JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نقدم هنا بروتوكولا لعزل الخلايا ليوكيميك من نخاع العظام في مرضى سرطان الدم وتحليل لدولته الأيضية. تقييم الشخصية الأيضية لخلايا سرطان الدم الأولية يمكن أن تساعد على أفضل وصف طلب الخلايا الأولية ويمكن أن تؤدي إلى الطب أكثر تخصيصاً.

Abstract

شرط الأيضية للخلايا السرطانية يمكن أن تؤثر سلبا على فعالية العلاج والبقاء على قيد الحياة. في الوقت الحاضر، يتم اختبار الصيدلية استهداف الأيضية في أنواع عديدة من الأورام. وهكذا، وصف سرطان الخلية الأيضي الإعداد أمر لا مفر منه بغية استهداف المسار الصحيح لتحسين الحصيلة العامة للمرضى. ولسوء الحظ، في معظم حالات السرطان، الخلايا الخبيثة يصعب جداً الحصول على أرقام أعلى وخزعة النسيج مطلوب. سرطان الدم استثناء، حيث يمكن أن يكون عدد كاف من الخلايا ليوكيميك المعزولة من نخاع العظام. هنا، نحن نقدم بروتوكول مفصل لعزل الخلايا ليوكيميك من نخاع العظام في مرضى سرطان الدم والتحليل اللاحق لدولته الأيضية استخدام محلل الجريان خارج الخلية. يتم عزل الخلايا ليوكيميك بالتدرج الكثافة، التي لا تؤثر على قدرتها على البقاء. الخطوة زراعة يساعدهم على تجديد، وبالتالي فالدولة الأيضية قياس حالة الخلايا في ظروف مثلى. يسمح هذا البروتوكول لتحقيق نتائج متسقة وموحدة جيدا، والتي يمكن أن تستخدم لعلاج شخصية.

Introduction

التشكيل الجانبي الأيض واحدة من الخصائص الرئيسية للخلايا والاستقلاب غيرت تعتبر الآن واحدة من السمات المميزة للسرطان1،،من23. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام التغييرات في إعداد التمثيل الغذائي في علاج السرطان باستهداف ممرات توصيل الإشارات أو الآلات الانزيمية من سرطان خلايا4،،من56. مع العلم نزعة الأيضية للخلايا السرطانية وبالتالي هي ميزة ويمكن أن تساعد في تحسين العلاج الحالي.

وهناك ير طرق القائمة بالفعل التي يمكن تقييم النشاط الأيضي للخلايا في الثقافة. فيما يتعلق بتحلل، امتصاص الجلوكوز يمكن أن تقاس بوصفها المشعة، باستخدام 2-نبدج (2-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)Amino)-2-Deoxyglucose) أو مستويات لاكتات خارج الخلية تقاس انزيماتيكالي7،8. معدل أكسدة الأحماض الدهنية معلمة الأيضية أخرى تقاس بنظير المسمى بالميتاتي،من910. معدل استهلاك الأكسجين أسلوب يستخدم على نطاق واسع لتحديد النشاط الميتوكوندريا في الخلايا11،12، جنبا إلى جنب مع غشاء الميتوكوندريا المحتملة التقييم13،14، (الادينوسين ATP/ADP 5 '5'-ثلاثي/الادينوسين-diphosphate) نسبة قياس15 أو مجموعة داخل الخلية ATP قياس16. إشارات المسارات المعروفة لتنظيم عمليات التمثيل الغذائي يمكن أن تحددها كوانتيفيكيشنز البروتين ويمكن تحسين فهم القياسات الأيضية17،،من18إلى19.

بيد أن جميع هذه الأساليب قياس واحد فقط، أو في أفضل سيناريو، عدد قليل من المعالم الأيضي في إحدى عينة في وقت واحد. الأهم من ذلك، يمكن قياس المتزامن لمعدل استهلاك الأوكسجين (OCR) ومعدل تحمض خارج الخلية (أكار) بتحليل الجريان خارج الخلية، على سبيل المثال، "فرس البحر XFp محلل". التعرف الضوئي على الحروف مؤشر على التنفس المتقدرية وعكر هو أساسا نتيجة لتحلل (لا يمكن أن نتجاهل CO2 الإنتاج ربما رفع عكر الخلايا مع النشاط الفسفرة عالية)20. حتى الآن، وقد درسنا مختلف أنواع الخلايا استخدام هذه المحلﻻت21،،من2223.

هنا نحن تصف البروتوكول لتحليل تدفق خارج الخلية من الانفجارات الأولية (خلايا اللوكيميا المستمدة من المرحلة غير ناضجة المكونة للدم) من مرضى اللوكيميا. أفضل معرفتنا، بروتوكول معين للانفجارات الأولية ليست متاحة بعد.

Protocol

جميع العينات التي تم الحصول عليها مع informed consent من الآباء أو الأوصياء للأطفال والموافقة من اللجنة الأخلاقية التابعة لجامعة تشارلز في براغ، الجمهورية التشيكية، الدراسة لا. NV15-28848A.

1-إعداد الكواشف

  1. إعداد 500 مل من برنامج تلفزيوني بتذويب 137 مم كلوريد الصوديوم، مم 4.3 غ2هبو4مم 1.47 خ2ص4، في ddH2O. ضبط ال pH إلى 7.4 مع HCl. تعقيم بالتعقيم، 2.7 مم بوكل.
  2. تحضير 100 مل من ربمي المتوسطة: المتوسطة RPMI 1640 مع ل-Alanyl-الجلوتامين تكملة مع 10% مصل بقرى الجنين (FBS) والبنسلين (100 U/mL) ستربتوميسين (100 ميكروغرام/مل).
  3. إعداد 50 مل ناكو 0.1 م3 في الماء المقطر. ضبط درجة الحموضة إلى 8.1، وتصفية تعقيم (0.22 ميكرومتر) وتخزينها في 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: لاثنين لوحات محلل تدفق الخلية 8-جيدا، وإعداد 250 ميكروليتر من 0.1 م NaHCO3 الرقم الهيدروجيني 8.1.
  4. إعداد 1 مل 2 م د-الجلوكوز في الماء المقطر. فلتر تعقيم (0.22 ميكرومتر) وتخزينها في-20 درجة مئوية.
  5. إعداد 100 ميكروليتر من 1 مم أوليجوميسين A في الإيثانول. فلتر تعقيم (0.22 ميكرومتر) وتخزينها في-20 درجة مئوية.
  6. إعداد ميكروليتر 250 1 م 2-ديوكسي-د-الجلوكوز (2-DG) في "الحد الأدنى دميم" (المتوسطة "تعديل النسر" دولبيكو). الحارة إلى 37 درجة مئوية وضبط درجة الحموضة إلى 7.4 (القيام بقياس درجة الحموضة عند 37 درجة مئوية). فلتر تعقيم (0.22 ميكرومتر) وتخزينها في-20 درجة مئوية.
  7. إعداد 100 ميكروليتر من 1 مم فككب (الكربونيل السيانيد-فتريفلوروميثوكسيفينيلهيدرازوني) في [دمس]. فلتر تعقيم (0.22 ميكرومتر) وتخزينها في-20 درجة مئوية.
  8. إعداد 100 ميكروليتر من 1 مم والروتينون في الإيثانول. فلتر تعقيم (0.22 ميكرومتر) وتخزينها في-20 درجة مئوية.
  9. إعداد 100 ميكروليتر 1 ملغ/مل أنتيميسين أ في الإيثانول. فلتر تعقيم (0.22 ميكرومتر) وتخزينها في-20 درجة مئوية.
  10. قبل استخدام وإعداد 10 مل من تحلل اختبار الإجهاد المتوسطة. الحارة "دميم ضئيل" إلى 37 درجة مئوية في حمام مائي وضبط درجة الحموضة إلى 7.4 (القيام بقياس درجة الحموضة عند 37 درجة مئوية).
  11. قبل استخدام وإعداد 10 مل من "ميتو خلية" اختبار الإجهاد المتوسط مع جيش صرب البوسنة. الملحق "دميم الحد الأدنى" مع مم 2 لتر-الجلوتامين، 10 ملم د-الجلوكوز، 1 مم حبيس (درجة الحموضة 7.4)، بيروفات 1 مم وجيش صرب البوسنة 0.1% (ألبومين المصل البقري). الحارة إلى 37 درجة مئوية في حمام مائي وضبط درجة الحموضة إلى 7.4 (القيام بقياس درجة الحموضة عند 37 درجة مئوية).
  12. قبل استخدام وإعداد 10 مل من "ميتو خلية" اختبار الإجهاد المتوسط دون جيش صرب البوسنة. تكملة "دميم الحد الأدنى" مع مم 2 لتر-الجلوتامين، 10 ملم د-الجلوكوز، 1 مم هيبيس (درجة الحموضة 7.4) وبيروفات 1 مم. ميتو خلية اختبار الإجهاد المتوسط دون جيش صرب البوسنة إلى 37 درجة مئوية في حمام مائي دافئ وضبط درجة الحموضة إلى 7.4 (القيام بقياس درجة الحموضة عند 37 درجة مئوية).
    ملاحظة: جيش صرب البوسنة هو إضافة إلى وسيلة اختبار الإجهاد "ميتو خلية" للخلايا تستجيب على نحو أفضل إلى فككب عندما تستكمل المتوسطة مع جيش صرب البوسنة (تم اختبار ظروف مختلفة). خلية ميتو اختبار الإجهاد المتوسط دون جيش صرب البوسنة يستخدم لتحميل المنافذ حسب الشركة المصنعة لا تنصح باستخدام جيش صرب البوسنة في الأجل المتوسط.

2-عزل الخلايا وحيدات النوى من نخاع العظام

ملاحظة: من الناحية المثالية، ينبغي أن تبدأ قياس الدولة الأيضية لخلايا سرطان الدم الأولية مباشرة بعد عزلة جمع وخلايا نخاع العظام. ومع ذلك، يمكن أيضا الحصول البيانات ذات الصلة من الخلايا المعزولة بعد مراكز النقل من أمراض أخرى في الجمهورية التشيكية. تنفيذ كافة الخطوات الفرعية في غطاء زراعة الأنسجة عقيمة.

  1. الاحماء في برنامج تلفزيوني والمتوسطة الكثافة المتدرجة في درجة حرارة الغرفة.
  2. تمييع عينة نخاع العظم لمريض اللوكيميا مع برنامج تلفزيوني، بنسبة 1:1. تأكد من أن العينة تحتوي على 80 في المائة على الأقل من الانفجارات ليوكيميك.
  3. تحديد النسبة المئوية للانفجارات بالتدفق الخلوي استخدام علامات القرص المضغوط محددة لتوصيف إيمونوفينوتيبي من أنواع الخلايا. بعد الانفصال الكثافة المتدرجة، والكشف عن الحمض النووي من الأحداث الإيجابية مع صبغة نووية بغية إنشاء خلية العد الإجمالي.
  4. ثم تحديد خلايا سرطان الدم باستخدام علامات مؤتمر نزع السلاح المحددة لكل نوع من سرطان الدم: كل ب (CD19, CD45)، تي للجميع (CD3، خلايا CD4، CD8، CD5، CD7، CD99)، ومكافحة غسل الأموال (CD45، CD33، وعلامات محددة النقوي)24. تقسيم عدد خلايا سرطان الدم إيجابية بالنسبة لعلامات محددة في مؤتمر نزع السلاح بكافة الخلايا النووية لتحديد النسبة المئوية للخلايا اللوكيميا الانفجار.
    ملاحظة: قد نخاع العظام التي سيتم جمعها في الأنابيب مع مضادات التخثر.
  5. الطبقة 6 مل عينة نخاع العظم مخففة أكثر من 6 مل المتوسطة الكثافة المتدرجة في أنبوب مخروطي 15 مل بعناية. الطرد المركزي في 400 غرام x لمدة 35 دقيقة في 4 درجات مئوية في دوار دلو يتأرجح دون الفرامل.
    ملاحظة: يمكن تقسيم أكبر حجماً من العينة إلى مختبرين أكثر أو يمكن استخدام أنبوب مخروطي 50 مل مع كمية أكبر من الكثافة المتوسطة التدرج.
  6. استخدام ماصة باستور، بعناية بنقل الطبقة الطور البيني الذي يتكون من الخلايا وحيدات النوى (الشكل 1) إلى أنبوب 50 مل مخروطية الشكل جديد مع 5 مل من برنامج تلفزيوني. الطرد المركزي في 400 غ × 10 دقيقة في 4 درجات مئوية في دوار يتأرجح دلو.
    ملاحظة: نقل جميع طبقات الخلايا وحيدات النوى في أنبوب مخروطي واحدة 50 مل مع 5 مل من برنامج تلفزيوني.
  7. نضح المادة طافية وريسوسبيند بيليه الخلية في 2 مل PBS العقيمة. عد الخلايا باستخدام هيموسيتوميتير.
    ملاحظة: عدد خلايا سرطان الدم في مل واحد من نخاع العظام يستنشق يختلف اختلافاً كبيرا بين المرضى25.

3-بين عشية وضحاها زراعة الخلايا وحيدات النوى

ملاحظة: جميع الخطوات الفرعية في غطاء زراعة الأنسجة عقيمة.

  1. إعداد اثنين من قوارير T75 مع 20 مل ربمي. لكل قارورة، إضافة 30 × 106 عزل الخلايا وحيدات النوى. احتضان الخلايا مع قارورة الوقوف ح 16-24 عند 5% CO2 و 37 درجة مئوية.

4-إعداد لوحات الخلايا المغلفة بمادة لاصقة

  1. معطف اثنان لوحات محلل التمويه 8-جيدا خارج الخلية.
    ملاحظة: تنفيذ الطلاء في غطاء زراعة الأنسجة عقيمة.
  2. إضافة ميكروليتر 2.2 من لاصق الخلية (الكثافة: 2.54 ملغ/مل) إلى 250 ميكروليتر من 0.1 م ناكو3الرقم الهيدروجيني 8.1 وميكروليتر ماصة 12.5 فورا للحل في كل بئر.
    ملاحظة: يمكن أن تختلف في كثافتها الحلول الأسهم لاصقة الخلية، ضبط مستوى الصوت إضافة إلى ناكو3 تبعاً لذلك.
  3. واسمحوا لوحات الجلوس في غطاء محرك السيارة لحوالي 20 دقيقة، ثم نضح لاصقة الخلية وتغسل كل جيدا مرتين باستخدام 200 ميكروليتر من الماء المعقم. وليكن على الجلوس في هود مع فتح الغطاء حتى آبار جافة.
  4. استخدام اللوحات الحق بعيداً أو إنقاذ يصل إلى 1 الأسبوع عند 4 درجة مئوية مع حافة ملفوفة في الفيلم البارافين لتجنب التكثيف. التأكد من أن اللوحات هي درجة حرارة تصل إلى درجة حرارة الغرفة (لحوالي 20 دقيقة) في هود قبل البذر في الخلايا.

5-ترطيب خرطوشة الاستشعار

ملاحظة: هيدرات اثنين من خراطيش محلل التمويه 8-جيدا خارج الخلية.

  1. لوحة الأداة المساعدة وخرطوشه الاستشعار منفصلة. ضع خرطوشة استشعار رأسا على مقاعد البدلاء المختبر.
  2. ملء كل من لوحة الأداة المساعدة مع 200 ميكروليتر كاليبرانت. ملء كل خندق حول الجزء الخارجي الآبار مع 400 ميكروليتر من كاليبرانت.
  3. العودة خرطوشة استشعار للوحة أداة يحتوي الآن كاليبرانت.
  4. وضع التجميع خرطوشة في هوميديفيد، غير CO2، 37 درجة مئوية حاضنة بين عشية وضحاها.
  5. قم بتشغيل محلل الجريان خارج الخلية والسماح لها الحارة إلى 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.

6-زرع الخلايا في خلية ألواح مغلفة بمادة لاصقة

ملاحظة: لاختبار الإجهاد، وتحلل استخدام تحلل اختبار الإجهاد المتوسطة. لاختبار الإجهاد "ميتو الخلية"، استخدم "ميتو خلية" اختبار الإجهاد المتوسط مع جيش صرب البوسنة.

  1. خلايا البذور لاختبار الإجهاد تحلل واختبار الإجهاد "ميتو الخلية" في لوحات منفصلة. لكل اختبار، واستخدام خلايا من قارورة واحدة مع الثقافة بين عشية وضحاها.
  2. الطرد المركزي خلايا في 200 غ س لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. ريسوسبيند الخلايا في 1 مل الوسط المناسب والاعتماد عليها.
  3. إضافة 4 × 106 خلايا حية لوحدة التخزين النهائي من 400 ميكروليتر (استخدام متوسط مناسب).
  4. لوحة 50 ميكروليتر من تعليق خلية في آبار ب-غ. تأمين الخلايا 500,000 هي تبذر في بئر واحدة.
    ملاحظة: من الأهمية بمكان أن البذور الخلايا 500,000 بالضبط كل بئر كما يتم تنفيذ لا تطبيع الأخرى. وبهذه الطريقة، يمكن مقارنة النتائج من مختلف المرضى. العدد الأمثل ل replicates ستة، كما موضح هنا. لا ينصح باستخدام أقل replicates منذ الخلايا الأولية يمكن أن تتصرف في بعض الأحيان خطأ.
  5. إضافة ميكروليتر 180 الوسيلة المناسبة في آبار A و H (سوف تخدم هذه الآبار كتصحيح خلفية).
  6. الطرد المركزي اللوحة في 400 غرام x لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة مع الفرامل تعيينها إلى 1.
  7. إضافة ميكروليتر 130 الوسيلة المناسبة للآبار ب-ز في اثنين من لوحات محلل التمويه 8-جيدا خارج الخلية ببطء وبعناية. بصريا وتؤكد أن الخلايا ستابلي التقيد بالجزء السفلي من الآبار بالعرض تحت المجهر.
  8. ضع لوحة في هوميديفيد، وغير CO2وحاضنة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.

7-تحميل خرطوشة الاستشعار

  1. لاختبار الإجهاد تحلل، إعداد 250 ميكروليتر كل من الجلوكوز 100 مم 20 ميكرو أوليجوميسين و 2 م 1-المديرية العامة، كل في تحلل اختبار الإجهاد المتوسطة.
  2. لاختبار الإجهاد "ميتو الخلية"، إعداد 250 ميكروليتر كل من 20 ميكرو أوليجوميسين A، 15 ميكرو فككب، 30 ميكرو فككب وخليط من 10 ميكرومترات والروتينون و 10 ميكروغرام/مل أنتيميسين أ، في كل "خلية ميتو" اختبار الإجهاد المتوسط دون جيش صرب البوسنة.
    ملاحظة: حقن تركيزات اثنين من فككب في تحليل واحد يوصي بحيث لا توجد مواد المرضى تكفي للمعايرة فككب. ومع ذلك، ينبغي أن تحدده التركيزات الباحث.
  3. تحميل المركبات إلى المنافذ المناسبة حاقن خرطوشة على النحو التالي (الجدول 1):

8-إعداد البرنامج

  1. لاختبار الإجهاد تحلل، بإعداد البرنامج كما هو موضح في الجدول 2.
  2. لاختبار الإجهاد "ميتو الخلية"، قم بإعداد البرنامج كما هو موضح في الجدول 3.
  3. بدء تشغيل البرنامج. استبدال لوحة كاليبرانت بلوحة المقايسة (عند مطالبتك بذلك).

9-تقييم وتفسير النتائج

  1. في تحلل نتائج اختبار الإجهاد، بطرح أقل قيمة عكر بعد حقن 2-المديرية العامة من كافة القيم الأخرى عكر.
    ملاحظة: تمثل هذه القيمة الأدنى التحمض غير جليكوليتيك. عادة، أقل قيمة من قياسال 4.
  2. حساب التحمض القاعدية وتحلل وتحلل القصوى ومعلمات الاحتياط Glycolytic من الدالة جليكوليتيك (الشكل 2A). بعد طرح قيمة أكار أدنى، حساب التحمض القاعدية كمتوسط أكار من نقاط القياس الثلاثة الأولى (حذف القيمة أكار الأولى إذا كان يختلف إلى حد كبير عن اثنين آخرين)، حساب تحلل كمتوسط أكار من قياس ثلاثة نقاط بعد حقن الجلوكوز وحساب تحلل القصوى كمتوسط عكر من قياس ثلاث نقاط بعد أوليجوميسين حقن. حساب Glycolytic الاحتياطي تحلل القصوى مطروحاً منها تحلل.
    ملاحظة: بدلاً من ذلك، لحساب تحلل القصوى، واستخدام أعلى قيمة أكار من ثلاث نقاط قياس.
  3. في نتائج اختبار الإجهاد "ميتو الخلية"، بطرح أقل قيمة للتعرف الضوئي على الحروف بعد حقن والروتينون/أنتيميسين A من كافة القيم الأخرى التعرف الضوئي على الحروف.
  4. حساب تنفس القاعدية، وإنتاج ATP والتنفس القصوى والمعلمات القدرة الاحتياطية من الوظيفة المتقدرية (الشكل 2). وبعد طرح أقل قيمة للتعرف الضوئي على الحروف، حساب تنفس القاعدية كوسيلة للتعرف الضوئي على الحروف من نقاط القياس الثلاثة الأولى.
    ملاحظة: يتم التنفس القصوى أعلى قيمة التعرف الضوئي على الحروف بعد حقن فككب.
  5. لحساب إنتاج ATP، طرح متوسط نقاط القياس التعرف الضوئي على الحروف الثلاثة بعد حقن أ أوليجوميسين من تنفس القاعدية. حساب القدرة الاحتياطية كالتنفس القصوى مطروحاً منها التنفس القاعدية.
    ملاحظة: حساب دائماً التنفس القصوى من أعلى قيمة التعرف الضوئي على الحروف، بغض النظر عن تركيز فككب المستخدمة.

النتائج

ويبين الشكل 3 المنحنيات بعد اختبار الإجهاد تحلل وقياسات اختبار الإجهاد "ميتو الخلية" من الانفجارات ليوكيميك من BCP للجميع (ب-الخلايا السليفة الليمفاوي اللوكيميا الحادة) والمرضى مكافحة غسل الأموال (سرطان الدم النقوي الحاد). ويرد أيضا حساب المعلمات الأيضية م...

Discussion

يسمح البروتوكول المذكور أعلاه لقياس النشاط الأيضي المقررة حسب القيم التعرف الضوئي على الحروف وعكر في انفجارات ليوكيميك الأولية المستمدة من المرضى المصابين بسرطان الدم الليمفاوي الحاد (الكل) أو سرطان الدم النقوي الحاد (مكافحة غسل الأموال). ميزة قياس استخدام محلل الجريان خارج الخلية أنه ي?...

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

نود أن نشكر مراكز أمراض الدم طب الأطفال التشيكية. وكان هذا العمل يدعم "منحة من وزارة الصحة" (NV15-28848A)، حسب وزارة الصحة في الجمهورية التشيكية، و "جامعة مستشفى موتول"، براغ، الجمهورية التشيكية 00064203 ووزارة التربية والتعليم والشباب و "الرياضة نبو" nr. LO1604.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX SupplementGibco, ThermoFisher Scientific61870-010
Fetal Bovine SerumBioseraFB-1001/100
Antibiotic-Antimycotic (100x)Gibco, ThermoFisher Scientific15240-062
Sodium bicarbonateSigma-AldrichS5761-500G
D-(+) GlucoseSigma-AldrichG7021-100G
Oligomycin ASigma-Aldrich75351-5MG
2-Deoxy-D-glucoseSigma-AldrichD8375-1G
FCCPSigma-AldrichC2920-10MG
DMSOSigma-AldrichD8418-100ML
RotenoneSigma-AldrichR8875-1G
Antimycin A from Streptomyces sp.Sigma-AldrichA8674-25MG
Seahorse XF Base Medium, 100 mLAgilent Technologies103193-100
L-glutamine solution, 200 mMSigma-AldrichG7513-100ML
HEPES solution, 1 M, pH 7.0-7.6Sigma-AldrichH0887-100ML
Sodium pyruvateSigma-AldrichP5280-25G
Bovine Serum AlbuminSigma-AldrichA2153-10G
Ficoll-Paque PlusSigma-AldrichGE17-1440-02Density gradient medium
Seahorse XFp FluxPakAgilent Technologies103022-100
Corning™ Cell-Tak Cell and Tissue AdhesiveThermoFisher ScientificCB40240
Seahorse Analyzer XFpAgilent TechnologiesS7802A
Seahorse XFp Cell Culture MiniplateAgilent Technologies103025-100

References

  1. DeBerardinis, R. J., Lum, J. J., Hatzivassiliou, G., Thompson, C. B. The Biology of Cancer: Metabolic Reprogramming Fuels Cell Growth and Proliferation. Cell Metabolism. 7, 11-20 (2008).
  2. Ward, P. S., Thompson, C. B. Metabolic Reprogramming: A Cancer Hallmark Even Warburg Did Not Anticipate. Cancer Cell. 21, 297-308 (2012).
  3. Pavlova, N. N., Thompson, C. B. The Emerging Hallmarks of Cancer Metabolism. Cell Metabolism. 23, 27-47 (2016).
  4. Wise, D. R., Thompson, C. B. Glutamine addiction: a new therapeutic target in cancer. Trends in Biochemical Sciences. 35, 427-433 (2010).
  5. Kroemer, G., Pouyssegur, J. Tumor Cell Metabolism: Cancer's Achilles' Heel. Cancer Cell. 13, 472-482 (2008).
  6. Liberti, M. V., et al. A Predictive Model for Selective Targeting of the Warburg Effect through GAPDH Inhibition with a Natural Product. Cell Metabolism. 26, 648-659 (2017).
  7. Lundgaard, I., et al. Direct neuronal glucose uptake heralds activity-dependent increases in cerebral metabolism. Nature Communications. 6, 6807 (2015).
  8. Hermanova, I., et al. Pharmacological inhibition of fatty-acid oxidation synergistically enhances the effect of l-asparaginase in childhood ALL cells. Leukemia. 30, 209-218 (2016).
  9. Malandrino, M. I., et al. Enhanced fatty acid oxidation in adipocytes and macrophages reduces lipid-induced triglyceride accumulation and inflammation. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 308, E756-E769 (2015).
  10. Patella, F., et al. Proteomics-based metabolic modeling reveals that fatty acid oxidation (FAO) controls endothelial cell (EC) permeability. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 14, 621-634 (2015).
  11. Chowdhury, S. R., Djordjevic, J., Albensi, B. C., Fernyhough, P. Simultaneous evaluation of substrate-dependent oxygen consumption rates and mitochondrial membrane potential by TMRM and safranin in cortical mitochondria. Bioscience Reports. 36, e00286 (2015).
  12. Simonnet, H., Vigneron, A., Pouysségur, J. Conventional Techniques to Monitor Mitochondrial Oxygen Consumption. Methods in Enzymology. 542, 151-161 (2014).
  13. Martínez-Reyes, I., et al. TCA Cycle and Mitochondrial Membrane Potential Are Necessary for Diverse Biological Functions. Molecular Cell. 61, 199-209 (2016).
  14. Sukumar, M., et al. Mitochondrial Membrane Potential Identifies Cells with Enhanced Stemness for Cellular Therapy. Cell Metabolism. 23, 63-76 (2016).
  15. Wundenberg, T., Grabinski, N., Lin, H., Mayr, G. W. Discovery of InsP6-kinases as InsP6-dephosphorylating enzymes provides a new mechanism of cytosolic InsP6 degradation driven by the cellular ATP/ADP ratio. The Biochemical Journal. 462, 173-184 (2014).
  16. Morciano, G., et al. Use of luciferase probes to measure ATP in living cells and animals. Nature Protocols. 12, 1542-1562 (2017).
  17. Chau, M. D. L., Gao, J., Yang, Q., Wu, Z., Gromada, J. Fibroblast growth factor 21 regulates energy metabolism by activating the AMPK-SIRT1-PGC-1alpha pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 12553-12558 (2010).
  18. Lee, K. -. H., et al. Targeting energy metabolic and oncogenic signaling pathways in triple-negative breast cancer by a novel adenosine monophosphate-activated protein kinase (AMPK) activator. The Journal of Biological Chemistry. 286, 39247-39258 (2011).
  19. Godlewski, J., et al. MicroRNA-451 Regulates LKB1/AMPK Signaling and Allows Adaptation to Metabolic Stress in Glioma Cells. Molecular Cell. 37, 620-632 (2010).
  20. Zhang, J., et al. Measuring energy metabolism in cultured cells, including human pluripotent stem cells and differentiated cells. Nature Protocols. 7, 1068-1085 (2012).
  21. Kaplon, J., et al. A key role for mitochondrial gatekeeper pyruvate dehydrogenase in oncogene-induced senescence. Nature. 498, 109-112 (2013).
  22. Pardee, T. S., et al. A phase I study of the first-in-class antimitochondrial metabolism agent, CPI-613, in patients with advanced hematologic malignancies. Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research. 20, 5255-5264 (2014).
  23. Stein, M., et al. A defined metabolic state in pre B cells governs B-cell development and is counterbalanced by Swiprosin-2/EFhd1. Cell Death and Differentiation. 24, 1239-1252 (2017).
  24. Hrušák, O., Porwit-MacDonald, A. Antigen expression patterns reflecting genotype of acute leukemias. Leukemia. 16, 1233-1258 (2002).
  25. Amin, H. M., et al. Having a higher blast percentage in circulation than bone marrow: clinical implications in myelodysplastic syndrome and acute lymphoid and myeloid leukemias. Leukemia. 19, 1567-1572 (2005).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

141

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved