استراتيجية فعالة لتوليد النظم الخاصة بالانسجة النسخ ثنائي في المورفولوجية بتحرير الجينوم

Summary

نقدم هنا، وسيلة لتوليد النظم الخاصة بالانسجة النسخ ثنائي في المورفولوجية بالاستعاضة عن إكسون الترميز الأول من الجينات مع برامج النسخ. الأسلوب كريسبر/Cas9-تعتمد يضع تسلسل ترانساكتيفاتور تحت تنظيم الجين حل محل الذاتية، ويسهل التعبير ترانسكتيفاتور حصرا في أنماط الزمانية المكانية الخاصة بالجينات وبالتالي.

Abstract

نظم النسخ ثنائي أدوات قوية الوراثية المستخدمة على نطاق واسع لتصور، والتلاعب بالخلية التعبير مصير والجينات في مجموعات محددة من الخلايا أو الأنسجة في الكائنات نموذج. هذه النظم تحتوي على عنصرين هما كخطوط منفصلة وراثيا. سطر برنامج تشغيل يعرب منشط النسخي تحت السيطرة من الأنسجة على حدة المروجين/القدرة على، ومرافئ خط مراسل/المستجيب جين المستهدف وضع مجرى النهر إلى موقع ربط المنشط النسخ. حمل الحيوانات التي تأوي كل من مكونات ترانساكتيفيشن الخاصة بالانسجة لتعبير الجينات المستهدفة. دقة التعبير الزمانية المكانية للجينات في الأنسجة المستهدفة حاسمة بالنسبة لتفسير غير متحيز لنشاط الخلية/الجينات. ولذلك، وضع أسلوب لتوليد خطوط الحصرية الخاصة بخلية/الأنسجة سائق ضروري. هنا نقدم طريقة لإنشاء نظام التعبير العالية الخاصة بالانسجة المستهدفة باستخدام "متفاوت بانتظام إينتيرسباسيد قصيرة المتناوب تكرار/كريسبر-المرتبطة" (كريسبر/Cas)-على أساس الجينوم تحرير الأسلوب. في هذا الأسلوب، دليل اندونوكليسي ويستهدف Cas9 اثنين تشيميريك الكشف (جرنة) إلى مواقع محددة في إكسون الترميز الأول للجينات في الجينوم المورفولوجية لإنشاء فواصل مزدوجة-ستراند (جهاز تسوية المنازعات). فيما بعد، باستخدام بلازميد مانحة خارجية تحتوي على تسلسل ترانساكتيفاتور، آلات إصلاح الخلية ذاتية تمكن الإصلاح الموجه من التماثل (HDR) من جهاز تسوية المنازعات، مما يؤدي إلى الحذف الدقيق واستبدال إكسون مع ترانساكتيفاتور التسلسل. وأعرب عن ترانساكتيفاتور طرقت في حصرا في الخلايا حيث رابطة الدول المستقلة-العناصر التنظيمية لاستبدال الجينات الوظيفية. البروتوكول خطوة بخطوة مفصلة تقدم هنا لتوليد سائق النسخي ثنائي المعرب عنها في صندوق الأجيال القادمة المورفولوجية/فروعها-إنتاج الخلايا الظهارية/العصبية يمكن اعتمادها لأي تعبير الجينات أو أنسجة محددة.

Introduction

الأدوات الجينية للجينات المستهدفة قد وضعت أيضا في المورفولوجية، يجعلها واحدة من أفضل أنظمة نموذجية للتحقيق في وظيفة الجينات المشاركة في مجموعة واسعة من العمليات الخلوية. نظم ثنائية التعبير، مثل الخميرة Gal4/UAS (التسلسل التنشيط المنبع)، اعتمد أولاً للأنسجة على حدة محسن ميسيكسبريشن الملائمة والجينات في نموذج الجينية المورفولوجية ¹ (الشكل 1). هذا النظام على تيسير تطوير عدد كبير من تقنيات مثل تنظيم الزمانية المكانية overexpression الجينات، ميسيكسبريشن، وخروج المغلوب في مجموعات محددة من الخلايا، وكذلك كما هو الحال في خلية التذرية، ووسم الخلية، واقتفاء أثر مباشر الخلوية والجزيئية العمليات في الأجنة والأنسجة وتتبع النسب والتحليلات فسيفساء أثناء التطوير. عدد من النسخ ثنائي النظام، مثل البكتيريا ليزا نيوروسبورا س-نظام، ونظامليزا_{البروتوكول الاختياري} (الشكل 1) هي أدوات قوية الجينية التي تستخدم الآن على نطاق واسع في المورفولوجية، بالإضافة إلى نظام Gal4/UAS الأصلي للجينات المستهدفة التعبير^1،،من²³.

وهنا نقدم طريقة لإنشاء نظام موثوق بها للغاية الخاصة بالانسجة ثنائي التعبير باستخدام أسلوب التحرير الجينوم. التطورات الأخيرة في كريسبر/Cas9 الجينوم تكنولوجيا تحرير أتاحت فرصاً غير مسبوقة لإجراء تغييرات جينوم الموجهة في طائفة واسعة من الكائنات الحية. بالمقارنة مع التقنيات المتاحة الجينوم التحرير الأخرى، نظام كريسبر/Cas9 رخيصة وفعالة وموثوق بها. وتستخدم هذه التكنولوجيا مكونات الجهاز المناعي التكيفي البكتيرية: اندونوكليسي Cas9 العقدية المقيّحة يقوم بإنشاء فاصل مزدوج-ستراند (جهاز تسوية المنازعات)، ودليل تشيميريك رنا (جرنة)، التي توجه Cas9 لموقع معين جينوم ل جهاز تسوية المنازعات المستهدفة⁴. الخلايا تحتوي على إليه لإصلاح جهاز تسوية المنازعات باستخدام مسارات مختلفة. نهاية مثلى عدم الالتحاق بالعمل (نج) يؤدي إلى الصغيرة عمليات الإدراج أو الحذف لتعطيل وظيفة الجينات، وحين يدخل الإصلاح الموجه من التماثل (HDR) من معرفة الموجهة/مرغوب فيه الجينوم تدق-في/المغلوب باستخدام جهة مانحة خارجية في تقرير التنمية البشرية كقالب. كفاءة يمكن أن تستخدم استراتيجية استبدال المستندة إلى تقرير التنمية البشرية لإنشاء نظام موثوق بها للغاية الخاصة بالانسجة ثنائي تعبير، التي يمكن التغلب على جميع القيود المفروضة على أساليب فخ محسن التقليدية. يصف لنا إجراء خطوة بخطوة للاستفادة إصلاح HDR كريسبر/Cas9-تعتمد في توليد خط نسخ ثنائي برنامج تشغيل التي يتم التعبير عنها تحت سيطرة الذاتية تنظيم النسخي وبوستترانسكريبشونال المورفولوجية الجينات. في هذا البروتوكول، ونظهر توليد خط برنامج تشغيل محدد فروعها (bnl) الجينات ترميز بروتين أسرة صندوق الأجيال القادمة الذي ينظم morphogenesis المتفرعة من مجرى الهواء الرغامى ظهارة⁵. في هذا المثال، استعيض إكسون الترميز الأول من الجينات bnl تسلسل تسلسل ترانساكتيفاتور ليزا البكتيرية دون تغيير أي الذاتية رابطة الدول المستقلة-تسلسل الجين bnl التنظيمية. نظهر أن الاستراتيجية التي تم إنشاؤها بخط سائق bnl-ليزا سباتيوتيمبورالي يتحكم في التعبير عن الجينات مراسل وضعت المتلقين للمعلومات من ليكساوبيراتور (ليكساوب أو لكسو) حصرا في bnl- وإذ تعرب عن الخلايا الظهارية/الوسيطة/العصبية.

Protocol

1-تصميم وتشييد جرنة "ناقلات التعبير"

1. لتحل محل منطقة محددة بفترة طويلة من إكسون دقة، استخدم جرنة مزدوج نهج⁶، التي تستهدف كل جرنة يمكن على وجه التحديد طرفي المنطقة المحددة التي تهم. للحصول على تعبير الزمانية المكانية الخاصة بالجينات دقيقة من برنامج التشغيل، حدد اثنين من المواقع المستهدفة جرنة داخل إكسون الترميز الأول من الجينات.
2. melanogaster المورفولوجية، تحديد المواقع المستهدفة جرنة باستخدام أداة "الباحث عن الهدف الأمثل" فليكريسبر (http://tools.flycrispr.molbio.wisc.edu/targetFinder/). يمكن استخدام أدوات التصميم كريسبر المتاحة الأخرى أيضا، بما في ذلك أداة "التصميم الأمثل كريسبر" (http://crispr.mit.edu)، FlyCas9 (https://shigen.nig.ac.jp/fly/nigfly/cas9)، وهاء-هش (www.e-crisp.org/E-CRISP).
   ملاحظة: اعتمد البروتوكولات التالية لتصميم جرنة والاستنساخ من الأساليب هو موضح سابقا^6،7.
   1. نسخ التسلسل الفعلي في المربع المتوفر في أداة على الإنترنت. حدد المورفولوجية المفرج عنهم في الآونة الأخيرة melanogaster الجينوم إصدار التعليق التوضيحي، "r_6"، في القائمة المنسدلة ل "حدد الجينوم." في "دليل تحديد طول الحقل (nt)،" إدخال "20". حدد للبحث عن "جميع الأهداف كريسبر" وانقر فوق "البحث عن أهداف كريسبر".
   2. تقييم كافة الأهداف جرنة المرشح بإعداد "الحد الأقصى" ل "التشدد" و "نج فقط" "بام". في محاولة لتحديد المواقع التي جرنة دون أي إيقاف-الأهداف المحتملة أو عدد أدنى من إيقاف الأهداف الممكنة. استخدام أداة الشبكة الموصوفة في دونك et al. عام 2014 ⁸ إلى اختر جرناس بدرجة "جيد" نشاط محتملة.
   3. في نفس الوقت، ضمان أن هناك تعدد الأشكال النوكليوتيدات واحدة لا في الأهداف جرنة في جينوم السطر يطير الأصل المحدد لحقن (مثلاً، غ-Cas9 على كروموسوم إكس، از # 54591). اتبع البروتوكول، المذكورة في et al. عام 2015 وغراتز⁷ لاستخراج الحمض النووي الجينومي من السطر يطير الأصل. [بكر] تضخيم، تقريبا، 500 – 1,000 nt المناطق باستخدام كبسولة تفجير أن الجناح تسلسل الفائدة وبوليميراز الدنا عالية الدقة؛ تسلسل--التحقق من منتجات PCR تضخيمه.
3. لتوليد ناقل تعبير جرنة جنبا إلى جنب، اتبع مستقلة عن عملية ربط استنساخ بروتوكول⁶ إدخال تسلسلين بروتوسباسير إلى ناقل تعبير رنا pCFD4. نلاحظ أن متجه تعبير محسنة متعددة-جرنة (pCFD5) متوفر الآن حيث يتم التعبير عن سجرناس كلا من المروجين U6:3 قوية⁹ (https://www.crisprflydesign.org). استخدام أسلوب "الجمعية الحمض النووي" لاستنساخ جرناس إلى ناقل pCFD4.
   1. تصميم وترتيب الإشعال إلى الأمام وعكس لإدخال تسلسلين بروتوسباسير pCFD4 ناقل التعبير الحمض النووي الريبي (الجدول 1 ألف). كما هو موضح سابقا⁶، يتضمن الدليل التمهيدي إلى الأمام التسلسل بروتوسباسير أول يحف به المناطق المقابلة لمروج U6-1 والأساسية جرنة في pCFD4؛ عكس التمهيدي يحتوي على تسلسل تكملة عكس بروتوسباسير الثاني الذي كان واقفاً إلى جانب المناطق المقابلة للب جرنة ومروج U6-3 في pCDF4.
   2. ريسوسبيند الإشعال إلى 100 ميكرومتر مع الدناز وخالية من رناسي مزدوجة الماء المقطر (ddH₂س). جعل 10 ميكرومترات عامل تركيز تمهيدي. استخدام بلازميد pCFD4 كقالب وقم بإعداد رد بكر بوليميريز عالية الدقة استخدام والإعدادات ل تفاعل PCR⁶الموصى بها.
   3. لاستنساخ المنتج تضخيم في pCFD4، هضم بلازميد pCFD4 مع إنزيم بسي بإعداد رد فعل التالي: 2 – 5 ميكروغرام من بلازميد pCFD4، 5 ميكروليتر من 10 × العازلة الهضم، ميكروليتر 1 إنزيم بسي، و ddH₂س إحضار وحدة التخزين النهائي إلى 50 ميكروليتر. خلط محتويات الرد بالتنصت على الأنبوبة برفق وجمع جميع قطرات متناثرة من جدار الأنبوب إلى الأسفل التي تدور موجزة. احتضان ميكس رد فعل في 37 درجة مئوية ح 2.
   4. تشغيل المنتج بكر من الخطوة 2 والمنتج هضمها من الخطوة 3 على 1% [اغروس] هلام. إجراء التفريد لما يكفي من الوقت لفصل النطاقات الحمض النووي تماما. قص الصحيحة الحجم العصابات الحمض النووي تحت ترانس-إضاءة الأشعة فوق البنفسجية قبل تنقية المنتجات المتوقعة باستخدام هلام شطف العمود اتباع تعليمات الشركة المصنعة (انظر الجدول للمواد). وينبغي أن يكون المنتج بكر 600 شركة بريتيش بتروليوم، وبلازميد pCFD4 خطية ينبغي أن يكون ~6.4 كيلو بايت ⁶.
   5. قم بإعداد رد فعل الجمعية الحمض النووي في أنبوب بكر، كل تعليمات الشركة المصنعة (انظر الجدول للمواد).
   6. تحويل 2 ميكروليتر من المنتج الجمعية المختصة البكتيريا (DH5α أو سلالات مماثلة مع ΔrecA1، ΔendA1)، ولوحة على الأمبيسلّين (100 ميكروغرام/مل) الذي يحتوي على لوحات أجار ليبره (رطل/أمبير)، واحتضان في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. لاحظ أن هذا المزيج الجمعية الحمض النووي قد تكون سامة لبعض سلالات البكتريا ولكن تمييع هذا المزيج الجمعية يمكن أن تقلل من السمية.
   7. اختيار المستعمرات الأمبيسلّين المقاوم 3 – 4 من لوحة المحتضنة بين عشية وضحاها، وتطعيم مستعمرة مل 3 رطل تحتوي على 100 ميكروغرام/مل الأمبيسلّين، وتنمو البكتيريا الملقحين في شاكر 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. استخراج بلازميد من البكتيريا مثقف بين عشية وضحاها باستخدام مجموعة مصغرة الإعدادية بلازميد اتباع تعليمات الشركة المصنعة (انظر الجدول للمواد).
   8. التسلسل والبلازميدات مع T3 التمهيدي عالمي للشاشة لاستنساخ الصحيح الذي يحتوي على الإدراج جرنة جنبا إلى جنب. إنشاء مخزون والغليسيرول من البكتيريا التي حولت التحقق من التسلسل pCFD4-جرنة في الجلسرين 20% ومخزن في ثلاجة-80 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل.

2-تصميم وتشييد الجهة المانحة HDR

1. للجينوم تدق من تسلسل Gal4 أو ليزا ، تصميم المانحين HDR مزدوجة-الذين تقطعت بهم السبل التي تحتوي على تسلسل ترانساكتيفاتور الذي كان واقفاً إلى جانب اثنين من الأسلحة التماثل.
   1. استخدام > ترك 1.5 كيلو بايت والأسلحة التماثل الحق المرافقة استهداف جرنة (ق). الأسلحة التماثل الموسعة زيادة كفاءة تقرير التنمية البشرية أثناء عملية إصلاح ¹⁰.
   2. [بكر] تضخيم الأسلحة التماثل من الحمض النووي الجينوم (جدنا) المستخرجة من الأصل يطير الخط المحدد لحقن (مثلاً، غ-Cas9 (على كروموسوم X)، از # 54591). استخدام التجارب المطبعية ابدأ ساخنة بوليميراز دنا بوليميراز إنزيم مناسبة لفترة طويلة PCR ملحق (انظر الجدول للمواد). تحقق من التسلسل.
2. لتجنب إعادة توجيه من جرنة إلى مركزا هندسيا، تصميم الجهة المانحة الاستبدال في مثل هذه طريقة أن تتعطل المواقع الاعتراف جرنة بتسلسل خارجية عرض.
   ملاحظة: لتجنب تغيير العناصر التنظيمية المستقلة المفترضة، دائماً تحديد المواقع الاعتراف جرنة داخل منطقة إكسون الترميز.
3. لتوليد كاسيت استبدال، خطة استراتيجية "الجمعية الحمض النووي" للانضمام إلى أربعة أجزاء معا: في 5 '3' التماثل الأسلحة وتسلسل الحمض النووي ترانساكتيفاتور الخارجية المتوسطة واستنساخ خطية ناقلات العمود الفقري (مثل pUC19 أو غيرها ويشيع استخدام استنساخ متجهات). اتباع إرشادات الشركة المصنعة للجمعية الحمض النووي (انظر الجدول للمواد)، تصميم كبسولة تفجير مناسبة [بكر] تضخيم والجمعية لكل قطعة. ريسوسبيند الإشعال إلى 100 ميكرومتر مع ddH₂O. جعل 10 ميكرومترات عامل تركيز تمهيدي. استخدام بوليميريز عالية الدقة لجميع ردود الفعل PCR. اتباع البروتوكول التالي:
   1. بكر تضخيم كاسيت تعبير Gal4 أو ليزا من متجه متاحة (مثلاً، nls-LexA:p65؛ يمكن العثور على البلازميدات QF2/Gal4/ليزا مثالية على التعبير والتي تم الحصول عليها من الموارد المشتركة مثل أدجيني) استخدام كبسولة تفجير المدرجة في الجدول 1 باء.
      1. للاحتفاظ بجميع لوائح النسخي وبوستترانسكريبشونال الأصلي من إكسون حل محل التعبير عن تسلسل الحمض النووي ترانساكتيفاتور، تصميم الكاسيت في مثل هذه طريقة أن اليل الجينوم المحرر عن مرناً تشيميريك ترانساكتيفاتور والجينات. الحفاظ على نهاية 5 'و 3' إكسون المستهدفة الاحتفاظ بأي إشارة الربط.
      2. إدراج تسلسل ببتيد T2A كليفينج الذاتي بين المتبقية 5 ' ترميز إكسون وتسلسل ترانساكتيفاتور لمنع ترجمة بروتين تشيميريك. إضافة كودون وقف ترجمة بعد التسلسل ترانساكتيفاتور خارجية (الشكل 5).
   2. [بكر] تضخيم الأسلحة التماثل من الحمض النووي الجينوم (جدنا) المستخرجة من الأصل يطير الخط المحدد لحقن (مثلاً، غ-Cas9 (على كروموسوم X)، از # 54591) استخدام كبسولة تفجير المدرجة في الجدول 1 باء. استخدام بوليميريز عالية الدقة لجميع ردود الفعل بكر استخدام النظم على النحو التالي: 5 ميكروليتر من 5 x "رد فعل المخزن المؤقت"، ميكروليتر 0.5 من دنتبس 10 ملم، ميكروليتر 1.25 من 10 ميكرومترات التمهيدي إلى الأمام، ميكروليتر 1.25 من 10 ميكرومترات "عكس التمهيدي"، ميكروليتر 0.5 قالب الحمض النووي، 0.25 ميكروليتر من عالية الدقة "دنا بوليميريز" ، ميكروليتر 16.25 ddH₂o.
   3. استخدام ناقل الاستنساخ خطية مثل pUC19. عدد من ناقلات المانحة متاحة الآن. انظر قائمة شاملة في موقع على شبكة الإنترنت--http://flycrispr.molbio.wisc.edu التالية.
   4. تشغيل المنتجات بكر على 1% [اغروس] هلام. إجراء التفريد لما يكفي من الوقت لضمان فصل واضح للفرقة المرجوة من العصابات غير محددة غير مرغوب فيها (أن وجدت). هلام-تطهير أجزاء الحمض النووي المتوقعة. قياس تركيز كل جزء الحمض النووي المنقي باستخدام جهاز المطياف الضوئي.
   5. قم بإعداد رد فعل الجمعية الحمض النووي اتباع إرشادات الشركة المصنعة. خلط الشظايا متجه والهدف الاستنساخ خطية من الخطوة 3 والخطوة 4 في الرد التالي: 1 ميكروليتر من خطي الاستنساخ لأغراض مكافحة ناقلات (50 نانوغرام/ميكروليتر)، 2 – 3 إضعاف الزيادة في كل جزء من الهدف، 10 ميكروليتر من 2 × الحمض النووي الجمعية مزيج الرئيسي، جعل حجم الرد النهائي 20 ميكروليتر مع ddH < c21 > 2O. إينكوباتي ميكس رد فعل لمدة ساعة عند درجة 50 درجة مئوية.
   6. تحويل 2 ميكروليتر من المنتج الجمعية إلى البكتيريا المختصة، لوحة على رطل/أمبير أجار لوحات تحتوي على 100 ميكروغرام/مل الأمبيسلّين. أيضا، إضافة غال X + إيبتج على لوحة لفحص أبيض وأزرق.
   7. اختيار 3 – 4 مستعمرات بيضاء من لوحة المحتضنة بين عشية وضحاها وتطعيم مستعمرة مل 3 رطل تحتوي على 100 ميكروغرام/مل الأمبيسلّين وتنمو في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها في شاكر. دليل لاستخراج بلازميد من البكتيريا مثقف بين عشية وضحاها باستخدام مجموعة مصغرة الإعدادية بلازميد عقب الشركة المصنعة (انظر الجدول للمواد).
   8. شاشة مستعمرة إيجابية بالهضم PCR أو التقييد.
   9. تسلسل التحقق من المنطقة المانحة HDR من بلازميد النهائي. حفظ مخزون بكتيرية تتحول مع الحيوانات المستنسخة الصحيح في الجلسرين 20% في-80 درجة مئوية لتلقيح مستقبلا.

3. حقن الأجنة وعلم الوراثة يطير والفحص للتحرير الجينوم

1. إعداد العالية النقاء خالية من الذيفان جرنة ناقلات التعبير فضلا عن بلازميد المانحة HDR باستخدام ماكسيبريب بلازميد كيت (انظر الجدول للمواد).
2. شارك حقن بلازميد التعبير جرنة (100 نانوغرام/ميكروليتر) واستبدال الجهة المانحة (500 نانوغرام/ميكروليتر) في germline من الأجنة Cas9 غ ⁶. ملاحظة: نحن نستخدم خدمة تجارية للحقن، ولكن يمكن إجراء هذه العملية في المختبر، وكذلك.
3. تحرك لعلم الوراثة والفرز (الشكل 2 و الشكل 3):
   1. عند حقن الأجنة تتطور إلى الكبار، عبر كل ز واحد₀ الذباب للذباب موازن التحميل. حدد موازن مناسبة كروموسوم يحتوي على اليل المستهدفة.
   2. تخدير F1 ذرية من كل G0 الصليب على لوح₂ CO وعشوائياً اختيار الذكور 10-20 تحت ستيريوميكروسكوبي. الصليب منهم على حدة للإناث موازن التحميل كما هو مبين في الشكل 3.
   3. عندما هاتش اليرقات F2، اختيار الأب F1 واحد من كل الصليب واستخراج جدنا باستخدام الحمض النووي الجينومي يطير واحد إعداد البروتوكول:
      1. إعداد المخزن المؤقت لاستخراج جدنا: 10 ملم تريس Cl pH 8.2، يدتا 1 مم، 25 مم كلوريد الصوديوم، تخزين في درجة حرارة الغرفة. إعداد 20 ملغ/مل "ك بروتيناز" حل الأسهم وتخزينها في الثلاجة.
      2. وضع كل ذبابة في أنبوب مايكرو--أجهزة الطرد مركزي 1.5 مل وتسمية الأنبوب. تبقى في الثلاجة-80 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
      3. إعداد كمية عامل طازجة من جدنا استخراج مخزن يحتوي على 200 ميكروغرام/مل التركيز النهائي "بروتيناز ك."
         ملاحظة: لا تستخدم مخزن قديم لهذه الخطوة.
      4. اسحق كل يطير ل s 10 – 15 مع تلميح ماصة تحتوي على 50 ميكروليتر من سكويشينج المخزن المؤقت دون الاستغناء عن السائل. الاستغناء عن المخزن المؤقت المتبقية في الأنبوب ومزيج جيد. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 20-30 دقيقة.
      5. وضع الأنابيب في كتلة حرارة 95 درجة مئوية لمدة 1 – 2 دقيقة لإلغاء تنشيط "ك. بروتيناز"
      6. معين باستمرار لمدة 5 دقائق في 10,000 س ز. تخزين إعداد عند 4 درجة مئوية لمزيد من التحليل PCR.
4. استخدام نفس الأسلوب لإعداد جدنا من ذبابة nos Cas9 ، الذي يعمل كعنصر سلبي. أداء شاشات بكر على أساس ثلاث خطوات لتحديد استخدام تقرير التنمية البشرية (الشكل 2، الرقم 5) الصحيح "ينتهي من" جدنا لكل أنثى F1 ك قالب⁵. استخدم 1 ميكروليتر من الإعدادية الحمض النووي في نظام تفاعل PCR التالية: 10 ميكروليتر من 2 × بكر سيد ميكس مع صبغ، 1 ميكروليتر من كل التمهيدي (10 ميكرومترات)، 1 ميكروليتر من قالب الحمض النووي، وميكروليتر 7 ddH₂o.
5. كما هو موضح في الشكل 5A، إجراء PCR باستخدام fwd1 الإشعال و rev1 إلى الشاشة لوجود الإدراج أو الاستبدال؛ إجراء PCR باستخدام كبسولة تفجير fwd2 و rev2 للتحقق من الإدراج أو الاستبدال من 3 ' المنطقة؛ إجراء PCR باستخدام كبسولة تفجير M13F و rev3 للتحقق من "ينتهي في" تقرير التنمية البشرية (الجدول 1).
6. الحفاظ على خطوط الطيران مع HDR من الغايات المؤكدة وإنشاء مخزون متوازنة من جيل F2. التهجين على الذباب موازن التحميل مرة أخرى لإزالة أي الطفرات غير مقصودة في الكروموسومات الأخرى.
7. إعداد جدنا عالية الجودة من الأرصدة الثابتة لتضخيم بكر الطويل (> 800 – 1,000 nt) amplicon مع بوليميريز بوليميراز عالية الدقة والتسلسل الكامل التحقق من أمبليكونس التي تم الحصول عليها من مناطق الجينوم هندسيا. وبدلاً من ذلك، استخدم استخراج النفط الخام جدنا كما هو موضح في وقت سابق إلى تضخيم أقصر (< 800 nt)، تداخل منتجات PCR للجينوم المحرر التحقق من التسلسل. باستخدام بروتوكول التالية للتحضير الجيد المورفولوجية المجينية الحمض النووي:
   1. حوالي 25 من الذباب الكبار في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل، وتجميد في الثلاجة-20 درجة مئوية أو-80 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة على الأقل.
   2. إضافة 250 ميكروليتر من الحل A (pH 9.0 تريس HCl 0.1 M، يدتا م 0.1، الحزب الديمقراطي الصربي 1%).
   3. مجانسة الذباب باستخدام المدقات المتجانس في أنابيب ميكروسينتريفوجي، ووضعت الأنبوب على الجليد.
   4. تبني على 70 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
   5. إضافة 35 ميكروليتر كوك (5 م) ويهز المزيج جيدا، ولكن لا دوامة.
   6. تبني على الجليد لمدة 30 دقيقة.
   7. تدور في 12,000 س ز لمدة 15 دقيقة.
   8. مع ميكروبيبيتي 1 مل، بعناية نقل المادة طافية واضحة فقط إلى أنبوب جديد، ترك مرة أخرى أي متسرعا أو الطور البيني.
   9. إضافة 150 ميكروليتر من الايزوبروبانول للمادة طافية. المزيج بلطف بانعكاس.
   10. تدور في 10,000 س ز لمدة 5 دقائق.
   11. بعناية إزالة المادة طافية وترك بيليه في الأنبوب.
   12. أغسل بيليه مع 1 مل 70% EtOH.
   13. تدور في 12,000 س ز لمدة 5 دقائق.
   14. إزالة المادة طافية. الهواء الجاف بيليه لمدة 15 إلى 20 دقيقة. لا جاف أكثر بيليه.
   15. حل بيليه في 100 ميكروليتر ddH₂o.
   16. استخدام عالية الدقة بوليميراز الدنا مناسبة ل amplicon طويلة (> 800 شركة بريتيش بتروليوم) لتضخيم المنطقة المحررة كاملة. ومن الناحية المثالية، أن كبسولة تفجير اثنين خارج كاسيت المدرج تضخيم منطقة الجينوم. هلام تنقية المنتج بكر، وكما هو موضح سابقا، تسلسل التحقق من المنتج مع الإشعال متداخلة متعددة.
8. التحقق من صحة أنماط التعبير الزمانية المكانية الصحيحة من تشريح أنسجة الأجنة/خطوط الطيران هندسة:
   1. أداء RT-PCR من الجيش الملكي النيبالي إجمالي للتحقق من التعبير عن المنتج مرناً الهجين (الجدول 1).
   2. إجراء تهجين في الموقع للمنتج مرناً للمصلحة في الأنسجة/الجنين اليرقات للتحقق من صحة التعبير.
   3. على الشاشة لأنماط التعبير الزمانية المكانية الخاصة بالانسجة الدقيقة بين خطوط تنتهي التحقق من التسلسل، عبر كل من الخطوط التي تم تحريرها تم الحصول عليها لبرنامج تشغيل التعبير ثنائي مع لكسو-التجارة والنقل أو لكسو-طلب تقديم العروض (بالنسبة ليزا سائق) خط (متاح من مراكز الأسهم بلومينغتون) ومراقبة ليزا أو Gal4 مدفوعة التعبير الجيني مراسل في أنسجة الجنين، اليرقات، والكبار تحت مجهر الأسفار.

النتائج

هذا البروتوكول استخدمت بنجاح لإنشاء تعبير ثنائي المستهدف مراسل نظام محدد ل bnl معربا عن الخلايا⁵. رابطة الدول المستقلة-لا تتسم العناصر التنظيمية (CREs) التي تتحكم في التعبير الزمانية المكانية المعقدة bnl . ولذلك، صمم إكسون الترميز الأول فقط من bnl

Discussion

تقليديا، تم إنشاؤها المورفولوجية محسن الفخاخ بطريقتين مختلفتين. واحدة من الطرق تشمل الإدراج عشوائي من برنامج التشغيل (على سبيل المثال.، Gal4) تسلسل جينوم بتبديل (مثلاً.، تبديل عنصر P)¹ . بدلاً من ذلك، يمكن وضع تسلسل سائق تحت سيطرة منطقة محسن/المروج المفترضة في بناء ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
X-Gal/IPTG	Gentrox (Genesee Scientific)	18-218	cloning
LB-Agar	BD Difco	BD 244520	cloning
Tris-HCl	Sigma Aldrich	T3253	Molecular Biology
EDTA	Sigma Aldrich	E1161	Molecular Biology
NaCl	Sigma Aldrich	S7653	Molecular Biology
UltraPure DNase/RNase-Free Water	ThermoFisher Scientific	10977-023	Molecular Biology
10% SDS	Sigma Aldrich	71736	Molecular Biology
KOAc	Fisher-Scientific	P1190	Molecular Biology
EtOH	Fisher-Scientific	04-355-451	Molecular Biology
GeneJET Miniprep	ThermoFisher Scientific	K0503	Miniprep
PureLink HiPure Plasmid Maxipep kits	ThermoFisher Scientific	K210006	Maxiprep
BbsI	NEB	R0539S	Restriction enzyme
Primers	IDT-DNA		PCR
pCFD4	Kornberg Lab		DNA template and vector for gRNA
KAPA HiFi Hot Start- (Kapa Biosystems)	Kapa biosystems	KK2601	PCR
Q5-high fidelity Taq	NEB	NEB #M0491	PCR
Gibson Assembly Master Mix	NEB	NEB #E2611	DNA assembly
pBPnlsLexA:p65Uw	Addgene		DNA template for LexA amplification
Proteinase K	ThermoFisher Scientific	25530049	Molecular Biology
2x PCR PreMix, with dye (red)	Sydlab	MB067-EQ2R	Molecular Biology
Gel elution kit	Zymo Research (Genesee Scientific)	11-300	Molecular Biology
TRI reagent	Sigma-Aldrich		Molecular Biology
Direct-zol RNA purification kits	Zymo Research (Genesee Scientific)	11-330	Molecular Biology
OneTaq One-Step RT-PCR Kit	NEB	E5315S	Molecular Biology
lexO-CherryCAAX	Kornberg Lab		Fly line
UAS-CD8:GFP	Kornberg lab		Fly line
btl-Gal4	Kornberg lab		Fly line
MKRS/TB6B	Kornberg lab		Fly line
Confocal Microscope SP5X	Leica		Imaging expression pattern
CO2 station	Genesee Scientific	59-122WCU	fly pushing
Stereo microscope	Olympus	SZ-61	fly pushing
Microtube homogenizing pestles	Fisher-Scientific	03-421-217	genomic DNA isolation
NanoDrop spectrophotometer	ThermoFisher Scientific	ND-1000	DNA quantification