JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نقدم وسيلة لتوليد في المختبر مكتفية ذاتيا ذبذبات الانقسامية على مستوى خلية واحدة بتغليف البيض مقتطفات من النمو لإيفيس في ميكرومولسيونس الماء في النفط.

Abstract

المهم قياس ذبذبات على مستوى خلية واحدة في الوقت الحقيقي لكشف آليات الساعات البيولوجية. رغم مقتطفات جل إعداد من البيض ليفيس النمو القوية في تشريح الشبكات الحيوية الكامنة وراء تطور دورة الخلية، قياس متوسط الفرقة عادة ما يؤدي إلى التذبذب ثبط، على الرغم من كل مذبذب الفردية التي لحقت. وهذا نظراً لصعوبة تزامن مثالي بين التذبذب الفردية في الأنظمة البيولوجية صاخبة. لاسترداد ديناميات خلية واحدة المذبذب، قمنا بتطوير نظام المستندة إلى الحبرية خلية اصطناعية التي يمكن إعادة تشكيل دورات الانقسامية في المقصورات الخليوي تشبه تغليف مقتطفات هيولى ركوب البيض ليفيس النمو . هذه الخلايا هيولى فقط بسيط يحمل ذبذبات مستمرة لما يزيد على 30 من دورات. لبناء خلايا أكثر تعقيداً مع نويات، أضفنا الكروماتين الحيوانات المنوية ديميمبراناتيد لتحريك نويات التجميع الذاتي في النظام. لاحظنا تقدم دوري كروموسوم التكثيف/ديكوندينسيشن ونوى يطوق انهيار/الإصلاح، مثل في الخلايا الحقيقية. يشير هذا إلى أن المذبذب الانقسامية وظائف أمانة محرك أقراص متعددة الأحداث الانقسامية المتلقين للمعلومات. ونحن في نفس الوقت تعقب ديناميات مذبذب الانقسامية وعمليات المصب في قطرات الفردية باستخدام مجهر الأسفار الوقت الفاصل بين متعدد القنوات. نظام دورة الخلية الاصطناعية يوفر إطارا الفائق للتلاعب بالكمية وتحليل ذبذبات الانقسامية مع القرار خلية واحدة، مما يرجح أن يوفر معلومات هامة بشأن الآلية التنظيمية ووظائفها على مدار الساعة.

Introduction

مقتطفات هيولى إعداد من البيض ليفيس النمو تمثل أحد النماذج الأكثر الغالبة لدراسة الكيمياء الحيوية لدورة الخلية، نظراً لكبر حجم بويضات، والتقدم السريع في دورة الخلية، والقدرة على إعادة تشكيل أحداث الانقسامية في المختبر1،2. هذا النظام قد أتاح اكتشاف الأولية وتوصيف آليا لمنظمي دورة الخلية الأساسية مثل مغزل عامل تشجيع النضج (MPF) فضلا عن العمليات الانقسامية المتلقين للمعلومات بما في ذلك الفصل بين الجمعية وكروموسوم1 ،2،3،4،5،،من67،،من89،10، 11. مقتطفات البيض النمو استخدمت أيضا لتشريح مفصل للشبكات التنظيمية لدورة الخلية على مدار الساعة8،،من1213،14 ودراسات عن أضرار الحمض النووي /replication حاجز15 والمغزل التفتلي الجمعية حاجز16،،من1718.

هذه الدراسات من دورات الخلية باستخدام مقتطفات البيض النمو أساسا قد تم استناداً إلى قياسات السائبة. ومع ذلك، فحوصات رد فعل الجملة التقليدية قد تقليد سلوكيات الخلية الحقيقية، نظراً لاختلاف رئيسي في الأبعاد والتقسيم المكاني سوبسيلولار من جزيئات رد فعل. وعلاوة على ذلك، هم عرضه لإعطاء عدد محدود من دورات قبل التخميد بسرعة8قياسات الجزء الأكبر من الأنشطة الانقسامية. هذه العيوب من ردود فعل معظم حالت دون نظام استخراج لتوفير مزيد من فهم الخصائص الديناميكية المعقدة على مدار الساعة ووظائفها. الدراسات التي أجريت مؤخرا قد مغلفة تثبيط الخلايا الخلية الحرة (CSF) القبض على عامل النمو مقتطفات19،20 في أماكن مثل الخلية تعريف الحجم، التي ساعدت في توضيح كيف هو حجم الدوران عن طريق التضمين حجم هيولى. بيد أن هذا النظام في المختبر هو القبض على الطورية من الانقسام الاختزالي الثاني بفعل العوامل القاتلة1ويلزم وجود نظام قادر على ذبذبات المطرد طويل الأجل على مستوى خلية واحدة لإجراء مزيد من التحقيقات لدورة الخلية مذبذب.

دراسة ذبذبات دورة الخلية مع القرار خلية واحدة، وقد وضعنا على نطاق الخلية، النظام الفائق لقياس المتزامن لعدة عمليات متذبذبة الانقسامية مكتفية ذاتيا في ميكرومولسيون الفردية وإعادة تشكيل قطرات. في هذا البروتوكول فيديو مفصلة، نبدي إنشاء نظام التذبذب الانقسامية الاصطناعية بتغليف ليفيس النمو ركوب البيض السيتوبلازم في ميكرومولسيونس بأحجام تتراوح بين 10 إلى 300 ميكرون. وفي هذا النظام، كانت ذبذبات الانقسامية، بما في ذلك التكثيف كروموسوم والتكثيف دي، وانهيار المغلف النووية واصلاحهم، وتدهور والتوليف من ركائز طور الصعود (مثلاً، سيكورين-مشري في هذا البروتوكول) أعيد تشكيلها بنجاح.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

عليها جميع الأساليب الموصوفة هنا "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك) من جامعة ميشيغان.

1-إعداد مواد لإعادة تشكيل دورة الخلية والكشف

  1. الجمعية جيبسون الاستنساخ لأغراض تشييد الحمض النووي بلازميد ومرناً تطهير مشري سيكورين
    1. إعداد ثلاث شظايا من الحمض النووي بما في ذلك من pMTB2 ناقلات العمود الفقري وسيكورين ومشري من خلال تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) وجل تنقية21،22.
    2. قياس تركيزات الأجزاء باستخدام فلوروسبيكتروميتير. ضم 100 نانوغرام من العمود الفقري مع إدراج سيكورين ومشري في 1: نسبة جزيئية 1:1 وإضافة المياه لضبط الحجم الكلي للرد إلى 5 ميليلتر.
    3. إعداد 6 مل 5 × الجمعية متحاور رد فعل المخزن المؤقت مع 3 مل 1 M HCl تريس (درجة الحموضة 7.5)، 300 ميليلتر مجكل م 12600 ميليلتر من دنتب 10 ملم، 300 ميليلتر 1 م DTT، 1.5 غرام من 8000 شماعة و 20 ملغ من NAD23.
    4. إضافة الأجزاء المركبة إلى 15 ميليلتر من 1 x الجمعية متحاور رد فعل المخزن المؤقت اليكووت. تبني رد الفعل في أنبوب تفاعل PCR عند 50 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
    5. جعل 0.8% [اغروس] هلام وتشغيل مع جهد V 10/سم للتحقق من كفاءة انلينغ هذه الشظايا.
    6. تنقية بلازميد المشيدة والوت استخدام 15 ميليلتر من المياه خالية من رناسي. تحويل 1 ميليلتر من بلازميد تنقية الحمض النووي إلى 50 ميليلتر من المختصة DH5α كولاي الخلايا24 لاستخدامها في المستقبل.
    7. استخراج وتنقية بلازميد الحمض النووي من سيكورين-مشري من المختصة DH5α كولاي الخلايا.
    8. نسخ خطية سيكورين-مشري بلازميد الحمض النووي في مرناً وتنقية مرناً. استخدم جهاز المطياف الضوئي للتأكد من أن تركيز مرناً أكثر من 100 نانوغرام/ميليلتر ونسبة امتصاص في 260 nm و 280 نيوتن متر هو حوالي 2.0.
  2. إعداد ديميمبراناتيد الحيوانات المنوية ليفيس النمو الحمض النووي
    ملاحظة: مقتبس من موراي عام 19911.
    1. Euthanize الذكور البالغين ليفيس النمو25 وتشريح الخصيتين من الضفادع الذكور أربعة26،27.
    2. مكان الخصيتين من الضفادع الأربعة في نفس 100 مل طبق بيتري. شطف الخصيتين ثلاث مرات في 50 مل من البرد حل x MMR 1 (0.1 M كلوريد الصوديوم، 2 مم بوكل، 1 مم مجكل2, 2 مم كاكل2، 5 ملم حبيس، يدتا 0.1 ملم).
    3. إزالة الخصيتين في طبق بتري 100 مل الدم الزائد والدهون، ويغسل مرتين في المخزن المؤقت إعداد النووية الباردة (بروميد البروبيل – ن) (250 ملم السكروز، 15 ملم هيبيس، درجة الحموضة 7.4، 1 مم يدتا، pH 8.0، 0.5 مم سبيرمدين تريهيدروتشلوريدي، تيتراهيدروتشلوريدي سبيرميني 0.2 مم).
    4. إزالة المخزن المؤقت إعداد النووية (بروميد البروبيل – ن) وقطع الخصيتين إلى قطع ذات أطوال أقل من 0.2 سم باستخدام مقص تشريح حاد في 100 مل طبق بيتري. إضافة 8 مل من البرد بروميد البروبيل – ن للخصيتين لمزيد من الانهيار.
    5. استخدام النايلون مش الأقمشة مع حجم مسام 70 ميكرون لتصفية الخصيتين وجمع عينة الحيوانات المنوية في أنبوب مخروطي 15 مل. تدور أسفل الحيوانات المنوية التي تم جمعها في 1,730 س ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية وإزالة المادة طافية.
    6. إمداد الخلايا المنوية مع 1 مل من بروميد البروبيل – ن و 50 ميليلتر من ليسوليسيثين 10 ملغ/مل واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق لخلايا الحيوانات المنوية ديميمبراناتي.
    7. غسل الحيوانات المنوية ديميمبراناتيد الحمض النووي مع 10 مل من البرد بروميد البروبيل – ن مع حل جيش صرب البوسنة 3% ثلاث مرات.
    8. قياس كثافة الحيوانات المنوية الحمض النووي مع هيموسيتوميتير.
    9. تجميد الحيوانات المنوية الحمض النووي في 5 ميليلتر مختبرين في النتروجين السائل وتخزينه في-80 درجة مئوية. تركيز الحيوانات المنوية DNA الأمثل حوالي 105 النوى/ميليلتر.
  3. تنقية البروتين للتجارة والنقل النووية "التعريب إشارة" (بروتينات فلورية خضراء-NLS)
    1. تحويل بلازميد NLS بروتينات فلورية خضراء معلم ضريبة السلع والخدمات إلى BL21 (DE3) المختصة كولاي الخلايا5.
    2. احتضان الخلايا دون المضادات الحيوية في 37 درجة مئوية ح 1 وانتشرت بعد ذلك على لوحة [اغروس] رطل مع 100 ميكروغرام/مل الأمبيسلّين.
    3. احتضان لوحة عند 37 درجة مئوية ل 14 إلى 18 ساعة لزراعة الخلايا في المستعمرات واحدة. بيك وتطعيم المستعمرات واحدة إلى 4 مل الإعلام رطل مع 100 ميكروغرام/مل الأمبيسلّين. اهتزاز الخلايا في 37 درجة مئوية لمدة 12 ساعة.
    4. تعد وسائل الإعلام وأي تي يعقم (ز 16 من بكتو-تريبتوني، 10 جرام من خميرة بكتو مقتطف، 5 غ من كلوريد الصوديوم) والحرارة وسائل الإعلام وأي تي إلى 37 درجة مئوية.
    5. تطعيم 1 مل الخلايا المحتضنة بين عشية وضحاها في وسائل الإعلام رطل في 250 مل من وسائل الإعلام وأي تي مسخن مع 100 ميكروغرام/مل الأمبيسلّين ويهز لمدة ساعتين لزيادة كثافة الخلية.
    6. قياس كثافة الخلية الضوئية (OD) كل 30 دقيقة، باستخدام جهاز المطياف الضوئي في طول جه 600 نانومتر. إضافة 0.1 مم إيبتج داخل الخلايا للحث على التعبير البروتين بروتينات فلورية خضراء-NLS حالما تصل قيمة التطوير التنظيمي إلى 0.1.
    7. اهتزاز الخلايا عند 18 درجة مئوية بين عشية وضحاها تقليل معدل نمو الخلايا وتسمح أفضل بروتين التعبير والتوليف.
    8. زيادة ونقصان لأسفل الخلايا في 34,524 س ز عند 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق وإزالة المادة طافية.
    9. ريسوسبيند الكريات الخلية في 40 مل من برنامج تلفزيوني المخزن المؤقت (مع 800 ميليلتر من ليسوزيمي 50 ملغ/مل، 100 ميليلتر بمسف وميليلتر 13.2 مزيج 10 ملغ/مل من ليوبيبتين وبيبستاتين وتشيموستاتين ميليلتر 8 يدتا 0.5 M 0.2 M) واحتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
    10. كسر أسفل الخلايا باستخدام سونيكاتور بتردد من 20 كيلوهرتز 4 × 30 أعرب s، مع 30 s فواصل بين كل سونيكيشن، بالإفراج عن البروتين بروتينات فلورية خضراء-NLS.
    11. تدور في 20,000 x ز لمدة 35 دقيقة لإزالة الخلايا مكسورة.
    12. استخدام الفصل اللوني لتقارب لاستخراج وتنقية البروتين بروتينات فلورية خضراء-NLS.
    13. أغسل الطين حبة 1.5 مل ثلاث مرات مع 15 مل من المخزن المؤقت لبرنامج تلفزيوني واحتضان 250 مل من بالخرز لمدة 4 ساعات في 4 درجات مئوية مع انعكاس.
    14. تدور أسفل الخرز في 2000 غ س لمدة 5 دقائق وإضافة 10 مل من محلول الغسيل (25 تريس قاعدة، درجة الحموضة 7.5، كلوريد الصوديوم، 500 مم و 5 مم DTT) الخرز. احتضان الخرز في 700 ميليلتر من شطف المخزن المؤقت (50 تريس-HCl، الجلوتاثيون خفض الرقم الهيدروجيني 8.8، 20 مم، و 5 ملم DTT) بالتناوب في 4 درجات مئوية. جمع قاسمة شطف بحجم 50 ميليلتر.
    15. قياس تركيز البروتين التي تم جمعها عن طريق تشغيل جل أزرق أخذ28.
    16. الوت البروتينات باستخدام أعمدة PD-10 مع 3 مل من مخزن المخزن المؤقت (20 ملم حبيس، 150 مم بوكل، والغليسيرول 10%، 7.7 درجة الحموضة) عن طريق تبادل المخزن المؤقت.

2-إعداد الدراجات النمو مقتطفات

ملاحظة: الإجراء العام لإعداد المقتطفات يتضح في الشكل 1A. مقتبس من موراي عام 19911.

  1. حقن الإناث الناضجة ثلاثة ليفيس النمو مع 66 وحدة دولية تروج مصل الفرس الحامل (بمسج) 10 أيام قبل وضع البيض.
  2. حقن هذه الضفادع النمو مع 500 وحدة دولية من تروج المشيمية البشرية (HCG) للحث على بيضة زرع 18 ساعة قبل إعداد الدراجات مقتطفات.
  3. تجاهل وضع البيض بين عشية وضحاها. استناداً إلى تجارب (البيانات لا تظهر)، مقتطفات من البيض الطازج توليد أنشطة أطول أمداً من مقتطفات إعداد من البيض وضعت من الضفدع الإناث نفس. الضغط على البيض لكل أنثى الضفدع في أطباق بتري 100 ملم التي تحتوي على 10 مل من المخزن المؤقت x MMR 0.2 وفحص تحت مجهر ستيريو.
  4. تجاهل دفعات البيض التي لها حدود غير واضحة بين القطبين فيجيتال والحيوان أو البقع البيضاء غير المنتظمة على رأس الحيوان القطبين.
  5. اختر دفعة البيض من الضفدع أنثى واحدة تعرض سكان متجانسة من البيض مع الحيوانات وضوح متمايزة واقطاب فيجيتال ونقل البيض في كوب 600 مل.
  6. صب العازلة x MMR 0.2 الزائدة وإضافة 250 مل بلطف من 2 غرام لكل 100 مل استخراج سيستين (7.7 درجة الحموضة) في 1 x المخزن المؤقت (100 مم بوكل، 0.1 مم كاكل2، 1 مم مجكل2، 10 مم حبيس، السكروز 50 مم، الرقم الهيدروجيني 7.7) للبيض.
  7. تهز البيض بقوة باليد وإزالة المعاطف هلام البيض يغسل ما يزيد على ثلاثة بحجم إجمالي 800 مل من سيستين المخزن المؤقت لمدة 3 دقائق أو حتى البيض التجميعية وتسوية في أسفل الكأس، مشيراً إلى أن إزالة طبقة جيلي ناجحة.
  8. أغسل البيض مع 1 لتر من 0.2 x MMR الحل أكثر من أربع مرات.
  9. بيك وتجاهل البيض التي تتحول أبيض ماصة نقل زجاج استخدام.
  10. صب في المخزن المؤقت للحصبة والنكاف وتوريد البيض مع 200 مل من 0.1 ميكروغرام/مل الكالسيوم ionophore الحل A23187 في المخزن المؤقت x MMR 0.2 للتنشيط.
  11. استخدم إلى جانب افتتاح واسعة ماصة زجاجية يقلب البيض بلطف حتى يتم تنشيط البيض وإزالة الكالسيوم ionophore الحل.
  12. التحقق من كفاءة التنشيط بعد أن يستقر البيض في الجزء السفلي من الكأس. البيض جيدا تم تنشيطه بحوالي 25% من القطب الحيواني و 75% من القطب فيجيتال.
  13. أغسل البيض المنشط مرتين مع 50 مل 1 × استخراج المخزن المؤقت تستكمل مع مثبطات البروتياز (10 ميكروغرام/مل كل من ليوبيبتين وبيبستاتين وتشيموستاتين).
  14. نقل البيض بعناية إلى microtube الحد الأقصى للأداة إضافية 0.4 مل وحزمة ثم البيض عن طريق استخدام الطرد المركزي في 200 x ز لمدة 60 ثانية ومن ثم 600 x ز لمدة 30 ثانية.
  15. إزالة المخزن المؤقت الإضافي على رأس البيض استخدام زجاج ماصة باستور للحد من تخفيف مقتطفات.
  16. سحق البيض في 15,000 س ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية.
  17. قطع الأنابيب مع شفرة حلاقة لفصل ثلاث طبقات من البيض سحقت وإبقاء السيتوبلازم الخام في الطبقة الوسطى.
  18. نقل النفط الخام السيتوبلازم في أنابيب أولتراسينتريفوجي جديدة، وتكمل مع مثبطات البروتياز وسيتوتشالاسين ب في 10 ميكروغرام/مل كل.
  19. الطرد المركزي السيتوبلازم النفط الخام مرة أخرى في 15,000 س ز عند 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق لمواصلة تنقية السيتوبلازم عن طريق إزالة الدهون الزائدة وصفار البيض.
  20. تبقى مقتطفات الطازجة على الجليد.

3-الحبرية جيل

  1. إعداد غرفة الزجاج 2D
    ملاحظة: هذه الأنابيب الزجاجية مستطيل بمثابة الدوائر التي تحصر القطرات في طائرة 2-الأبعاد واحد، مما يسمح لتسهيل المراقبة وجمع البيانات.
    1. قطع أنابيب زجاجية مستطيل ذات بعد داخلي من 2 مم × 100 ميكرومتر إلى 4 ملم قطع طويلة. استخدام حافة حادة من ويستون، وضع علامة الحدود المطلوب على السطح الخارجي للأنبوب الزجاج مع محفورة الخفيفة، ثم الضغط بلطف على جانبي محفورة بقطع أجزاء من أنابيب زجاجية.
    2. قبل الحرارة حاضنة حمام جافة إلى 95 درجة مئوية. إخراج كتلة التدفئة ووضعها في مجفف فراغ البولي.
    3. ضع أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل تحتوي على 30 ميليلتر من سيلاني ثلاثي الكلور (ح 1، ح 1، ح 2، ح 2-بيرفلوروكتيل) في كتلة التدفئة. وضع أنابيب قطع الزجاج داخل مجففة فراغ في حوالي 5 سم إلى كتلة التدفئة.
    4. قم بتوصيل مجففة مضخة فراغ. قم بتشغيل المضخة لمدة 1 دقيقة للوصول إلى مستوى الفراغ المطلوب، ثم إغلاق صمام 3-طريقة لختم مجففة والسماح للبخار سيلاني ثلاثي الكلور (ح 1، ح 1، ح 2، ح 2-بيرفلوروكتيل) معطف الجدار الداخلي للأنابيب الزجاجية. وهذا سيخلق بيئة مسعور لاستقرار القطرات.
    5. ترك أنابيب زجاجية داخل مجففة لطلاء بين عشية وضحاها. الأنابيب ستكون جاهزة للاستخدام في اليوم التالي.
  2. جيل الحبرية والتصوير
    ملاحظة: يتم توضيح إجراءات توليد قطرات والتصوير في الأرقام 1 باء وجيم 1
    1. توريد مقتطفات إعدادها في الخطوة 2 مع 10 نانوغرام/ميليلتر مشري سيكورين مرناً لتجارب بسيطة هيولى فقط دورة الخلية. وبدلاً من ذلك، مقتطفات العرض مع ديميمبراناتيد الحيوانات المنوية الكروماتين (250 كل ميليلتر لاستخراج) والبروتين بروتينات فلورية خضراء-NLS ميكرومتر 10 10 نانوغرام/ميليلتر التغييرات مرناً مشري سيكورين لإنشاء قطرات العارضة مورفولوجيا نويات الدوري.
    2. في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل، زودت مزيج 20 ميليلتر لاستخراج مع البروتين المؤتلف أو مرناً مع 200 ميليلتر من 2% بيرفلوروبولييثير--البولي إثيلين غليكول فلوروسورفاكتانت (فب-شماعة) في HFE7500 المفلورة النفط.
    3. توليد قطرات استخدام خلاط دوامة. يمكن التضمين نطاق أحجام الحبرية بسرعة دوامة ومدتها. لإنشاء قطرات مع إنصاف أقطار تتراوح من 50 إلى 200 ميكرومتر، تعيين سرعة دوامة في 56 x ز (3,200 لفة في الدقيقة مع دائرة نصف قطرها مم 4.9) واضغط برفق بأنبوب ميكروسينتريفوجي المحتوية على الاستخراج وخليط الفاعل في الخلاط لمدة 3.5 ثانية. افحص بصريا إذا القطرات موحدة في الحجم.
    4. استخدام ماصة 20 ميليلتر لنقل قطرات تطفو على أعلى وزيادة في حجم السطح شماعة PFPE متساوية في أنبوب PCR. تراجع أنبوب الزجاج أعدت من الخطوة في طبقة الحبرية في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل والانتظار حتى قطرات بتعبئة حوالي 75% الأنبوب، ثم دفع الأنبوب إلى أسفل إلى طبقة السطح حتى يتم ملء الأنبوب تماما. وهذا انخفاض كثافة الحبرية وتسمح القطرات تشكل طبقة واحدة واحدة داخل الدائرة بدون تشويه الشكل أو المتداخلة الناجمة عن الاكتظاظ.
    5. ملء طبق أسفل زجاج التي يبلغ قطرها 40 ملم مع الزيوت المعدنية. تزج أنابيب الحبرية المليئة بالنفط بدفعهم برفق إلى أسفل باستخدام الملاقط ما يرام.
    6. بعد تحميل جميع العينات، استخدام الزجاج "الماصة؛" لإزالة أي الحطام مرئية أو تسربت قطرات. إضافة مزيد من الزيوت المعدنية إذا الأنابيب ليست أو سوف لا تكون مغمورة تماما في عملية التصوير.
    7. إجراء تصوير قطرات على مجهر ابيفلوريسسينسي مجهزة بمرحلة يجهز س ص (انظر الجدول للمواد). استخدم هدفا جوية X 4 لتصوير كافة. للتصوير بالأسفار، استخدام 130 ث الزئبق بخار قصيرة قوس مصباح كتعيين مصدر الضوء الفلورية للإضاءة، ومرشح للتجارة والنقل (الإثارة 482/35 نانومتر والانبعاثات 514/ليرة لبنانية nm) وتعيين عامل تصفية مشري (الإثارة 562/40 شمال البحر الأبيض المتوسط وشمال البحر الأبيض المتوسط انبعاث 641/75) للتصوير إشارات NLS بروتينات فلورية خضراء ومشري سيكورين.
    8. سجل الوقت الفاصل بين أشرطة الفيديو في ميدان مشرق وقنوات متعددة الأسفار كل 6 إلى 9 دقائق حتى القطرات تفقد نشاطها.

4-صورة تجهيز وتحليل البيانات

  1. تجزئة وتتبع قطرات
    1. استيراد البيانات المسجلة في تنسيق tif "." أو ".oif" في صورة تحليل البرمجيات (انظر الجدول للمواد).
    2. الجزء قطرات واحدة تستخدم قناة الحقل مشرق. سوف تظهر الصورة الميدانية مشرق قطرات كدوائر مشرقة مع حدود الظلام. تطبيق مستوى العتبة للصورة. إضافة سطح تتبع لكل قطره بضبط العتبة بين الظلام ومشرق بكسل حيث أن كل سطح يغطي منطقة بأكملها من الحبرية المقابلة.
    3. تتبع تلقائياً الشرائح بين الإطارات المتجاورة باستخدام خوارزمية الحركة أوتوريجريسيفي. لحن المسافة السفر الحد الأقصى المقبول لمعالجة تجميعية بين إطارين المتاخمة يكون أصغر من نصف قطر معظم قطرات لتتبع بدقة قطرات صغيرة.
    4. بصريا التحقق من كافة المسارات عبر الفيديو بأكمله للكشف عن الانقسامات غير صحيحة هذا الجزء مساحة فارغة بين قطرات بدلاً من قطرات الفعلية. يدوياً حذف المسارات غير صحيحة.
    5. الجزء وتتبع المنطقة الخلفية دون أي قطرات للحصول على كثافة fluorescence الخلفية. لتحسين إشارة إلى الضوضاء، طرح كثافة الخلفية من شدة الأسفار قطرات في كل إطار زمني.
    6. تصدير تقاس معلمات لكل مسار على مر الزمن، بما في ذلك المتوسط والانحراف المعياري لشدة الأسفار ومنطقة الحبرية إلى ملفات ".csv".
  2. تحليل البيانات لفترة الحجم والتذبذب الحبرية
    1. تحميل ملفات ".csv" في البحث والتطوير لإنشاء قطع شدة الأسفار على مر الزمن لكل قطره. معرف السجل الحبرية في ملف "csv.".
    2. استيراد ملفات ".csv" المصدرة من برامج التحليل وملف "csv." مع قائمة معرف الحبرية في Matlab وحفظها كملفات ".mat" لمزيد من تحليل البيانات.
    3. حساب حجم الحبرية مضغوط استناداً إلى معلومات المجال الحبرية المصدرة بعد تجزئة وارتفاع الزجاج الدائرة19. استخدام وحدة التخزين لحساب دائرة نصف قطرها الحبرية كمجال.
    4. استخراج النقاط الزمنية القصوى وأحواض باستخدام خوارزمية الكشف عن ذروة/الحوض. إجراء التصحيحات اليدوية على موقف قمم وأحواض لضمان دقة يتم الكشف عنها.
    5. لحساب فترة دورة الخلية، حساب الوقت الفاصل بين اثنين من قمم متجاورة. أن متوسط جميع الفواصل الزمنية لكل قطره كفترة دورة الخلية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

نحن في الشكل 2، يظهر أن هذا البروتوكول وتنتج ذبذبات الانقسامية في خلايا بسيطة، خالية من الأسلحة النووية، فضلا عن خلايا معقدة مع نويات، حيث يدفع المذبذب التناوب الدوري لتشكيل نواة وتشوه. قطرات خالية من الأنوية توليد ذبذبات الانقسامية يصل إلى 30 دورات على م?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

وقد قدمنا طريقة جديدة لوضع نظام خلية اصطناعية الفائق أن تمكن المختبر في إعادة تشكيل وتتبع ذبذبات دورة الخلية الاكتفاء الذاتي على مستوى خلية واحدة طويلة الأجل. وهناك العديد من الخطوات الحاسمة التي تجعل هذا الأسلوب الناجح. أولاً، الطازج البيض النمو مع نوعية جيدة، بالمقارنة مع الب...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

ليس لدينا شيء الكشف عنها.

Acknowledgements

ونحن نشكر لو مادلين لتشييد بلازميد مشري سيكورين، لي مان اللفة والن ف ليو للمناقشات حول الجيل الحبرية وجيريمي باء تشانغ وهو كينيث جيمس هاء فيريل الابن لتوفير بناء بروتينات فلورية خضراء-NLS. هذا العمل كان تدعمها "المؤسسة الوطنية للعلوم" (الوظيفي المبكر منحة #1553031)، المعاهد الوطنية للصحة (ميرا #GM119688)، وزمالة أبحاث سلون.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Xenopus laevis frogsXenopus-I Inc.
QIAprep spin miniprep kitQIAGEN27104
QIAquick PCR Purification Kit (250)QIAGEN28106
mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription KitAmbionAM1340
BL21 (DE3)-T-1 competent cellSigma-AldrichB2935
Calcium ionophoreSigma-AldrichA23187
Hoechst 33342Sigma-AldrichB2261Toxic
TrichloroSigma-Aldrich448931Toxic
(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl) silane
PFPE-PEG surfactantRan Biotechnologies008-FluoroSurfactant-2wtH-50G
GE Healthcare Glutathione Sepharose 4B beadsSigma-AldrichGE17-0756-01
PD-10 columnSigma-AldrichGE17-0851-01
VitroCom miniature hollow glass tubingVitroCom5012
Olympus SZ61 Stereo MicroscopeOlympus
Olympus IX83 microscopeOlympus
Olympus FV1200 confocal microscopeOlympus
NanoDrop spectrophotometerThermofisherND-2000
0.4 mL Snap-Cap MicrotubesE&K Scientific485050-B
PureLink RNA Mini KitThermoFisher (Ambion)12183018A
Fisherbrand Analog Vortex MixerFisher Scientific2215365
ImarisBitplaneVersion 7.3Image analysis software

References

  1. Murray, A. W. Cell cycle extracts. Methods in Cell Biology. 36, 581-605 (1991).
  2. Hannak, E., Heald, R. Investigating mitotic spindle assembly and function in vitro using Xenopus laevis egg extracts. Nature Protocols. 1, 2305-2314 (2006).
  3. Murray, A. W., Solomon, M. J., Kirschner, M. W. The role of cyclin synthesis and degradation in the control of maturation promoting factor activity. Nature. 339, 280-286 (1989).
  4. Yang, Q., Ferrell, J. E. The Cdk1-APC/C cell cycle oscillator circuit functions as a time-delayed, ultrasensitive switch. Nature Cell Biology. 15, 519-525 (2013).
  5. Chang, J. B., Ferrell, J. E. Jr Mitotic trigger waves and the spatial coordination of the Xenopus cell cycle. Nature. 500, 603-607 (2013).
  6. Trunnell, N. B., Poon, A. C., Kim, S. Y., Ferrell, J. E. Ultrasensitivity in the Regulation of Cdc25C by Cdk1. Molecular Cell. 41, 263-274 (2011).
  7. Kim, S. Y., Ferrell, J. E. Substrate competition as a source of ultrasensitivity in the inactivation of Wee1. Cell. 128, 1133-1145 (2007).
  8. Pomerening, J. R., Kim, S. Y., Ferrell, J. E. Systems-level dissection of the cell-cycle oscillator: bypassing positive feedback produces damped oscillations. Cell. 122, 565-578 (2005).
  9. Pomerening, J. R., Sontag, E. D., Ferrell, J. E. Building a cell cycle oscillator: hysteresis and bistability in the activation of Cdc2. Nature Cell Biology. 5, 346-351 (2003).
  10. Telley, I. A., Gaspar, I., Ephrussi, A., Surrey, T. Aster migration determines the length scale of nuclear separation in the Drosophila syncytial embryo. The Journal of Cell Biology. 197, 887-895 (2012).
  11. Telley, I. A., Gaspar, I., Ephrussi, A., Surrey, T. A single Drosophila embryo extract for the study of mitosis ex vivo. Nature Protocols. 8, 310-324 (2013).
  12. Tsai, T. Y. C., Theriot, J. A., Ferrell, J. E. Jr Changes in Oscillatory Dynamics in the Cell Cycle of Early Xenopus laevis Embryos. PLoS Biology. 12, e1001788(2014).
  13. Chang, J. B., Ferrell, J. E. Jr Mitotic trigger waves and the spatial coordination of the Xenopus cell cycle. Nature. 500, 603-607 (2013).
  14. Yang, Q., Ferrell, J. E. Jr The Cdk1-APC/C cell cycle oscillator circuit functions as a time-delayed, ultrasensitive switch. Nature Cell Biology. 15, 519-525 (2013).
  15. Kumagai, A., Dunphy, W. G. Claspin, a novel protein required for the activation of Chk1 during a DNA replication checkpoint response in Xenopus egg extracts. Molecular Cell. 6, 839-849 (2000).
  16. Chen, R. H., Murray, A. Characterization of spindle assembly checkpoint in Xenopus egg extracts. Methods in Enzymology. 283, 572-584 (1997).
  17. Chen, R. H., Waters, J. C., Salmon, E. D., Murray, A. W. Association of spindle assembly checkpoint component XMAD2 with unattached kinetochores. Science. 274, 242-246 (1996).
  18. Minshull, J., Sun, H., Tonks, N. K., Murray, A. W. A MAP kinase-dependent spindle assembly checkpoint in Xenopus egg extracts. Cell. 79, 475-486 (1994).
  19. Good, M. C., Vahey, M. D., Skandarajah, A., Fletcher, D. A., Heald, R. Cytoplasmic Volume Modulates Spindle Size During Embryogenesis. Science. 342, 856-860 (2013).
  20. Hazel, J., et al. Changes in cytoplasmic volume are sufficient to drive spindle scaling. Science. 342, 853-856 (2013).
  21. Garibyan, L., Avashia, N. Research Techniques Made Simple: Polymerase Chain Reaction (PCR). The Journal of Investigative Dermatology. 133, e6(2013).
  22. Hecker, K. H., Roux, K. H. High and low annealing temperatures increase both specificity and yield in touchdown and stepdown PCR. BioTechniques. 20, 478-485 (1996).
  23. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6, 343-345 (2009).
  24. Froger, A., Hall, J. E. Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method. Journal of Visualized Experiments. 6, e253(2007).
  25. Torreilles, S. L., McClure, D. E., Green, S. L. Evaluation and refinement of euthanasia methods for Xenopus laevis. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 48, 512-516 (2009).
  26. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Isolating Xenopus laevis Testes. Cold Spring Harbor Protocols. 2007, pdb.prot4735 (2007).
  27. Showell, C., Conlon, F. L. Egg Collection and In vitro Fertilization of the Western Clawed Frog Xenopus tropicalis. Cold Spring Harbor Protocols. 2009, (2009).
  28. Wilson, C. M. Methods in Enzymology. 91, Academic Press. 236-247 (1983).
  29. Schutze, T., et al. A streamlined protocol for emulsion polymerase chain reaction and subsequent purification. Analytical Biochemistry. 410, 155-157 (2011).
  30. Weitz, M., et al. Diversity in the dynamical behaviour of a compartmentalized programmable biochemical oscillator. Nature Chemistry. 6, 295-302 (2014).
  31. Ho, K. K., Lee, J. W., Durand, G., Majumder, S., Liu, A. P. Protein aggregation with poly(vinyl) alcohol surfactant reduces double emulsion-encapsulated mammalian cell-free expression. PloS One. 12, e0174689(2017).
  32. Nakajima, M., et al. Reconstitution of circadian oscillation of cyanobacterial KaiC phosphorylation in vitro. Science. 308, 414-415 (2005).
  33. Guan, Y., et al. A robust and tunable mitotic oscillator in artificial cells. eLife. 7, (2018).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

139 fluorescence microemulsion

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved