JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا، نحن تقرير توطين الفلورة دينامين لتوضيح البروتوكولات للكشف عن البروتينات في الفروع البربخيه جزءا لا يتجزأ من البارافين الماوس وتلك الخلية البربخيه مخلدة خط (mECap18). ونحن أيضا وصف البروتوكولات من أجل عزل البروتينات الافرازية من السوائل البربخيه وخلية مكيفة وسائل الإعلام.

Abstract

البربخ الثدييات يولد واحد من السوائل intraluminal أعقد من أي الغدة الصماء بغية دعم الخصية بعد نضوج وتخزين المني. وينشأ هذا التعقيد نظراً لنشاط الخلايا الظهارية بطانة افرازية والاستيعابية مجتمعة. هنا، يمكننا وصف تقنيات لتحليل البروتين البربخيه وإفراز بالتركيز على نموذج الأسرة البروتين من ميتشانوينزيميس دينامين (الإدارة)؛ جتباسيس الكبيرة التي لديها إمكانات لتنظيم الاتجار الأحداث غشاء ثنائي الاتجاه. لدراسة التعبير البروتين في الأنسجة البربخيه، يمكننا وصف منهجية قوية لوسم الفلورة البروتينات المستهدفة في أقسام جزءا لا يتجزأ من البارافين والكشف عن اللاحقة للتوزيع المكاني لهذه البروتينات عن طريق مجهر الفلورة. ونحن أيضا وصف المنهجية الأمثل لعزل وتوصيف اكسوسومي مثل حويصلات، المعروفة باسم ابيديديموسوميس، وهي تفرز في التجويف البربخيه للمشاركة في الاتصالات بين الخلايا مع نضوج الخلايا المنوية. كنهج تكميلي، يصف لنا أيضا كشف الفلورة البروتينات المستهدفة في خط خلية الظهارية البربخيه (mECap18) نصيب خلد SV40 ماوس. وعلاوة على ذلك، فإننا نناقش الأداة خط الخلية mECap18 كنموذج مناسب في المختبر لاستكشاف تنظيم نشاط افرازي البربخيه معها. لهذا الغرض، يصف لنا تثقيف متطلبات الصيانة خط الخلية mECap18 واستخدام أنظمة انتقائية تثبيط الدوائية القادرة على التأثير على بروتين افرازي الشخصية. سهولة تقييم هذه الأخيرة عن طريق الحصاد مكيفة الثقافة المتوسطة، وتركيز البروتينات يفرز عن طريق ترسيب حمض التريكلوروسيتيك/الأسيتون وتحليلها لاحقاً عبر الحزب الديمقراطي الصربي صفحة و immunoblotting. نؤكد أن هذه الأساليب مجتمعة مناسبة لتحليل الأهداف البديلة البروتين البربخيه تمهيدا لتحديد دورها الوظيفي في نضوج الحيوانات المنوية و/أو تخزين.

Introduction

المني من جميع أنواع الثدييات اكتساب القدرة على عرض الحركة التقدمية إلى الأمام وتسميد البويضة خلال تلك النسب المطول عن طريق البربخ، منطقة متخصصة للغاية من النظام الذكور مجرى الهواء خارج الخصية، التي قد 7-14 يوما للتنقل (تبعاً للأنواع الأحيائية)1. بسبب التكثيف الشديد من الكروماتين الأب وسفك معظم السيتوبلازم الذي يصاحب سيتوديفيرينتييشن المني في الخصيتين، مدفوعة نضج الفنية اللاحقة حصرا بتفاعلها مع المكروية البربخيه. هذا الوسط، يخلق بدوره، بنشاط سوما البربخيه بطانة افرازية والاستيعاب ويعرض مستوى استثنائي من تباين الجزء-الجزء1. وهكذا، الجزء الأكثر نشاطا من حيث البروتين وإفراز تلك الواقعة في الجزء الأقرب من البربخ (أي نصيب الفرد والاحضار)2. هذا النشاط يعكس الشخصية الوظيفية للمني، مع بداية أول الخلايا لعرض السمات المميزة للاختصاص الوظيفي (أي.، الحركة التقدمية، والقدرة على ربط حمض سولوبيليزيد زونا glycoproteins) التالية على المرور عبر البربخ نصيب3. هذه السمات الفنية مواصلة تطوير قبل الوصول إلى المستويات المثلى كما الحيوانات المنوية تصل إلى الجزء البربخيه القاصي (كودا)، حيث يتم تخزينها في حالة هادئة في الاستعداد للقذف. تكوين وصيانة هذا الخزان في تخزين الحيوانات المنوية يرتبط ارتباطاً وثيقا أيضا ظهارة بطانة، التي يهيمن عليها النشاط الاستيعابية قوية4،5في كودا. رغم الاختلافات التشريحية عنها6،،من78، يبدو أن هذه الشعبة أقاليميا للعمل سمة من سمات البربخ مشترك بين معظم أنواع الثدييات ودرس بالتاريخ، بما في ذلك الخاصة بنا9،10. في الواقع، من وجهة نظر سريرية، فمن المعروف أن الخلل البربخيه يجعل مساهمة هامة إلى المسببات عامل الذكور العقم11، ومن ثم تسليط الضوء على أهمية فهم تنظيم هذه الأنسجة المتخصصة.

ولذلك فمن المؤسف أن فهمنا البربخيه علم وظائف الأعضاء، والآليات التي تنظم مراحل متتابعة لنضوج الحيوانات المنوية وتخزينها داخل هذا النسيج، لا يزال يتم حلها بالكامل. من بين العوامل المساهمة، هي تحد من التقدم في البحوث البربخيه الشاملة تعقد هذا النسيج ومعرفة الآليات التي تمارس التحكم به المكروية لومينال التنظيمية. تشريحيا، ونحن نعلم أن وراء تمييز شرائح نصيب والاحضار وكاودا، يمكن تقسيم في البربخ كذلك إلى عدة مناطق (الشكل 1A)، كل فصل بواسطة سيبتا12 وتتميز بالتشكيلات الجانبية منفصلة من الجينات/البروتين التعبير13،،من1415،16،،من1718. في الواقع، على أساس مفصلة النسخي التنميط التعبير الجيني القطاعي في البربخ وأبلغ ما يصل إلى 6 و 9 مناطق البربخيه متميزة في نماذج الماوس وفار، على التوالي19،20. هذا التعقيد يفترض أن يعكس تكوين سوما البربخيه، ظهارة بسيودوستراتيفيد تتألف من العديد من أنواع الخلايا المختلفة؛ كل اختلاف فيما يتعلق بأنشطتها الوفرة والتوزيع والافرازيه/الاستيعاب على طول المسالك. وهكذا، هي الخلايا الرئيسية حتى الآن الأكثر وفرة خلية البربخيه نوع التي تشكل ما يزيد عن 80 في المائة من كافة الخلايا الظهارية. وبناء على ذلك، الخلايا الرئيسية المسؤولة عن الجزء الأكبر من البروتين البربخيه الحيوي وإفراز5. وفي المقابل، السكان الخلية واضحة، وهي مرتبة حسب نوع الخلية الثانية الأكثر وفرة داخل سوما البربخيه، أساسا تشارك في انتقائية امتصاص مكونات لومينال وتحمض هذا المكروية5. إضافة مستوى آخر من التعقيد، الاندروجين وغيرها من العوامل لوميكريني من أصل الخصية تمارس سيطرة التفاضلية على كل نوع من أنواع هذه الخلية البربخيه اعتماداً على تحديد المواقع على طول المسالك.

على الرغم من القيود التي تفرضها هذه الدرجة من التعقيد، تواصل نجاحات كبيرة إلى حل أساس الميكانيكية للدالة البربخيه. مفتاح لهذه الدراسات تم تطبيق استراتيجيات متقدمة الطيف الكتلي لإنشاء قوائم جرد واسعة النطاق من البروتين البربخيه، بالترادف مع تحليلات مفصلة للبروتينات الفردية يختارون من بين هذه الدراسات الأولية. مثال على هذا النهج هو لدينا توصيف الأخيرة لعائلة ميتشانوينزيميس في نموذج الفأر21ازدحاما. كان يغذيها اهتمامنا الأولى ازدحاما العمل المزدوج في الاقتران أكسو-والعمليات اندوسيتوتيك. وبناء على هذه الملاحظات، كنا قادرين على إثبات أن isoforms المتعارف عليه ثلاثة من ازدحاما (DNM1-DNM3) أعرب عن درجة عالية في البربخ الماوس والمتمركزة على النحو المناسب للوفاء بأدوار تنظيمية في إفراز البروتين وامتصاص21 . وعلاوة على ذلك، كنا قادرين على التمييز بوضوح كل isoform ازدحاما على أساس بهم التعريب الخلوية ودون الخلوية، مما يشير إلى أن لديهم متكاملة، بدلاً من نشاط زائدة عن الحاجة، داخل ظهارة البربخيه21.

وهنا، يمكننا وصف المنهجية التجريبية المستخدمة لدراسة التعبير ازدحاما في البربخ الماوس مع الأمل في أن هذه المعلومات سوف تجد تطبيقها على نطاق أوسع في توصيف البروتينات البربخيه البديلة والمساهمة بالتالي في موقعنا فهم وظيفة هذا العنصر الهام من المسالك التناسلية الذكور. على وجه التحديد، يمكننا وصف وضع منهجية قوية لوسم الفلورة البروتينات المستهدفة في الفروع البربخيه جزءا لا يتجزأ من البارافين والكشف عن اللاحقة للتوزيع المكاني لهذه البروتينات عبر الفلورة الفحص المجهري. ونحن كذلك الوثيقة بروتوكولات مؤخرا الأمثل لدينا22 لعزل وتوصيف ابيديديموسوميس؛ حويصلات اكسوسومي مثل الصغيرة التي تشكل العناصر الرئيسية للشخصية الافرازية البربخيه والاحتفاظ بدور بارز في تعزيز نضوج الحيوانات المنوية23على ما يبدو. كنهج تكميلي، ونحن أيضا وصف الفلورة الكشف عن البروتينات المستهدفة في خط خلية الظهارية البربخيه (mECap18) نصيب مخلدة ماوس واستخدام هذا المورد كنموذج لاستكشاف تنظيم البربخيه نشاط افرازي في المختبر.

Protocol

وافق جميع الإجراءات التجريبية التي تنطوي على جمع الأنسجة الحيوانية جامعة نيوكاسل للعناية بالحيوان ولجنة الأخلاقيات.

1-الفلورة تلطيخ الفروع البربخيه جزءا لا يتجزأ من البارافين (الشكلان 1 و 2)

  1. مباشرة بعد القتل الرحيم للفئران الكبار عن طريق استنشاق أول أكسيد الكربون2 (الفئران السويسرية، ما يزيد على 8 أسابيع من العمر)، بعناية تشريح البربخ (باستخدام المقص الجراحي وملاقط) مجاناً تغمر الأنسجة الضامة والدهون وتزج في مثبت في بوين الحل (> عشرة إضعاف حجم/الأنسجة الوزن) للتثبيت بين عشية وضحاها.
  2. تغسل الأنسجة مع الإيثانول 70% مع التغييرات × 2 يوميا لمدة يومين ويذوي ثم عن طريق الإيثانول متدرج (70%، 95% و 100%) استعدادا لعمليات التسلل وتضمينها في كتلة بارافين.
  3. الفرع كتل البارافين في سمك من 4-6 ميكرون وجبل على الشرائح استعدادا لتلطيخ الفلورة.
  4. في غطاء دخان، دو الفروع البربخيه البارافين بإضافة كمية كافية من زيلين نفط لجره الشريحة تماما تزج قسم الأنسجة (3 × 5 دقيقة في كل مرة).
  5. ترطيب أقسام الأنسجة بالانغماس في حلول الإيثانول متدرج المخفف في تنقية ح2س (الإيثانول 100% 5 دقيقة، الإيثانول 100% 5 دقيقة، الإيثانول 90% 1 دقيقة، الإيثانول 80% 1 دقيقة، الإيثانول 70% 1 دقيقة، والإيثانول 50% 1 دقيقة).
  6. أغسل المقاطع في جرة شريحة مرة واحدة لمدة 5 دقائق مع كافية الفوسفات مخزنة المالحة (بي بي سي) تزج تماما المقطع كامل الأنسجة (اتبع هذه التوجيهات لجميع يغسل اللاحقة).
  7. صب حل استرجاع مستضد المناسبة (أي.، 10 سترات الصوديوم mmol/لتر أو mmol/لتر pH تريس 10.5 اﻷض استرجاع مستضد البديلة، اعتماداً على مستضد يتم الكشف عن 50) إلى حامل الشرائح والميكروويف حتى الغليان. تزج الشرائح في هذا الحل، ورهنا بأقسام الأنسجة الناجمة عن الحرارة مستضد استرجاع الظروف الأمثل لأجسام الفردية (انظر الجدول 1).
    تنبيه: تأكد من أن الشرائح تكون مغمورة تماما في حل استرجاع مستضد أثناء عملية استرداد مستضد.
  8. إزالة الحاوية الشريحة من الميكروويف وباردة بدرجة حرارة الغرفة.
  9. شطف الشرائح مع برنامج تلفزيوني واستخدام قلم ماركر شريحة سائل طارد لتتبع حول المقطع الأنسجة.
  10. ضع الشرائح في وعاء هوميديفيد (الذي أنشأته ترطب أنسجة في قاعدة الحاوية)، وتطبيق حظر الحل (3% جيش صرب البوسنة/برنامج تلفزيوني، سابقا تمت تصفيتها من خلال عامل تصفية 0.45 ميكرومتر) ح 1 في 37 درجة مئوية.
  11. شطف الشرائح مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني.
  12. احتضان الفروع مع جسم الأساسي المناسب المخفف بتركيز أمثل تجريبيا في المصفاة 1% لجيش صرب البوسنة/برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها (1:60 لمكافحة--DNM1، DNM2، و DNM3 الأجسام المضادة؛ 1: 100 للأجسام المضادة-ATP6V1B1، انظر "الجدول للمواد" للحصول على تفاصيل جسم).
    ملاحظة: لتمييز محددة من جسم غير محددة ملزمة، من الضروري أن تشمل السلبية الصارمة (أي.، جسم الثانوي الأساسي فقط، وجسم بريابسوربيد ضد تحصين الببتيد) و24من عناصر إيجابية.
  13. ريوارم الشرائح عن طريق وضع في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
  14. أغسل × الشرائح 3 مع برنامج تلفزيوني على منصة تهز (60 لفة في الدقيقة) لمدة 10 دقائق.
  15. احتضان الفروع مع جسم الثانوي المناسب المخفف في 1% جيش صرب البوسنة/برنامج تلفزيوني (التي تمت تصفيتها من خلال عامل تصفية 0.45 ميكرومتر) في 37 درجة مئوية ح 1 (تخفيف 1: 400 لجميع الأجسام المضادة الثانوية، انظر الجدول للمواد لتفاصيل جسم).
    تنبيه: إبقاء الحاوية الشريحة في الظلام من هذه الخطوة فصاعدا. لوضع العلامات المزدوجة، اختر مجموعة متوافقة من الأجسام المضادة الثانوية (أي.، الأجسام المضادة الثانوية يجب أن أثيرت في الأنواع المختلفة).
  16. أغسل × الشرائح 3 مع برنامج تلفزيوني على منصة تهز (60 لفة في الدقيقة) لمدة 10 دقائق.
  17. كونتيرستين الأقسام مع يوديد propidium (PI، 7.48 μmol/لتر) أو 4΄، 6-دياميدينو-2-فينيليندولي (DAPI، 4.37 μmol/لتر) لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لتسمية نواة الخلية.
  18. يغسل الشرائح مرتين مع برنامج تلفزيوني على منصة تهز (60 لفة في الدقيقة) لمدة 5 دقائق.
  19. تحميل المقاطع بنسبة 10% على استعداد موويول 4-88 في حل والغليسيرول 30% في 0.2 mol/L تريس (pH 8.5) و 2.5% 1، 4--ديازابيسيكلو--(2.2.2)-أوكتان.
  20. ختم ساترة مع مسمار الورنيش وتخزين الشرائح عند 4 درجة مئوية للمراقبة مستقبلا.
    تنبيه: من المستحسن القيام تصوير الشرائح أقرب وقت ممكن عمليا بعد إعداد لتجنب فقدان المفرط للأسفار.

2 عزل ابيديديموسوميس من البربخ نصيب الماوس (الشكل 3)

  1. مباشرة بعد القتل الرحيم للفئران الكبار عن طريق استنشاق أول أكسيد الكربون2 (الفئران السويسرية القديمة أكثر من 8 أسابيع)، نتخلل بهم المفرج مع برنامج تلفزيوني (قبل تسخينها إلى 37 درجة مئوية) للتقليل من تلوث الدم البربخيه الأنسجة.
    تنبيه: تحتوي بلازما الدم على السكان متنوعة من اكسوسوميس، وذات حجم مماثل إلى ابيديديموسوميس25. كفاءة إزالة الدم من الأنسجة البربخيه يمكن الوصول إليها عن طريق التفتيش على الجزء الأول، يقع قطعة البربخيه vascularized العالية الدانية للجزء المتعلق بنصيب الفرد (أي.، المنطقة 1 في الشكل 1A)
  2. تشريح البربخ خالية من الدهون السطحية والنسيج الضام، وشطف مع المعدل المتوسط بيجيرس ويتون ويتنجهام (BWW؛ ودرجة الحموضة 7.4، أوسمولاليتي من 300 ميللي مول/كغ المياه26،27) بعناية للحد من أي احتمال للسطح تلوث الدم.
  3. لطخة الأنسجة البربخيه لإزالة الوسائط الزائدة، وتشريح البربخ نصيب الفرد (أي.، مناطق 2-5 في الشكل 1A) ونقل إلى طبق بتري طازجة (35 × 10 مم) التي تحتوي على BWW المتوسطة. ضمان أن يبلغ متوسطة كافية للاسترداد النهائي.
    ملاحظة: ل 6 نصيب ابيديديميديس، من المستحسن استخدام 1.1 مل المتوسط للسماح باسترداد ~ 900 ميليلتر، ثم يتم بالتساوي تقسيم وتطبق فوق 2 التدرجات المعدة مسبقاً (راجع الخطوة 2.9).
  4. جعل عدد من شقوق صغيرة في الأنسجة نصيب مع شفرة حلاقة. لا تخطر على الأنسجة وبالتالي تجنب تلويث العينة مع محتويات سيتوسوليك المفرطة. احتضان اللوحة التي تحتوي على الأنسجة بالانفعالات معتدل في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة للإفراج عن محتويات لومينال.
  5. تصفية بتعليق ما ينجم عن ذلك من خلال 70 ميكرومتر الأغشية لإزالة الحطام الخلوية.
  6. جمع فيلتراتي ورهنا بهذه الخطوات المتعاقبة الطرد المركزي في 4 درجات مئوية مع زيادة السرعة من أجل إزالة الحطام الخلوية (أي.، 500 × ز2,000 × ز× 4,000 ز، 8,000 × ز،، 5 دقيقة كل؛ 000 17 × ز لمدة 20 دقيقة، وأخيراً 17,000 × ز 10 دقائق إضافية أو حتى يتم تشكيل لا بيليه بعد الطرد المركزي).
    تنبيه: من المهم تقييم لون بيليه بعد خطوة الطرد المركزي ز 500 × أولية للتأكد من تلوث الدم الحد الأدنى الحالي. تجاهل أي عينات الذي يعرض هذا بيليه التلون الوردي.
  7. إعداد التدرجات إيوديكسانول متقطع (تضم 40%، 20%، 10%، 5% الطبقات) بإضعاف كثافة متوسطة متدرجة (التي تضم 60% (w/v) مائي إيوديكسانول) مع حل 0.25 mol/L السكروز و 10 ملمول/لتر تريس (درجة الحموضة 7.5).
  8. إعداد التدرج في أنبوب أولتراسينتريفوجي (11 × 35 ملم)، مع كل جزء من 450 ميليلتر (الشكل 3). فحص التدرج بصريا بعد تطبيق كل جزء لضمان أن الواجهات تتشكل بنجاح بين كل طبقة قبل تحميل عينة السائل البربخيه. إعداد كل الطازجة التدرج في يوم الاستخدام، ومع ذلك، يمكن الحفاظ على عينة السائل لومينال البربخيه عند 4 درجة مئوية لتصل إلى 2 حاء قبل التحميل.
  9. إضافة 450 ميليلتر البربخيه لومينال السوائل تعليق (المقابلة للمواد التي تم جمعها من نصيب فرد ابيديديميديس 3) قمة التدرج واحدة بعناية.
  10. أولتراسينتريفوجي التدرجات في × 160,000 ز في 4 درجات مئوية عن ح 18.
    تنبيه: حيث يجري هذا الطرد المركزي بسرعة عالية جداً، جميع ultracentrifuge الأنابيب يجب إقران ومتوازنة تماما. فحص الأنابيب التأكد من أنها خالية من أي ضرر مرئية التي يمكن أن تهدد سلامتهم.
  11. إزالة بلطف الكسور تساوي 12 (يتألف كل منهما من 185 ميليلتر) بدءاً من الطبقة العلوية وتتقدم باتجاه الجزء السفلي من التدرج. تجمع الكسور يعادل تعافي من كل التدرج إذا أمكن (التدرجات يصل إلى اثنين).
    ملاحظة: انظر الماوس ابيديديموسوميس هي الأكثر التخصيب في22من الكسور 9-11، الرقم 4 ، والمناقشة.
  12. بعد الانتعاش وتجميع الكسور 9 – 11، يؤدي إلى تمييع العينات في 100,000 × ز في 4 درجات مئوية عن 3 ح (13 × 56 ملم أنبوب) بيليه ابيديديموسوميس إلى 2 مل من برنامج تلفزيوني، وأولتراسينتريفوجي.
    تنبيه: حيث يمكن أن يكون من الصعب على انظر بيليه ابيديديموسومي، ضمان أن يلاحظ اتجاه الأنابيب كما أنها توضع في الدوار ووضع علامة على أنبوب للإشارة إلى موقف بيليه ابيديديموسومي الحوامل. التأكد من أن كل أنبوب يحتوي على وحدة تخزين كافية (أي.، تتجاوز 50 في المائة قدرتها الإجمالية) يحول دون خطر انهيار أنبوب.
  13. نضح وتجاهل المادة طافية بدون إزعاج بيليه ابيديديموسومي بعناية.
  14. تقييم نقاء ابيديديموسومي (الشكل 4).
  15. ريسوسبيند بيليه ابيديديموسومي في المتوسط المطلوب وفقا التطبيق (التطبيقات) المتلقين للمعلومات. على سبيل المثال، يستخدم عادة BWW المتوسطة للتجارب التي تنطوي على الحضانة المشتركة مع المني، أو كبديل مؤقت تحلل مناسبة استعدادا لحل البروتين البربخيه عبر الحزب الديمقراطي الصربي صفحة.

3-الفلورة Staining من الخلايا mECap18

  1. إعداد كوفيرسليبس عقيمة (التي تجري بغطاء ثقافة خلية)
    1. نقع كوفيرسليبس (12 × 12 مم) في الإيثانول 70% لمدة 10 دقائق وتعقيمها قبل التجفيف تحت درجة حرارة عالية أعلاه مصباح إيثانول.
    2. كول ساترة لمدة 10 ق قبل نقل إلى لوحة جيدا 12.
    3. تطبيق الحل بولي-L-يسين العقيمة لتغطية ساترة وتسوية لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    4. تجاهل الحل بولي-L-يسين وشطف ساترة مع العقيم ح2س أو مناسبة متوسطة.
  2. إعداد mECap18 الخلايا
    1. ممر مختبرين 2 × 105 mECap18 الخلايا في كل بئر 12 لوحة جيدا التي تحتوي على كوفيرسليبس.
    2. الثقافة الخلايا مع mECap18 خلية متوسطة (دميم وتستكمل مع 1% ل الجلوتامين، بيروفات صوديوم 1%، 1% البنسلين/ستربتوميسين، و 5α-androstan-17β-ol-3-oneC-IIIN 50 μmol/لتر) تحتوي على العجل الجنين 10% مصل (FBS) في حاضنة 37 درجة مئوية تحت الغلاف الجوي 5% CO2 بين عشية وضحاها.
    3. وبمجرد الخلايا التمسك ساترة، تجاهل المتوسطة وشطف الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني.
    4. أضف كمية كافية من 4% بارافورمالدهيد (PFA) المخفف في برنامج تلفزيوني أن تزج أكمله ساترة وإصلاح الخلايا في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
    5. تجاهل حل منهاج عمل بيجين وشطف كوفيرسليبس مرتين في برنامج تلفزيوني.
  3. تلوين الفلورة
    1. بيرميبيليزي الخلايا mECap18 بالانغماس في 0.1% X-100 تريتون في برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقائق.
    2. أشطف كوفيرسليبس مع برنامج تلفزيوني.
    3. كتلة الخلايا mECap18 مع جيش صرب البوسنة 3%، والمضي قدما في إيمونولابيلينج خلايا التي تستخدم بروتوكولات مكافئة لتلك الموصوفة للفروع البربخيه الأنسجة.

4-عزل البروتينات من الخلية مكيفة الثقافة المتوسطة

  1. جمع خلية مكيفة الثقافة المتوسطة
    1. لوحة مختبرين مرور من5 × 10 4 mECap18 الخلايا في كل بئر من 6 جيدا مع mECap18 الخلية المتوسطة وتستكمل مع 10% FBS ح 24.
    2. يغسل خلايا mECap18 ثلاث مرات مع mECap18 الخلية المتوسطة (أعدت دون FBS) لإزالة بقايا FBS وأي المرتبطة الملوثات البروتين.
    3. إضافة 1.5 مل من mECap18 الخلية المتوسطة (أعدت دون FBS) لكل بئر واحتضان مع خلايا mECap18 ح 12 في حاضنة 37 درجة مئوية تحت 5% CO2.
      ملاحظة: يمكن تقييم الخلايا mECap18 في هذه الخطوة المستضدات المستهدفة المختلفة وفقا للتصميم التجريبي.
    4. بعد حضانة ح 12، جمع الخلية المتوسطة وأجهزة الطرد المركزي في 2,000 × ز لمدة 10 دقيقة لإزالة جميع الأنقاض الخلوية.
      ملاحظة: مدة حضانة المرض قادرة على تغيير وفقا لتقييم التصميم التجريبي/نقطة النهاية، واعتبار التسامح للخلية إلى treatment(s) التطبيقية. من المستحسن لتكييف توقيت الحضانة استناداً إلى أنظمة تجريبية محددة ضمان تحقيق النتائج المثلى.
    5. تقييم جدوى خلية mECap18 عن طريق تطبيق مقايسة استبعاد معيار تريبان الأزرق28. تجاهل جميع المواد التي انخفض بقاء الخلية أقل من 90 في المائة للقضاء على التحيز القائم على الأخذ بالبروتينات أطلق سراحهم من الخلايا ميتة أو محتضرة.
    6. عزل البروتينات من الخلية المتوسطة كما يلي أو الحفاظ على المتوسط في-80 درجة مئوية.
  2. عزل بروتين (تجري بغطاء دخان)
    1. إضافة 20% حجم مبردة حمض التريكلوروسيتيك 100% إلى 80% حجم الخلية مكيفة المتوسطة ويعجل بالبروتينات أطلق سراحهم من الخلايا mECap18 مثقف. تبني في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها مع الخلط المستمر.
    2. بعد الاحتضان، بيليه بروتين سرع بالطرد المركزي (17، 000 × ز، 4 درجة مئوية لمدة 10 دقائق).
      ملاحظة: نظراً لكمية محدودة من البروتين ومن المتوقع أن يكون يفرز في المتوسط، فإنه من الممكن أن بيليه سوف لا تصور بسهولة بعد الطرد المركزي. ولذلك من الضروري توجيه الأنبوب قبل الطرد المركزي والحرص على عدم تعكير موقع بيليه الحوامل أثناء إزالة المادة طافية بشكل صحيح.
    3. تجاهل المادة طافية وتغسل بيليه مرتين مع الأسيتون المبرد قبل الطرد المركزي إعادة (17، 000 × ز، 4 درجة مئوية لمدة 10 دقائق).
    4. بعناية إزالة وتجاهل المادة طافية قبل التجفيف أي الأسيتون المتبقية داخل غطاء دخان.
    5. ريسوسبيند بيليه البروتين في مخزن مؤقت لاستخراج مناسبة استعدادا لتحليل نقطة النهاية للكشف عن ملامح بروتين افرازي كاملة و/أو البروتينات المستهدفة الفردية (على سبيل المثال-، الحزب الديمقراطي الصربي صفحة، إيمونوبلوتينج).

النتائج

الشكل 1 و الشكل 2 النتائج ممثلة لتوطين الفلورة ازدحاما في البربخ نصيب الماوس. بالتحقيق في كل من isoforms ازدحاما ثلاثة ملامح متميزة ومسلم عرض. وهكذا، يتسم DNM1 بوسم منتشر متواضعة نسبيا من الخلايا البربخيه طوال البربخ الجزء ونصيب الأولى ...

Discussion

أدرجت هذه الدراسات استخدام الأنسجة في بوين البربخيه الثابتة التي تعرضت لتضمين البارافين والبروتوكولات القياسية تقطيع. الحل مثبت في بوين تضم خليط من فورمالدهايد وحمض البكريك وحمض الخليك، مع كل مكون من مكونات لها وظيفة محددة ومتكاملة. وهكذا، والفورمالديهايد يتفاعل مع الأمينات الأولية لت?...

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

ويود المؤلفون الاعتراف بالصحة الوطنية والطبية أبحاث المجلس من أستراليا المشروع منحة APP1103176 لدعم هذا العمل.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Dynamin 1 antibodyAbcamab108458Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal
Dynamin 2 antibodySanta Cruzsc-6400Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal
Dynamin 3 antibodyProteintech14737-1-APHost species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal
ATP6V1B1 antibodySanta Cruzsc-21206Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal
CD9 antibodyBD Pharmingen553758Host species: Rat, Isotype: IgG, Class: monoclonal
Flotillin-1 antibodySigmaF1180Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal
ALOX15 antibodyAbcamab80221Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal
TUBB antibodySanta Cruzsc-5274Host species: Mouse, Isotype: IgG, Class: monoclonal
PSMD7 antibodyAbcamab11436Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal
Anti Rabbit Alexa Fluor 488ThermoA11008Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal
Anti Goat Alexa Fluor 488ThermoA11055Host species: Donkey, Isotype: IgG, Class: polyclonal
Anti Goat Alexa Fluor 594ThermoA11058Host species: Donkey, Isotype: IgG, Class: polyclonal
Anti Rat Alexa Fluor 594ThermoA11007Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal
Anti Rabbit HRPMilliporeDC03LHost species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal
Anti Rat HRPMilliporeDC01LHost species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal
Anti Mouse HRPSanta Cruzsc-2005Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal
4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)SigmaD9564
propidium iodide (PI)SigmaP4170
Mowiol 4-88Calbiochem475904
Bovine serum albumin (BSA)SigmaA7906
fetal bovine serum (FBS)BovogenSFBS-F
DMEMThermo11960-044
L-glutamineThermo25030-081
penicillin/streptomycinThermo15140-122
5α-androstan-17β-ol-3-oneC-IIINSigmaA8380
sodium pyruvateThermo11360-070
Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)SigmaT4049
Paraformaldehyde (PFA)EMS15710
XyleneVWR Chemicals1330-20-7
EthanolVWR Chemicals64-17-5
Phosphate buffered saline (PBS)SigmaP4417
Sodium citrateSigmaS1804
TrisAstral0497-5KG
GlycerolSigmaG5516
1, 4-diazabicyclo-(2.2.2)-octaneSigmaD2522
Poly-L-gysineSigmaP4832
Triton X-100Sigma78787
Trypan blueSigmaT6146
Trichloroacetic acidSigmaT9159
AcetoneAjax FinechemA6-2.5 L GL
SucroseSigmaS0389
Poly (vinyl alcohol)SigmaP8136
D-GlucoseAjax Finechem783-500G
OptiPrep Density Gradient MediumSigmaD1556
Fluorescence microscopyZeissZeiss Axio Imager A1
UltracentrifugeBECKMAN COULTEROptima Max-XP
MicrocentrifugesEppendorf5424R
IncubatorHeracell150
Large Orbital ShakerRatekOM7
MicrowaveLGMS3840SR /00
Lab pH MeterMeterLabPHM220
Liquid-repellent slide markerDaido SangyoMini
CoverslipThermo586
6 well plateCELLSTAR657160
12 well plateCELLSTAR665180
SlideMikro-GlassSF41296PLMK
0.45 µm filterMillox-HVSLHV033RS
Kimwipes Dustfree PaperKIMTECH34155
Ultracentrifuge tube (2.2 ml, 11 × 35 mm)BECKMAN COULTER347356
Ultracentrifuge tube (3.2 ml, 13 × 56 mm)BECKMAN COULTER362305
Cell strainer 70 µm NylonFALCON352350
Petri dish 35 × 10 mm with camsSARSTED82.1135.500
Slide jarTRAJAN#23 319 00

References

  1. Zhou, W., De Iuliis, G. N., Dun, M. D., Nixon, B. Characteristics of the Epididymal Luminal Environment Responsible for Sperm Maturation and Storage. Frontiers in Endocrinology. 9, 59 (2018).
  2. Dacheux, J. L., Gatti, J. L., Dacheux, F. Contribution of epididymal secretory proteins for spermatozoa maturation. Microscopy research and technique. 61 (1), 7-17 (2003).
  3. Aitken, R. J., et al. Proteomic changes in mammalian spermatozoa during epididymal maturation. Asian journal of andrology. 9 (4), 554-564 (2007).
  4. Hermo, L., Dworkin, J., Oko, R. Role of epithelial clear cells of the rat epididymis in the disposal of the contents of cytoplasmic droplets detached from spermatozoa. The American journal of anatomy. 183 (2), 107-124 (1988).
  5. Robaire, B., Hinton, B., Orgebin-Crist, M. . The epididymis. 3, (2006).
  6. Nixon, B., et al. Formation and dissociation of sperm bundles in monotremes. Biology of Reproduction. 95 (4), (2016).
  7. Cleland, K. The structure and fuction of the Epididymis. 1. The histology of the Rat Epididymis. Australian Journal of Zoology. 5 (3), 223-246 (1957).
  8. Belleannée, C., et al. Identification of luminal and secreted proteins in bull epididymis. Journal of proteomics. 74 (1), 59-78 (2011).
  9. Turner, T. T. De Graaf's thread: the human epididymis. Journal of andrology. 29 (3), 237-250 (2008).
  10. Holland, M. K., Nixon, B. The specificity of epididymal secretory proteins. Journal of reproduction and fertility. 53, 197-210 (1998).
  11. Cooper, T. G., Hing-Heiyeung, C., Nashan, D., Nieschlag, E. Epididymal markers in human infertility. Journal of andrology. 9 (2), 91-101 (1988).
  12. Turner, T. T., Johnston, D. S., Jelinsky, S. A., Tomsig, J. L., Finger, J. N. Segment boundaries of the adult rat epididymis limit interstitial signaling by potential paracrine factors and segments lose differential gene expression after efferent duct ligation. Asian journal of andrology. 9 (4), 565-573 (2007).
  13. Garrett, S. H., Garrett, J. E., Douglass, J. In situ histochemical analysis of region-specific gene expression in the adult rat epididymis. Molecular reproduction and development. 30 (1), 1-17 (1991).
  14. Lareyre, J. J., et al. A 5-kilobase pair promoter fragment of the murine epididymal retinoic acid-binding protein gene drives the tissue-specific, cell-specific, and androgen-regulated expression of a foreign gene in the epididymis of transgenic mice. Journal of Biological Chemistry. 274 (12), 8282-8290 (1999).
  15. Cornwall, G. A., Orgebin-Crist, M. C., Hann, S. R. The CRES gene: a unique testis-regulated gene related to the cystatin family is highly restricted in its expression to the proximal region of the mouse epididymis. Molecular Endocrinology. 6 (10), 1653-1664 (1992).
  16. Nixon, B., Jones, R. C., Hansen, L. A., Holland, M. K. Rabbit epididymal secretory proteins. I. Characterization and hormonal regulation. Biology of Reproduction. 67 (1), 133-139 (2002).
  17. Nixon, B., Jones, R. C., Clarke, H. G., Holland, M. K. Rabbit epididymal secretory proteins. II. Immunolocalization and sperm association of REP38. Biology of Reproduction. 67 (1), 140-146 (2002).
  18. Nixon, B., Hardy, C. M., Jones, R. C., Andrews, J. B., Holland, M. K. Rabbit epididymal secretory proteins. III. Molecular cloning and characterization of the complementary DNA for REP38. Biology of Reproduction. 67 (1), 147-153 (2002).
  19. Jelinsky, S. A., et al. The rat epididymal transcriptome: comparison of segmental gene expression in the rat and mouse epididymides. Biology of Reproduction. 76 (4), 561-570 (2007).
  20. Johnston, D. S., et al. The Mouse Epididymal Transcriptome: Transcriptional Profiling of Segmental Gene Expression in the Epididymis 1. Biology of Reproduction. 73 (3), 404-413 (2005).
  21. Zhou, W., et al. Developmental expression of the dynamin family of mechanoenzymes in the mouse epididymis. Biology of Reproduction. 96 (1), 159-173 (2017).
  22. Reilly, J. N., et al. Characterisation of mouse epididymosomes reveals a complex profile of microRNAs and a potential mechanism for modification of the sperm epigenome. Scientific reports. 6, (2016).
  23. Sullivan, R. Epididymosomes: a heterogeneous population of microvesicles with multiple functions in sperm maturation and storage. Asian journal of andrology. 17 (5), 726-729 (2015).
  24. Reid, A. T., et al. Glycogen synthase kinase 3 regulates acrosomal exocytosis in mouse spermatozoa via dynamin phosphorylation. The FASEB Journal. 29 (7), 2872-2882 (2015).
  25. Danesh, A., et al. Exosomes from red blood cell units bind to monocytes and induce proinflammatory cytokines, boosting T-cell responses in vitro. Blood. 123 (5), 687-696 (2014).
  26. Anderson, A. L., et al. Assessment of microRNA expression in mouse epididymal epithelial cells and spermatozoa by next generation sequencing. Genomics data. 6, 208-211 (2015).
  27. Biggers, J., Whitten, W., Whittingham, D., Daniels, J. The culture of mouse embryos in vitro. Methods in mammalian embryology. , 86-116 (1971).
  28. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current protocols in immunology. , (2001).
  29. Elkjær, M. -. L., et al. Immunolocalization of AQP9 in liver, epididymis, testis, spleen, and brain. Biochemical and biophysical research communications. 276 (3), 1118-1128 (2000).
  30. Gregory, M., Dufresne, J., Hermo, L., Cyr, D. G. Claudin-1 is not restricted to tight junctions in the rat epididymis. Endocrinology. 142 (2), 854-863 (2001).
  31. Isnard-Bagnis, C., et al. Detection of ClC-3 and ClC-5 in epididymal epithelium: immunofluorescence and RT-PCR after LCM. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 284 (1), C220-C232 (2003).
  32. Rojek, A. M., et al. Defective glycerol metabolism in aquaporin 9 (AQP9) knockout mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (9), 3609-3614 (2007).
  33. Shum, W. W., Da Silva, N., Brown, D., Breton, S. Regulation of luminal acidification in the male reproductive tract via cell-cell crosstalk. Journal of Experimental Biology. 212 (11), 1753-1761 (2009).
  34. Shum, W. W., Ruan, Y. C., Silva, N., Breton, S. Establishment of cell-cell cross talk in the epididymis: Control of luminal acidification. Journal of andrology. 32 (6), 576-586 (2011).
  35. Sipilä, P., Shariatmadari, R., Huhtaniemi, I. T., Poutanen, M. Immortalization of epididymal epithelium in transgenic mice expressing simian virus 40 T antigen: characterization of cell lines and regulation of the polyoma enhancer activator 3. Endocrinology. 145 (1), 437-446 (2004).
  36. Feugang, J. M., et al. Profiling of relaxin and its receptor proteins in boar reproductive tissues and spermatozoa. Reproductive Biology and Endocrinology. 13 (1), 46 (2015).
  37. Gullberg, M., et al. Cytokine detection by antibody-based proximity ligation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (22), 8420-8424 (2004).
  38. Frenette, G., Girouard, J., Sullivan, R. Comparison between epididymosomes collected in the intraluminal compartment of the bovine caput and cauda epididymidis. Biology of Reproduction. 75 (6), 885-890 (2006).
  39. Fornes, M., Barbieri, A., Sosa, M., Bertini, F. First observations on enzymatic activity and protein content of vesicles separated from rat epididymal fluid. Andrologia. 23 (5), 347-351 (1991).
  40. Eickhoff, R., et al. Influence of macrophage migration inhibitory factor (MIF) on the zinc content and redox state of protein-bound sulphydryl groups in rat sperm: indications for a new role of MIF in sperm maturation. Molecular human reproduction. 10 (8), 605-611 (2004).
  41. Lötvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 26913 (2014).
  42. Hutcheon, K., et al. Analysis of the small non-protein-coding RNA profile of mouse spermatozoa reveals specific enrichment of piRNAs within mature spermatozoa. RNA biology. 14 (12), 1776-1790 (2017).
  43. Bennett, P. Genetic basis of the spread of antibiotic resistance genes. Annali dell'Istituto superiore di sanita. 23 (4), (1987).
  44. Nixon, B., et al. Next generation sequencing analysis reveals segmental patterns of microRNA expression in mouse epididymal epithelial cells. PloS one. 10 (8), e0135605 (2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

138

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved