كما هو موضح في الخطوة 7، 4. ريسوسبيند الخلايا في 100 ميليلتر من المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية. احتضان الخلايا مع ميليلتر 1 كل من جسم فيتك CD45.1 و CD45.2-PE في درجة حرارة الغرفة ح 1.
   4. غسل الخلايا بتنشئة الحجم إلى 3 مل مع المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية وتدور في 1,200 س ز عند 4 درجة مئوية لإزالة المادة طافية 5 كحد أدنى وريسوسبيند أنه في 200 ميليلتر من 1 x PBS.
   5. تحليل نسبة CD45.1 و CD45.2 بأول النابضة الخلايا الحية استناداً إلى مبعثر إلى الأمام والجانب، تليها النابضة الخلايا فيتك و PE إيجابية استناداً إلى عينة أونستينيد.
   6. مجموعة الفئران إلى أربع مجموعات (n = 6 كل مجموعة). تبدأ العلاج imatinib (75 ملغ/كغ 2 × يوميا) وحدها وفي تركيبة مع DFC + بي سي أي (كلا المخدرات أعطيت بجرعة 10 مغ/كغ 2 × يوميا).
   7. وبالمثل، التعامل مع المجموعات الأخرى مع مجموعات من imatinib (75 ملغ/كغ) + الكركمين (150 مغ/كغ) + بي سي أي (10 مغ/كغ) و imatinib (75 ملغ/كغ) + ندجا (100 مغ/كغ) + بي سي أي (10 مغ/كغ) لمدة ثلاثة أشهر، 2 × يوميا، حقن القائمة
   8. تحليل الفئران 1 x شهر لمدة ستة أشهر تشيميريسم ليوكيميك بتحديد النسبة مئوية CD45.2 إيجابية الخلايا في الدم المحيطي بذيل الوريد ينزف كما هو موضح في الخطوة 7، 4.

9-وفي تقييم فيفو BCI والنشاط DFC

1. تحليل والرمات-p38
   1. أن الفئران ليوكيميك الثلاثة (8 – 12 أسبوعا القديمة) التي تم زرعها مع الإعراب عن المركز-ABL1 ج-كيت⁺ الخلايا، كما هو موضح في القسم 7. حقن الفئران مع بي سي أي (10 مغ/كغ) عن طريق حقن بوستترانسبلانت الأسابيع الأربعة القائمة.
   2. قياس مستويات الدم المحيطي والرمات-p38 تمنك استخدام طقم الفسفرة التدفق الخلوي وفقا لتعليمات المورد. جمع الدم من كل الماوس قبل و 6 ح بعد حقن المخدرات. عزل في تمنكس قبل استنفاد ربك وإصلاحها على النحو التالي.
   3. إضافة 4 مل من ربك تحلل الحل الواحد 100 ميليلتر من الدم المحيطي. خلط واحتضان على الجليد لمدة 5 دقائق كرات الدم الحمراء. تدور أسفل الخلايا في س 1,200 ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية وإزالة المادة طافية. كرر تحلل 1 x أكثر.
   4. بعد الخطوة الثانية تحلل، تغسل الكريات الخلية مع 1 مل من جيش صرب البوسنة 2% في برنامج تلفزيوني. إصلاح الخلايا عن طريق إضافة 100 ميليلتر من التثبيت و permeabilization الحلول واحتضان لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية في الظلام. بيليه الخلية باستخدام الطرد المركزي في س 1,200 ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
   5. تغسل الكريات مع 1 مل 1 × بيرميبيليزيشن المياه والصرف الصحي. كتلة الخلايا بإضافة 300 ميليلتر من جيش صرب البوسنة 2% في المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي بيرميبيليزيشن في درجة حرارة الغرفة للحد الأدنى 20 تقسيم الخلايا إلى مختبرين تساوي ثلاثة من كل 100 ميليلتر (~ 1 x10⁶).
   6. كل قاسمة للخلايا الثابتة إضافة 1 ميليلتر من جسم p-38 مجموع أو 1 ميليلتر من جسم p38 والرمات 1 ميليلتر من ايستب مراقبة مفتش، على التوالي، واحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
   7. تغسل الخلايا 1 x مع 5 مل من جيش صرب البوسنة 2% في برنامج تلفزيوني واحتضان مع جسم الثانوي (1 ميليلتر من فلور أليكسا-488 مترافق) ح 1 في درجة حرارة الغرفة. وقف لهم في 200 ميليلتر من برنامج تلفزيوني 1 x وتغسل الخلايا 1 x مرة أخرى.
   8. الحصول على البيانات من قبل نظام مراقبة الأصول الميدانية وتحليلها قبل التدفق الخلوي تحليل البرامج.
   9. خصم مؤسسة مونتانيار لمراقبة مفتش من مؤسسة مونتانيار للعينات التجريبية. ثم يتم تطبيع قيم مؤسسة مونتانيار والرمات-p38 إلى أنه من مجموع p-38 لتحديد مستويات والرمات-p38 بعد حقن BCI.
2. تحليل التعبير الجيني الكمي الجينات المستهدفة ج-المنحدر
   1. أن الفئران ليوكيميك الثلاثة (8 – 12 أسبوعا القديمة)، التي تم زرعها مع الإعراب عن ABL1 بنك الخلايا ج-كيت⁺ كما هو موضح في القسم 7. جمع الدم المحيطي من كل الماوس وثم حقن الفئران مع 10 مغ/كغ كل DFC + بي سي أي.
   2. جمع الدم المحيطي ح 6 بعد تعاطي المخدرات بالحقن. عزل تمنكس عن طريق استنفاد ربك، كما هو موضح أعلاه. بيليه تمنكس، وتعليق عليها في المخزن مؤقت تحلل تستند الفينول (انظر الجدول للمواد).
   3. القيام بتحليل RT-قبكر (كما هو موضح في القسم 1) Bcl2l11، ليف، وايل-6 استخدام الإشعال الخاصة بالجينات (كما هو مبين في الجدول 1).

10-طويل الأجل بالانزيم الخلية الشروع في الثقافة

ملاحظة: وأجرى مقايسة لتسيك كما هو موضح سابقا²⁵.

1. تنمو ماوس تنتجها الخلايا الليفية خلية خط MS-5 في MEMα إلى كونفلوينسي في قارورة زراعة الأنسجة T175. تريبسينيزي الخلايا كما هو موضح أعلاه ل HEK293T. تعليق الخلايا الموجودة في MEMα في 2 × 10⁶ خلايا/مل. تأخذ 10 × 10⁶ خلايا في أنبوب 50 مل مخروطية ويتهددها في 80 غراي. تمييع الخلايا إلى 0.5 × 10⁶ خلايا/مل في MEMα وتستكمل مع 10% FBS (M10) وسائل الإعلام. لوحة 2 مل كل بئر في لوحة 12-جيدا واحتضان أنه في 37 درجة مئوية، 5% CO₂ حاضنة بين عشية وضحاها.
2. في اليوم التالي، إعداد هيميسوكسيناتي الصوديوم الهيدروكورتيزون بتذويب 2.5 ملغ في 5 مل MEMα (حل م 1). عامل التصفية-تعقيم الهيدروكورتيزون الحل باستخدام عامل تصفية حقنه ميكرومتر 0.2 في غطاء السلامة الأحيائية. تمييع الهيدروكورتيزون واسطة تمييع المسلسل في الذاكرة للحصول على حل 100 ميكرومتر. إضافة 250 ميليلتر من هذا إلى 25 مل متوسطة الثقافة البشرية الطويلة الأجل (هلتم) (انظر الجدول للمواد) فقط قبل الاستخدام، لتحقيق تركيز نهائي من 1 ميكرومتر.
3. تدور أسفل التضليل-CD34⁺ وتمنكس UCP3 وتعليق لهم في هلتم واسطة فورتيكسينج قصيرة، وتحديد التهم التي هيموسيتوميتير.
4. فراغ إيقاف الوسائط M10 من لوحة 12-جيدا المصنف مع خلايا ستروما واستبدله مع 1 مل خلايا المريض (UCP3 تمنكس والتضليل-CD34⁺ [10,000] [1 × 10⁶]) تعليق في هلتم. استخدم ثلاثة آبار كل تركيبة المخدرات حسب نوع الخلية.
5. تمييع مخزونات الأدوية إلى x 2 للتركيز المطلوب في هلتم. أضف 1 مل من وسائل الإعلام مع المخدرات في الخلايا المشار إليها أعلاه للحصول على تركيز المخدرات 1 x. استبدال نصف عدد من وسائل الإعلام مع هلتم الطازجة كل أسبوع لمدة خمسة أسابيع.
6. في نهاية فترة الفحص LTC-IC ستة أسابيع، جمع الخلايا نوناديرينت في أنبوب من الثقافات. تريبسينيزي الخلايا ملتصقة والجمع بينها وبين الخلايا نوناديرينت المقابلة.
7. غسل الخلايا ومقايسة كفوس في methylcellulose المتوسطة تحتوي على 30% العجل الجنين المصل، الاريثروبويتين (3 وحدات/mL)، سادس (50 نانوغرام/مل)، وايل-3(20 ng/mL)، إيل-6 (20 نانوغرام/ملليلتر)، ز-CSF (20 نانوغرام/مليلتر)، وعامل تحفيز مستعمرة المحببات/بلعم (GM-CSF) (20 نانوغرام/ مل)-تحديد التهم التي هيموسيتوميتير.
8. لوحة 5 × 10⁴ خلايا في replicates الثلاثة. تجميد أسفل الخلايا المتبقية في 20% FBS و 10% [دمس]. ترتيب اللوحات في طبق بتري كبيرة مع صحن مفتوح واحد يحتوي على الماء في الوسط. تغطية صحن بيتري الكبيرة بعناية واحتضان أنه في 37 درجة مئوية، 5% CO₂ حاضنة لمدة أسبوعين.
9. نقاط المستعمرات بعد ذلك بأسبوعين. وفي بعض الحالات، سوى جزء من الحصاد هو جزيئي كفوس). حساب إجمالي عدد لتسيك موجودة في تعليق خلية أولية باستقراء استناداً إلى كفوس التي تم الحصول عليها من جزء من محصول الخلية. إخراج زيمبابوي متوسط كل LTC IC هو 8.
   ملاحظة: على سبيل المثال، إذا كانت الخلايا في البداية 1 × 10⁶ مطلي في بئر، بعد خمسة أسابيع، كانت تحصد 0.5 × 10⁶ خلايا، لزيمبابوى، كانت مطلي 5 × 10⁴ خلايا وتم الحصول على 50 كفوس. وهذا يساوي كفوس/1 500 مليون خلايا مطلي. قسمة هذا الرقم 8 للحصول على لتسيك، وهو 62.5.

11-أنسنة طراز الماوس باستخدام التضليل CD34 الخلايا⁺

1. سوبليثالي تشعيع الأسبوع عمره 8 مشمولان إيماءة غاما الفئران، معربا عن IL3 البشرية، GM-CSF، و "صندوق إنقاذ الطفولة" (نسجس)، مع جرعة واحدة من 7.0 غراي (700 راد) مع راد 50/دقيقة.
2. حقن 3 × 10⁶ CD34⁺ تحديد خلايا من مرضى المرحلة المزمنة CML المركز--ABL1--الإيجابية في الفئران المشععة بالحقن الوريدي.
3. وبعد أسبوعين زرع، تحديد انجرافتمينت ليوكيميك في نخاع العظام بنظام مراقبة الأصول الميدانية باستخدام الأجسام المضادة الخاصة بالماوس والإنسان ضد CD45.
4. إجراء تحليل لنظام مراقبة الأصول الميدانية.
   1. تأخذ أسبيراتي نخاع العظام من قصبة الفئران زرع. كرات الدم الحمراء باستخدام المخزن المؤقت لتحلل ربك كما هو موضح أعلاه وجمع تمنكس واسطة الطرد المركزي. أغسل بيليه 1 x مع x 1 الباردة برنامج تلفزيوني.
   2. كتلة الخلايا البشرية FcR كتلة وكتلة FcR الماوس متبوعاً تلطيخ مع الإنسان المضادة CD45 فيتك والماوس المضادة الجيش الشعبي الكونغولي CD45^Cy7 بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. القيام بتحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية على لسريي وتحليل البيانات باستخدام برمجيات تحليل التدفق الخلوي.
5. مجموعة الفئران إلى أربع مجموعات مختلفة (n = 6/المجموعة) لمعالجة بالسيارة، imatinib (75 ملغ/كغ)، DFC + BCI (سواء في 10 مغ/كغ)، أو imatinib (75 ملغ/كغ) + DFC BCI (سواء في 10 مغ/كغ). تخفف الأدوية الأسهم في برنامج تلفزيوني 1 x (المركبات) وإدارتها عن طريق حقن هذه القائمة 2 × يوميا.
6. علاج الفئران لمدة ستة أسابيع وتحديد عبء ليوكيميك كل أسبوعين، حتى الأسبوع ثمانية بعد زرع الأعضاء كما هو موضح أعلاه في 11.4.

النتائج

إدمان السرطاني قد تورطت في الفعالية العلاجية تكيس. ومع ذلك، ليست مفهومة آليات القيادة الاعتماد السرطاني. ونحن أداء متعددة تحليلات التعبير الجيني غير متحيزة لتحديد المكون الوراثي المتورطين في تدبير الإدمان. وكشفت هذه التحاليل upregulation من ثلاثة جينات، ج-المنحدر و Dusp1 و Zfp36، ...

Discussion

الجزء الأكبر من الخلايا السرطانية، هو توسط الاستجابة العلاجية ل TKI حصار تيروزين-كيناز-أونكوبروتين الإشارات التي الورم مدمن. ومع ذلك، يعرف سوى القليل نسبيا هو حول كيفية الهروب أقلية خلايا السرطانية التي تساهم الاعتماد والعلاج السرطاني⁴. كشفت الدراسات الأخيرة أن يشير إلى عامل ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Biological Materials
RPMI	Cellgro (corning)	15-040-CV
DMEM	Cellgro (corning)	15-013-CV
IMDM	Cellgro (corning)	15-016-CVR
RetroNectin Recombinant Human Fibronectin Fragment	Takara	T100B
MethoCult GF M3434 (Methylcellulose for Mouse CFU)	Stem Cell	3434
MethoCult H4434 Classic (Methylcellulose for Human CFU)	Stem Cell	4434
4-Hydroxytamoxifen	Sigma	H6278
Recombinant Murine SCF	Prospec	CYT-275
Recombinant Murine Flt3-Ligand	Prospec	CYT-340
Recombinant Murine IL-6	Prospec	CYT-350
Recombinant Murine IL-7	Peprotech	217-17
DFC	LKT Laboratories Inc.	D3420
BCI	Chemzon Scientific	NZ-06-195
Imatinib	LC Laboratory	I-5508
Curcumin	Sigma	458-37-7
NDGA	Sigma	500-38-9
Penn/Strep	Cellgro (corning)	30-002-CI
FBS	Atlanta biological	S11150
Trypsin EDTA 1x	Cellgro (corning)	25-052-CI
1x PBS	Cellgro (corning)	21-040-CV
L-Glutamine	Cellgro (corning)	25-005-CL	5 mg/mL stock in water
Puromycin	Gibco (life technologies)	A11138-03
HEPES	Sigma	H7006
Na2HPO4.7H2O	Sigma	S9390
Protamine sulfate	Sigma	P3369	5 mg/mL stock in water
Trypan Blue solution (0.4%)	Sigma	T8154
DMSO	Cellgro (corning)	25-950-CQC
WST-1	Roche	11644807001
0.45 μM acro disc filter	PALL	2016-10
70 μm nylon cell stariner	Becton Dickinson	352350
FICOL (Histopaque 1083) (polysucrose)	Simga	1083
PBS	Corning	21040CV
LS Columns	Miltenyi	130-042-401
Protease Inhibitor Cocktail	Roche	CO-RO
Phosphatase Inhibitor Cocktail 2	Sigma	P5762
Nitrocullulose Membrane	Bio-Rad	1620115
SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate ( chemiluminiscence substrate)	Thermo Scientific	34075
CD5	eBioscience	13-0051-82
CD11b	eBioscience	13-0112-75
CD45R (B220)	BD biosciences	553092
CD45.1-FITC	eBioscience	11-0453-85
CD45.2-PE	eBioscience	12-0454-83
hCD45-FITC	BD Biosciences	555482
Anti-Biotin-FITC	Miltenyi	130-090-857
Anti-7-4	eBioscience	MA5-16539
Anti-Gr-1 (Ly-6G/c)	eBioscience	13-5931-82
Anti-Ter-119	eBioscience	13-5921-75
Ly-6 A/E (Sca1) PE Cy7	BD	558612
CD117 APC	BD	553356
BD Pharm Lyse	BD	555899
BD Cytofix/Cytoperm (Fixing and permeabilization solution)	BD	554714
BD Perm/Wash  (permeabilization and wash solution for phospho flow)	BD	554723
phospho p38	Cell Signaling Technologies	4511S
total p38	Cell Signaling Technologies	9212
Mouse IgG control	BD	554121
Alexa Flour 488 conjugated	Invitrogen	A-11034
Calcium Chloride	Invitrogen	K278001
2x HBS	Invitrogen	K278002
EDTA	Ambion	AM9261
BSA	Sigma	A7906
Blood Capillary Tubes	Fisher	22-260-950
Blood Collection Tube	Giene Bio-One	450480
Newborn Calf Serum	Atlanta biological	S11295
Erythropoiein	Amgen	5513-267-10
human SCF	Prospec	CYT-255
Human IL-3	Prospec	CYT-210
G-SCF	Prospec	CYT-220
GM-CSF	Prospec	CYT-221
MyeloCult (media for LTCIC assay)	Stem Cell Technologies	5100
Hydrocortisone Sodium Hemisuccinate	Stem Cell Technologies	7904
MEM alpha	Gibco	12561-056
1/2 cc Lo-Dose u-100 insulin syringe 28 G1/2	Becton Dickinson	329461
Mortor pestle	Coor tek	60316 and 60317
Isoflorane (Isothesia TM)	Butler Schien	29405
SOC	New England Biolabs	B90920s
Ampicillin	Sigma	A0166	100 mg/mL stock in water
Bacto agar (agar)	Difco	214050
Terrific broth	Becton Dickinson	243820
Agarose	Genemate	E-3119-500
Doxycycline chow	TestDiet.com	52662	modified RMH1500, Autoclavable 5LK8  with 0.0625% Doxycycline
Tamoxifen	Sigma	T5648
Iodonitrotetrazolium chloride	Sigma	I10406
Kits
Dneasy Blood & tissue kit	Qiagen	69506
GoTaq Green (taq polymerase with Green loadign dye)	Promega	M1722
miRNeasy Mini Kit  (RNA isolation kit)	Qiagen	217084
DNA Free Dnase Kit (DNAse treatment for RT PCR)	Ambion, Life Technologies	AM1906
Superscript III First Strand Synthesis (reverse transcriptase for cDNA synthesis)	Invitrogen	18080051
SYBR Green (taq polymerase mix with green interchalating dye for qPCR)	Bio-Rad	1725270
CD117 MicroBead Kit	Miltenyi	130-091-224
Human Long-Term Culture Initiating Cell Assay	Stemp Cell Technologies
Instruments
NAPCO series 8000 WJ CO2 incubator	Thermo scientific
Swing bucket rotor cetrifuge 5810R	Eppendorf
TC-10 automated cell counter	Bio-RAD
C-1000 Thermal cycler	Bio-RAD
Mastercycler Real Plex 2	Eppendorf
ChemiDoc Imaging System (imaging system for gels and western blots)	Bio-RAD	17001401
Hemavet (boold counter)	Drew-Scientific
LSR II (FACS analyzer)	BD
Fortessa I (FACS analyzer)	BD
FACSAriaII (FACS Sorter)	BD
Magnet Stand	Miltenyi
Irradiator	J.L. Shepherd and Associates, San Fernando CA	Mark I Model 68A	source Cs 137
Mice
ROSACreERT2	Jackson Laboratory
Scl-tTA	Dr. Claudia Huettner’s lab
BoyJ	mouse core facility at CCHMC
C57Bl/6	Jackson Laboratory
NSGS	mouse core facility at CCHMC
ROSACreERT2/c-Fosfl/fl Dusp1-/-	Made in house
ROSACreERT2/c-Fosfl/fl	Made in house
Cells
BaF3	Gift from George Daley, Harvard Medical School, Boston
WEHI	Gift from George Daley, Harvard Medical School, Boston
CML-CD34+ and Normal CD34+ cells	University Hospital, University of Cincinnati