العلاج الجيني بوساطة ناقلات لينتيفيرال من خلايا الكبد فيفو السابقين للزرع الذاتي في الخنازير

Summary

يهدف هذا البروتوكول لوصف تتمثل الخنزير العزلة و السابقين فيفو إيصال الجينات لعلاج نماذج لأمراض التمثيل الغذائي عن طريق زرع الخلايا ذاتي. على الرغم من أن هذا النموذج خاصة تتمتع بمزايا فريدة من نوعها لصالح العلاج الناجح، التطبيق مؤسسة ذات صلة لمعالجة أمراض إضافية والمؤشرات.

Abstract

العلاج الجيني اختيار مثالي لعلاج العديد من أخطاء فطرية من الأيض في الكبد. السابقين فيفو، ناقلات لينتيفيرال قد استخدمت بنجاح في معالجة العديد من الأمراض المكونة للدم في البشر، كما يوفر الاستخدام التعبير التحوير مستقرة بسبب متجه القدرة على الاندماج في جينوم مضيف. هذا الأسلوب يوضح التطبيق السابقين فيفو العلاج الجيني لخلايا الكبد لنموذج حيوانات كبيرة من نوع tyrosinemia الوراثية أنا. تتكون هذه العملية من 1) عزل خلايا الكبد الأولية من الحيوان ذاتي الجهات المانحة والمتلقية، 2) السابقين فيفو إيصال الجينات عن طريق توصيل تتمثل مع ناقل لينتيفيرال، وزرع خلايا الكبد تصحيحها عن طريق بوابة 3) ذاتي حقن الوريد. ويعتمد نجاح الأسلوب عموما عند إزالة كفاءة والعقيمة لاستئصال الكبد، حذراً في التعامل مع العينة قصت لعزل خلايا الكبد سليمة كافية لتوصيل إعادة انجرافتينج، ونسبة عالية من الخلايا المعزولة، و الإجراءات الجراحية معقمة في جميع أنحاء للوقاية من العدوى. عطل فني في أي من هذه الخطوات سيؤدي منخفضة الغلة من خلايا الكبد ترانسدوسيد صالحة للزرع الذاتي أو العدوى من الحيوان المانح والمتلقي. نموذج الخنزير tyrosinemia الوراثية النوع البشري 1 (HT-1) المختارة لهذا النهج فريد قابلة لمثل هذا أسلوب، حتى نسبة مئوية صغيرة من انجرافتمينت خلايا تم تصحيحها سيؤدي إلى إعادة تعمير الكبد مع الخلايا السليمة التي تستند إلى قوي ميزة انتقائية على خلايا الكبد الأم مريضة. على الرغم من أن هذا التحديد النمو لن يكون صحيحاً لجميع المؤشرات، هذا النهج هو أساس للتوسع إلى دلائل أخرى ويسمح بالتلاعب بهذه البيئة معالجة أمراض إضافية، سواء داخل الكبد وما بعدها، في حين التحكم في التعرض لناقلات الأمراض الفيروسية والفرصة لسمية خارج الهدف وتوموريجينيسيتي.

Introduction

أخطاء فطرية من الأيض في الكبد هي عائلة من الأمراض الوراثية التي تؤثر مجتمعة ما يصل إلى 1 في 800 مولود حي¹. كثير من هذه الأمراض هي عيوب وحيدة الجين² ويمكن الشفاء من الناحية الوظيفية بإدخال عدد كاف من خلايا الكبد³نسخة مصححة واحدة من الجينات المتأثرة. يختلف حسب المرض⁴ النسبة المئوية الفعلية لخلايا الكبد التي يحتاج إلى تصحيح وهو يعتمد إلى حد كبير على طبيعة البروتين من ترميز، على سبيل المثال، أغلبه بروتينات مقابل هيولى. في معظم الحالات، هو جزيئي فعالية أي علاج للأمراض الأيضية بسهولة من خلال وجود المؤشرات الحيوية غالباً ما تتوفر في الدورة الدموية.

HT-1 هو خطأ وراثي في التمثيل الغذائي في الكبد ناجم عن خلل في فوماريلاسيتواسيتاتي هيدرولاز (فاه)⁵، الانزيمية الخطوة الأخيرة في عملية التمثيل الغذائي تيروزين⁶. يؤدي نقص فاه للبناء من نواتج الأيض السامة في الكبد يمكن أن يسبب فشل الكبد الحاد والموت أو في شكل المرض المزمن يمكن أن يسبب تليف الكبد وسرطانه الخلية الكبدية. المرض سريرياً تديره إدارة 2-(2-nitro-4-trifluoromethylbenzoyl)-1,3-cyclohexanedione (نتبك)، مثبط جزيء صغير من إنزيم المنبع من فاه في التمثيل الغذائي تيروزين. المرض ويوفر بيئة مثالية لاختبار أساليب العلاج الجيني، كتصحيح ناجحة حتى عدد صغير من خلايا الكبد في نهاية المطاف سيؤدي إلى إعادة تعمير الكبد الكامل مع الخلايا المصححة في نماذج حيوانية كل صغيرة وكبيرة ^{7 , 8}. وهذا يحدث بسبب تصحيح خلايا تتمتع بميزة بقاء عميقة على الخلايا التي لم يتم تصحيحها بسبب تراكم نواتج الأيض السامة في الأخير. فقدان خلايا الكبد غير المصححة يسمح للتوسيع الانتقائي لخلايا الكبد المصوبة تتسق مع قدرة التجدد في الكبد. يمكن أن يتبع العلاج بسهولة بقياس الانخفاض في تعميم مستويات التيروزين وسوكسينيلاسيتوني بعد زرع الأعضاء.

يجب أن يكون الهدف من هذا النهج بغية تبرير الطبيعة الغازية من الإجراءات، التي تشمل ظهرت جزئي، علاج دائم. ولذلك، تستخدم النسخ المتماثل غير كفء ناقلات لينتيفيرال نظراً لأنهم سوف ستابلي دمج الجينوم تتمثل⁹. ضمان إيصال الجينات المصححة لجميع الخلايا الوليدة كالكبد ينمو ويتسع ليحل محل الفقدان السريع للخلايا التي لم يتم تصحيحها. وهذا مفيد على ناقلات (إف) الفيروسية الغدد المرتبطة، والتي توجد أساسا ابيسوميس التي يمكن فقط أن تنتقل إلى خلية ابنه واحدة أثناء الانقسام¹⁰ وبالتالي فقدان أي أثر للعلاج في غضون أسابيع.

على الرغم من أن مجموعة متنامية من الأدب يدعم سلامة lentivirus¹¹، المخاوف عبر أحداث سمية جينية تخفف عن طريق الحد من توصيل الخلايا المضيفة لبيئة التي تسيطر عليها في المختبر . ابدأ عناصره هو عرض الحرة ناقل المضيف عندما يتم تنفيذ هذا الأسلوب، الحد من التعرض لخلايا الكبد التي سيتم إعادة عرض مع الزرع الذاتي عن طريق الوريد البابي.

يصف هذا التقرير أسلوب العمليات الجراحية و السابقين فيفو الإجراءات المستخدمة لعزل خلايا الكبد للجينات العلاج السابقين فيفو و الزرع الذاتي اللاحقة¹² لعلاج الخنازير HT-1⁸. تتضمن عملية كاملة 1) ظهرت جزئي الذي يخدم كمصدر لخلايا الكبد وتحفيز النمو للكبد للمضيف، 2) عزل خلايا الكبد من الكبد قصت تليها السابقين فيفو تصحيح الجينات، وأخيراً 3) إعادة خلايا الكبد تصحيحها مرة أخرى في البلد المضيف. الطريقة الموصوفة تنطبق على جميع نماذج حيوانية كبيرة مع إدخال بعض التعديلات، ولكن فقط تفتقر إلى فاه خنزير¹³ سوف تتميز ببيئة انتقائية لخلايا الكبد المصوبة.

Protocol

جميع الإجراءات الحيوان أجريت وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية واستعراض ووافق على "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (IACUC) قبل إجراء الدراسة. الإجراءات الموصوفة هنا أجريت على الخنازير الذكور والإناث من المزرعة بيضاء كبيرة (50% أبيض كبير Landrace/50% الخلفية الوراثية) تصل إلى 3 أشهر من العمر التي تعتبر صحية ومناسبة لإجراء عملية جراحية.  يتم إيواء الحيوانات اجتماعيا إلا إذا نظر موظفي مؤسسات الرعاية البيطرية غير متوافقة.  يتم تغذية الحيوانات مستويات مناسبة من تشو مرتين يوميا والملاحظ لعلامات سريرية بموظفي الرعاية على الأقل مرة واحدة يوميا.

1-التحضير لعملية جراحية

1. إدارة تيلازول 5 مغ/كغ و xylazine 2 مغ/كغ عضليا للحث على التخدير. إدارة البوبرينورفين ريال تحت الجلد في جرعة من 0.18 مغ/كغ للتسكين بعد العمليات الجراحية (المتوقع سيكون التسكين من هذه الجرعة يصل إلى 72 ساعة). يدوياً التحقق من الحيوان للاستجابات للتحقق من التخدير.
2. بمجرد مخدراً، إدراج قسطرة الوريدية في الوريد المحيطي إذن للوصول دوائية.
3. إدارة سيفازولين 25 ملغ/كغ عن طريق الحقن الوريدي والعضلي 5 ملغ/كغ من سيفتيوفور بريوبيراتيفيلي.
   1. إدارة المحلول الملحي العادي عن طريق الوريد للحفاظ على ضغط الدم ومعدل ضربات القلب في حدود الفسيولوجية طبيعية طوال فترة الإجراءات.
4. ضع أنبوب أوروجاستريك لضغط المعدة. إجراء التنبيب داخل الرغامى مع أنبوب داخل رغامى حجم مناسب، التحقق من الموضع الصحيح بواسطة ضغط الصدر يدوياً للكشف عن زفير، ومن ثم تهوية ميكانيكية الحيوان مع إيسوفلوراني 1-3%.
5. ضع يؤدي رسم القلب (ECG) وضغط الدم الكفة، ومسبار درجة الحرارة ونبضي لرصد وتسجيل العلامات الحيوية. وضع الحيوان في موقف ضعيف وفرك البطن من القفص الصدري للحوض مع تدين ثني ستيريليلي.
6. تهوية الموضوع مع إيسوفلوراني 1-3% خلال الإجراء للحفاظ على طائرة جراحية التخدير. مواصلة رصد العلامات الحيوية للتغييرات وضبط isoflurane تبعاً لذلك للحفاظ على معدل ضربات القلب في مستويات ما قبل شق إذا قطرات ضغط الدم الحد isoflurane هائلا، وبدء عملاء المعتمدة مؤسسياً لاستعادة حيويتها، مثل أدرينالين عن طريق الحقن الوريدي.
   1. تسجيل معدل ضربات القلب ومعدل التنفس وضغط الدم ودرجة حرارة الجسم في سجل إجراء جراحي لتتبع والحفاظ على الرفق بالحيوان وفقا للسياسة الخاصة بالمؤسسة لضمان الامتثال لمعايير رعاية الحيوانات الكبيرة.

2-المناظير ظهرت جزئية

1. القيام بإدخال موقع الميناء الأولية استخدام أسلوب حسن فتح سيفالاد للسرة. عندما يتم تصور الصفاق، بأمان إدخال تروكار 12 مم في تجويف البطن. تمرير 5 مم، 30°، ونطاق من خلال هذا المنفذ.
2. إينسوفلاتي في البطن مع CO₂ إلى 15 ملم زئبق. إطار التصور مباشرة مع الكاميرا المنظار، مكان اثنين منافذ إضافية 5 مم تثليث على الفص الجانبي الأيسر للكبد. الموضع الدقيق للمنافذ سيعتمد على حجم وتشريح الحيوان.
   1. عند هذه النقطة، ضع منظار البطن في أحد الموانئ 5 ملم.
3. تحديد الجزء الجانبي الأيسر للكبد عند نقطة الشق الرئيسي من الفص الأيسر. هذا شرخ يفصل الجزء الجانبي الطبي واليسار. تأمين هياكل المدخل جنبا إلى جنب مع الوريد الكبدي على طول هذا الشق باستخدام دباسة جراحية (انظر الجدول للمواد). قطاع حمة من خلال هذا الشق استخدام إطلاق النار متسلسلة من دباسة استخدام 60، 45 أو 30 ملم يحمل الأوعية الدموية منذ وقت طويل.
   1. عند الانتهاء من بتر متني، تقييم الكبد بقايا لضمان الأرقاء كافية. التحكم في أي نزيف من حمة بالكي أو خياطة الجروح.
4. استرداد قسم الكبد باستخدام جراسبيرس بالمنظار وحقيبة استرجاع أنسجة بالمنظار.
5. إزالة المنافذ وإغلاق شق منفذ 12 مم في ثلاث طبقات مع توقف حجم 0 خياطة اللفافة خط الوسط، خياطة 2-0 قيد تشغيل لطبقة الجلد العميقة وخياطة 4-0 قيد تشغيل لطبقة سوبكوتيكولار. قد يتم إغلاق المنافذ 5 ملم في طبقة واحدة مع 2-0.
6. مكان خلع ملابس معقمة في الشقوق (انظر الجدول للمواد).
7. عندما الخلايا ستكون جاهزة في أقل من 4 ساعات، الحفاظ على الحيوانات تحت التخدير العام قد حتى وقت سرطانات.
8. بدلاً من ذلك، إذا كان التلاعب الخلية تتطلب فترات أطول (مثل السماح بتشكيل الماغنيسيوم تتمثل أو فترات أطول في توصيل/التحديد استناداً إلى التطبيقات الفردية من هذا الأسلوب) تسمح الحيوان للتعافي من التخدير، وكرر خطوات الاستقراء مخدر قبل سرطانات عند الخلايا على استعداد.

3-تتمثل عزلة

1. توصيل مضخة تمعجية مع نضح لتقديم حلول تشتت الحارة (صيانتها في حوض ماء 43 درجة مئوية) بالقسطرة لتوضع في الأوعية المكشوفة الكبيرة قسم الكبد، ويكون الحل درجة الحرارة 38 درجة مئوية عند مقدمة للأنسجة. يجب الاحتفاظ جميع الأنابيب والمعدات، والحلول العقيمة لضمان مناسبة لزرع الخلايا.
   1. رئيس الوزراء بمضخة وأنابيب مع "كل الثاني" حتى محبس الحنفية المتمركزة للتبديل بين كل الأول و "الثاني كل" تسليم للأنسجة. قم بالتبديل محبس الحنفية إلى في الموقف، ورئيس الوزراء بقية مجموعة أنابيب، ملء فخ فقاعة في خط تماما لمنع إدخال الهواء فقاعات في الأنسجة.
2. تحضير عرضي نظيفة قطع خط عمودي لتداول الكبد الكشف عن المقاطع العرضية لفروع الوريد البابي والاوردة الخمائر لقسطرة.
3. كاثيتيريزي الأوردة المكشوفة المتوفرة مع دافئ لتركيب قسطرة لتجنب تسرب بيرفوساتي. كانولاتي بوابة 1 على الأقل والوريد الكبدي 1 التأكد من نضح كافية للأنسجة.
   1. ضمان catheter(s) معبي/خالية هواء قبل وضع القسطرة في الوريد.
4. نتخلل مع الحارة الواحدة وأنا في 100 مل/دقيقة، تحريك أنبوب منفذ من الوريد إلى الوريد كل 30 ثانية إلى 1 دقيقة دورة عن طريق الأوردة المتاحة كافة لمدة 15-20 دقيقة. خلال تعيين التسريب، لدى أنبوب إجلاء لإفراغ الدرج الداخلي في حاوية نفايات تحت الفراغ.
5. قم بالتبديل إلى "كل الثاني" في 100 مل/دقيقة، ركوب الدراجات عن طريق الأوردة كما مع كل الأول، لما مجموعة 30 دقيقة. خلال "الثانية الواحدة"، استخدام مضخة لعودة إلى سلة "الواحدة والثاني" العودة إلى الخزان لإعادة الإدارة للحفاظ على إعداد الإنزيم النشط. تعيين مضخة العودة إلى أقل من المضخة إلى الخارج (أي 94 مل/دقيقة)، مع الحرص على عدم العودة الجوي المفرط إلى الزجاجة المصدر.
   1. إذا فواصل الكبسولة الكبد، ويمكن تخفيض هذه المرة.
   2. إذا كان الكبد لا يهضم تماما (لا تزال مدمل مع ضغط تنسيق لطيف) يمكن أن يؤديها 5 دقائق إضافية التروية.
6. أحياناً (تقريبا كل 5 دقائق) الوثيقة درجة الحرارة السطحية فخ فقاعة و/أو الكبد التأكد من خلايا الكبد لا يحصلون على البارد. إذا كان الكبد هو الحصول على البارد (< 35 درجة مئوية) زيادة حرارة حمام الماء لاستعادة درجة حرارة الكبد أقرب إلى 38 درجة مئوية. وينبغي أن الكبد بلانش كعائدات التروية.
7. إزالة الكبد إلى لوحة العقيمة أو طبق بيتري للنقل إلى خلية ثقافة هود. تغطي ميدان العقيمة مع ثني عقيمة الحفاظ على سلامة أثناء المعالجة تتمثل.
8. يعرض المقطع الكبد من ثني العقيمة وتغرق في الكبد مع تتمثل البارد يغسل وسائط الإعلام (HWM). تعطيل الكبسولة بواسطة سحب المقص عبر الجزء العلوي. ارتداء القفازات المعقمة، بلطف تدليك الكبد إلى إطلاق سراح خلايا الكبد في المتوسط.
9. تصفية HWM يحتوي على خلايا الكبد من خلال شاش معقم في زجاجات للطرد المركزي الكبيرة (~ 200 مل). أغسل خلايا الكبد من خلال الإجراء التالي في ثلاث نسخ، الجمع بين بيليه الخلية من الزجاجات متعددة بعد استثارة الأولى (حسب التطبيق):
   1. أجهزة الطرد المركزي في 50 س ز، دقيقة 5، 4 درجة مئوية.
   2. نضح وريسوسبيند في 150 مل HWM.
   3. اترك بيليه في HWM بعد الغسيل 3^rd .
10. عد تركيز الخلية باستخدام هيموسيتوميتير أو أي جهاز آخر، حسب توافرها. هذه الخلايا جاهزة الآن للتلاعب السابقين فيفو بالاهتمام، بما في ذلك العلاج الجيني، وفرز الخلايا، أو التخصص الأخرى قبل سرطانات. يمكن ضبط الحجم النهائي ل HWM لاستهداف تركيز محدد (خلايا/مل).

4-تتمثل توصيل

1. ريسوسبيند خلايا الكبد في وسائل الإعلام (في دولبيكو النسر المعدل المتوسط [دميم]، 10% مصل بقرى الجنين [FBS]، البنسلين والستربتوميسين 4-(2-hydroxyethyl)-1-بيبيرازينيثانيسولفونيك [حبيس]، الديكساميتازون، وعامل نمو البشرة [لو]، وحامض نتبك) في 1-2 ملايين الخلايا كل مل في أنبوب مخروطي على الجليد.
2. ذوبان الجليد متجه لينتيفيرال في درجة حرارة الغرفة وإضافة إلى أنبوب مخروطي على الجليد في تعدد 20 هدفا للعدوى (وزارة الداخلية) لربط الخلايا. قم بتدوير الخلايا عند 4 درجة مئوية 10 لفة في الدقيقة لمدة 90 دقيقة لربط ناقلات الأمراض الفيروسية إلى سطح الخلية.
3. نقل أنابيب إلى 37 درجة مئوية عن 30 – 40 دقيقة عكس لخلط كل 5 دقائق لتسهيل ناقل ترانسدوسينج الخلايا منضم.
4. الطرد المركزي خلايا في ز x 50 في 4 درجات مئوية للحد الأدنى 4 ريسوسبيند خلية بيليه في المحلول الملحي بتركيز المطلوب على الجليد. كرر هذه المياه والصرف الصحي ضمان التخلص من أي ناقل غير منضم من التحضير.
5. إذا كان ذلك ممكناً، لوحة مختبرين كافية من الخلايا (أي، 500,000 الخلايا الواحدة وكذلك في 6 الخلية أيضا لوحة الثقافة) للتحقق من صلاحية، الالتصاق، كفاءة توصيل، إلخ
   ملاحظة: من الممكن غالباً لا لتقييم هذه المعلمات قبل سرطانات، خاصة بالنسبة للإجراءات في نفس اليوم. على سبيل المثال، يعمل الإجراء الموضح هنا كدنا فاه مميز تحت سيطرة المروج الخاصة بالكبد أنتيتريبسين ألفا-1، الذي لم يكن أسايابل سهولة في خلايا الكبد قبل الزرع. ومع ذلك، يمكن جزيئي هذه الخلايا مطلي بعد سرطانات كمؤشر على نجاح توصيل (أي، عن طريق النشاف الغربية) أو مؤشرا للنجاح العام للإجراء.

5-تتمثل زرع الأعضاء

1. تحديد الوريد البابي عن طريق الموجات فوق الصوتية باستخدام محول 2 إلى 5 ميغاهرتز. المباشر 18 جرام، إبرة 5 بوصة نحو الدانية إلى التشعب في الوريد البابي الرئيسي.
2. تبدأ ضخ يدوية بطيئة حتى 1 × 10⁹ خلايا الكبد (حوالي 10 غ) استخدام المحاقن. مراقبة الضغوط المدخل أثناء زرع الأعضاء باستخدام قسطرة ضخ.
   1. في حالة زيادة الضغوط المدخل أكثر من 8 مم زئبق فوق خط الأساس، توقف ضخ والسماح للضغط من أجل العودة إلى مستويات خط الأساس.
   2. في حال عدم عودة الضغوط المدخل لخط الأساس بعد الإيقاف المؤقت التسريب لمدة خمس دقائق، وقف التسريب.
3. بعد زرع الأعضاء وإزالة القسطرة، استخدام الموجات فوق الصوتية لتقييم لحضور الأحداث الخثاريه وإعادة توجيه تدفق في الوريد البابي.

6-بعد عملية الاسترداد والصيانة

1. نقل تخضع منطقة إنعاش سليم ومراقبة حتى الحيوان تماما الإسعافية، رصد معدل ضربات القلب، وتشبع الأكسجين ودرجة حرارة الجسم كل 15 – 30 دقيقة المحافظة على درجة حرارة الجسم ببطانية دافئة أو التفاف تسخين الهواء، حسب الحاجة.
2. إدارة اوميبرازول 1 مغ/كغ عن طريق الفم يوميا (من خلال نهاية الدراسة) تقليل فرص تقرح المعدة التي يمكن أن تحدث مع نوبات إينابيتينسي.
3. بعد، يراقب عن كثب مختبر والموظفين البيطريين الحيوان وعادة لا يتطلب الدواء الألم إضافية منفصلة من الجرعة البوبرينورفين قبل العملية.  إذا كانت علامات الشدة/ألم يتم مراقبتها من قبل الموظفين المؤهلين الرعاية البيطرية (شق حراسة، إينابيتينسي، الخمول)، يمكن أن تدار العوامل المضادة للالتهابات (أي، والايبوبروفين).

7-وصفات

1. انظر الجدول 1 للوصفات المستخدمة في هذا البروتوكول.

كاشف	HWM	كاشف	لدى (10 x)	كل الثاني (10 x)
ويليامز-مسحوق ه (غرام/لتر)	10.8	كلوريد الصوديوم (g/L)	83	39
ناكو3 (غرام/لتر)	2.2	بوكل (غرام/لتر)	5	5
هيبيس (غرام/لتر)	2.6	حبيس (غرام/لتر)	24	240
القلم/بكتيريا (100 x، مل/لتر)	10	عطا (غرام/لتر)	9.5	-
مصل الدم البقري الجنين (مل/لتر)	100	ن-أسيتيل-L-سيستين	8	8
الأس الهيدروجيني	7.3	(ن-أ-ج، غرام/لتر)
		نيتروغليسرين (مل/لتر)	5	5
		كاكل2 ح 22س (غرام/لتر)	-	7
		كولاجيناز د (mg/mL)	-	0.2
		الأس الهيدروجيني	7.4	7.6

الجدول 1: وصفات للحلول المستخدمة في تتمثل في معزل عن أقسام الكبد.

النتائج

استئصال الكبد وزرع ذاتي تمثيلاً تخطيطياً في الشكل 1. في مجموعة تمثيلية من الخنازير 5 الذي خضع لاستئصال الكبد، وكان معظم غلة > المطلوب 1 × 10⁹ خلايا الكبد مع حوالي 80% البقاء (الجدول 2)، توفير الكثير من الخلايا لأي نوع من أنواع التلاعب، بما في ذلك ا...

Discussion

ويصف هذا التقرير السابقين فيفو جينات ذاتي علاج نهج لعلاج نموذجا الخنزير HT-1. أنها تنطوي ظهرت جزئية، تليها السابقين فيفو تتمثل العزلة وتوصيل لعزل خلايا الكبد بالفيروس لينتي تحمل التحوير التصحيحية. ثم يتم زرع خلايا الكبد ذاتي المصوبة العودة إلى الحيوان فاه قاصرة عن طريق الوريد الب...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-(2-nitro-4-trifluoromethylbenzoyl)-1,3-cyclohexanedione (NTBC)	Yecuris	20-0027
12 mm Trocar	Covidien	B12STS
5 mm Trocar	Covidien	B5SHF
Endo Surgical Stapler 60	Covidien	EGIA60AMT
Endo Surgical Stapler 45	Covidien	EGIA45AVM
Endo Surgical Stapler 30	Covidien	SIG30AVM
Endo catch bag	Covidien	173050G
0 PDS	Ethicon	Z340H
2-0 Vicryl	Ethicon	J459H
4-0 Vicryl	Ethicon	J426H
Dermabond	Ethicon	DNX12	Sterile Dressing
Williams’-E Powder	Gibco	ME16060P1
NaHCO3	Sigma Aldrich	S8875-1KG
HEPES	Fisher	BP310-1
Pen/Strep	Gibco	15140-122
Fetal Bovine Serum	Corning	35-011-CV
NaCl (g/L)	Sigma Aldrich	S1679-1KG
KCl (g/L)	Sigma Aldrich	P3911-500G
EGTA (g/L)	Oakwood Chemical	45172
N-acetyl-L-cysteine	Oakwood Chemical	3631
(N-A-C, g/L)	Sigma Aldrich	A9165-100G
CaCl2 2H2O (g/L)	Sigma Aldrich	223506-500G
Collagenase D (mg/mL)	Crescent Chemical	17456.2
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM)	Corning	15-013-CV
Dexamethasone	Fresenius Kabi	NDC6337
Epidermal Growth Factor	Gibco	PHG0314