JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

مطيافية إلكترون الرنين باراماجنيتيك (EPR) أسلوب لا لبس فيها لقياس الجذور الحرة. يسمح استخدام المسابير تدور الانتقائي للكشف عن الجذور الحرة في الأقسام الخلوية المختلفة. نحن نقدم طريقة عملية وفعالة لجمع العينات البيولوجية التي تسهل معالجة وتخزين ونقل عينات للقياسات الجيش الشعبي الثوري.

Abstract

كشف دقيقة ومحددة للأنواع الأكسجين التفاعلية (روس) في الأقسام المختلفة من الخلايا والأنسجة وضروري لدراسة تنظم الأكسدة والاختزال إشارة في إعدادات البيولوجية. مطيافية إلكترون الرنين باراماجنيتيك (EPR) هو الأسلوب المباشر الوحيد لتقييم الجذور الحرة لا لبس فيه. ميزته هي أن يكشف المستويات الفسيولوجية للأنواع المحددة مع خصوصية عالية، ولكنه يتطلب التكنولوجيا المتخصصة وإعداد نموذج دقيق وضوابط ملائمة لضمان التفسير الدقيق للبيانات. هيدروكسيلاميني دوري تدور تحقيقات تتفاعل بشكل انتقائي مع فائق أكسيد أو الجذور الأخرى لتوليد إشارة نيتروكسيدي التي يمكن قياسها كمياً بالتحليل الطيفي الجيش الشعبي الثوري. المسابر نفاذية الخلية تدور وتدور المسابر المصممة لتتراكم سريعاً في الميتوكوندريا تسمح لتحديد تركيز أكسيد فائق في الأقسام الخلوية المختلفة.

في الخلايا المستزرعة، واستخدام 1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine نفاذية الخلية (غروهارلم) جنبا إلى جنب مع ودون الخلية كتيمة فائق أكسيد الفاءق (الأحمق) المعالجة المسبقة، أو استخدام الخلية نفاذية شماعة-الهيئة العامة للسدود، يسمح التفريق بين من خارج الخلية من فائق أكسيد سيتوسوليك. 1-hydroxy-4-[2-triphenylphosphonio)-acetamido]-2,2,6,6-tetramethyl-piperidine,1-hydroxy-2,2,6,6-tetramethyl-4-[2-(triphenylphosphonio)acetamido المتقدرية] كلوريد بيبيريدينيوم (ميتو-الإيقاع-ح) تسمح بقياس روس المتقدرية (الغالب فائق أكسيد).

يمكن أيضا تطبيق المسابير تدور والتحليل الطيفي الجيش الشعبي الثوري في فيفو النماذج. يمكن الكشف عن أكسيد فائق في السوائل خارج الخلية مثل الدم والسوائل السنخية، فضلا عن الأنسجة مثل أنسجة الرئة. يتم عرض عدة أساليب لمعالجة وتخزين الأنسجة للقياسات الجيش الشعبي الثوري وتقديم زيادة ونقصان (CPH) 1-hydroxy-3-carboxy-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine عن طريق الحقن الوريدي مسبار فيفو. بينما يمكن إجراء القياسات في درجة حرارة الغرفة، العينات التي تم الحصول عليها من نماذج في المختبر و في فيفو يمكن أيضا تخزين في-80 درجة مئوية وتحليلها من قبل الجيش الشعبي الثوري في 77 ك. يمكن تخزين مستقرة أنابيب المتخصصة في-80 درجة مئوية وتشغيل ك 77 لتمكين عملية، تتسم بكفاءة، واستنساخه بطريقة تسهل تخزين ونقل عينات العينات.

Introduction

بينما تكتسي تدابير للأنواع الأكسجين التفاعلية والأكسدة هامة لدراسة الأمراض المتنوعة عبر جميع نظم الجهاز، الكشف عن الأنواع الأكسجين التفاعلية (روس) يمثل تحديا سبب نصف العمر القصير وتفاعلية عالية. أسلوب رنين باراماجنيتيك (EPR) إلكترون هو الأسلوب الأكثر لا لبس فيها للكشف عن الجذور الحرة. تحقيقات تدور لها مزايا أكثر من المسابر الفلورسنت الأكثر استخداماً. على الرغم من المسابر الفلورية غير مكلفة نسبيا وسهلة الاستخدام وتوفير الكشف السريع وحساسة من روس، لديهم قيود خطيرة بسبب إشارات artifactual، وعدم قدرة على حساب تركيزات روس، ونقص عام في خصوصية1 .

لتسهيل استخدام الجيش الشعبي الثوري للدراسات البيولوجية، دول متنوعة تدور قد تم توليفها المسابير التي يمكن قياس مجموعة من الأنواع ذات الصلة بيولوجيا الجزئيات الحرة، فضلا عن بو2ودرجة الحموضة والأكسدة والاختزال32،، 45،،،من67. كما تم وضع الفخاخ تدور لالتقاط الجذور لم تدم طويلاً و adducts النموذج الطويل غلاء المعيشة، مما يسهل الكشف عن الجيش الشعبي الثوري8. يكون كل من الفئات (تحقيقات تدور وتدور الفخاخ) مزايا وقيود. فئة استخداماً من المسابر تدور بدوري هيدروكسيلامينيس، وهي الجيش الشعبي الثوري-صامت وتتفاعل مع الجذور لم تدم طويلاً لتشكيل نيتروكسيدي مستقرة. هيدروكسيلامينيس دوري تتفاعل مع فائق أكسيد 100 مرة أسرع من الفخاخ تدور، وتمكينهم من التنافس مع المواد المضادة للأكسدة الخلوية، لكنها تفتقر إلى الدقة وتتطلب استخدام عناصر التحكم المناسبة ومثبطات التعرف على الأنواع المتطرفة أو مصدر مسؤولة عن إشارة نيتروكسيدي. بينما تدور الفخاخ خصوصية المعرض، مع مميزة الطيفية أنماط تبعاً للأنواع المحاصرين، لديهم حركية بطيئة لأكسيد فائق تدور محاصرة ومعرضة للتحلل الأحيائي الراديكالي adducts. وكانت طلبات تعويض تدور موثقة توثيقاً جيدا في البحوث الطبية الحيوية9،10،11،،من1213.

والهدف من هذا المشروع إظهار أساليب الجيش الشعبي الثوري العملي لتصميم التجارب وإعداد العينات للكشف عن فائق أكسيد استخدام تدور تحقيقات في مقصورات خلوية مختلفة في المختبر وفي أنسجة مختلفة المقصورات في فيفو. وقد نشر المخطوطات عدة البروتوكولات ذات الصلة لهذه الأهداف، باستخدام المسابر نفاذية الخلية والخلية كتيمة المتقدرية تدور المستهدفة للنسيج في المختبر وعملية مختلفة من المقصورات الخلوية المستهدف للتحليل في نماذج الماوس 14 , 15-نحن نبني على هذه الهيئة للأدب بالتحقق من نهج لقياس أكسيد فائق باستخدام مجس تدور (غروهارلم) 1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine في مقصورات خلوية مختلفة في المختبر للتأكد من دقة القياسات، وتسليط الضوء على المشاكل التقنية المحتملة التي قد تحرف النتائج. نحن نقدم أيضا أساليب لإجراء قياسات الجيش الشعبي الثوري في الدم والسوائل الغسل للفيسيولوجيا وأنسجة الرئة باستخدام مسبار تدور غروهارلم. هذه الدراسات المقارنة بين أساليب مختلفة لمعالجة الأنسجة، فضلا عن تقديم أسلوب آخر تدور المسبار، CPH، بحقن الفئران قبل الحصاد الأنسجة. وأخيراً، يمكننا وضع طريقة عملية لتخزين العينات في أنابيب تترافلوروايثيلين (PTFE) للسماح بتخزين ونقل العينات قبل القياسات الجيش الشعبي الثوري في 77 ك.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

ووافقت جامعة كولورادو دنفر رعاية الحيوان المؤسسية واستخدام اللجنة جميع الدراسات الحيوانية.

1-إعداد الكواشف

  1. الأسهم حمض (دتبا) ديثيلينيتريامينبينتاسيتيك (150 مم)
    1. إضافة ز 2.95 من دتبا (393.35 g/mol) إلى 10 مل مياه.
    2. لحل دتبا وإضافة 1 م هيدروكسيد الصوديوم دروبويسي وتقديمهم للرقم الهيدروجيني 7.0.
    3. الحجم 50 مل بالماء لتركيز دتبا نهائي من 150 مم، وتخزينها في 4 درجات مئوية.
  2. المخزن المؤقت للفوسفات المالحة (PBS) (50 ملم، ودرجة الحموضة 7.4)
    1. إعداد 5 أمتار من كلوريد الصوديوم (NaCl) (58.44 g/mol؛ 29.22 غ/100 مل).
    2. تحضير 1 م من البوتاسيوم الفوسفات مائي هونج كونج2بو4 (174.18 g/mol؛ 17.42 غ/100 مل)
    3. تحضير 1 م بوتاسيوم فوسفات مونوباسيك خ2ص4 (136.1 g/mol؛ 13.61 غ/100 مل). خلط 3 مل من كلوريد الصوديوم م 5 مع 4.24 مل م 1 البوتاسيوم الفوسفات مائي ومل 0.760 البوتاسيوم م 1 فوسفات مونوباسيك. فحص درجة الحموضة.
    4. جعل الحجم 100 مل مع المياه.
    5. تخزين في درجة حرارة الغرفة (RT) لفترات قصيرة (أيام)، وعند 4 درجة مئوية للتخزين طويل الأجل (أسابيع).
  3. هينسيليت كريبس المخزن المؤقت (KHB) التي تحتوي على 100 ميكرومتر دتبا
    1. في أنبوب 50 مل المخروطية أجهزة الطرد المركزي، وإضافة ميليلتر 33.3 من 150 مم دتبا الأسهم الحل.
    2. تجلب إلى وحدة تخزين 50 مل مع المخزن المؤقت كريبس-هينسيليت (KHB).
    3. إعداد المخزن المؤقت الطازجة مع دتبا كل يوم وإبقائه في الرايت
  4. تريس يدتا المخزن المؤقت الذي يحتوي على السكروز
    1. إعداد المخزون تريس 0.5 M: حل ز 15.14 قاعدة تريس (121.14 g/mol) في 150 مل مياه. استخدام HCl، ضبط درجة الحموضة إلى 7.8 وتقديمهم إلى وحدة تخزين نهائي 250 مل.
    2. حل ز 21.4 السكروز (342.29 g/mol؛ والتركيز النهائي = 0.25 مم) في 150 مل مياه.
    3. إضافة 5 مل أسهم تريس السكروز لتحقيق تركيز تريس نهائي 10 ملم.
    4. إضافة مل 0.5 م 0.5 يدتا المخزون إلى تريس-السكروز لتحقيق تركيز نهائي 1 مم.
    5. فحص درجة الحموضة وضبطه إلى 7.4.
    6. إلى وحدة تخزين نهائي 250 مل مع المياه وتخزينها في 4 درجات مئوية.
  5. كرات الدم الحمراء البقري النحاس/الزنك دسموتاز الفاءق (الأحمق) الأسهم (30,000 U/mL)
    1. إعادة تشكيل 30,000 "يو الأحمق" في 1 مل من برنامج تلفزيوني (حوالي 5.7 ملغ، اعتماداً على النشاط من الهيئة العامة للسدود الكثير).
    2. مزيج جيد، قاسمة، وتخزينها في-20 درجة مئوية لفترات قصيرة (6-12 شهرا)، وفي-80 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل.
  6. الهيئة العامة للسدود العامل الحل (1000 U/mL)
    1. نقل من قاسمة 30 ميليلتر 30,000 الأحمق يو/مليلتر المخزون في ميليلتر 870 من PBS العقيمة.
    2. يبقى الحل على الجليد، واستخدامها من جديد.
  7. Phorbol 12-ميريستاتي 13-خلات (سلطة النقد الفلسطينية) الأسهم (5 ملم)
    1. حل 1 مغ من سلطة النقد الفلسطينية (616.83 g/mol) في 325 ميليلتر من [دمس] (تركيز النهائي = 5 ملم).
    2. قاسمة حل سلطة النقد الفلسطينية 5 مم وتخزينها في-20 درجة مئوية.
  8. حل العامل سلطة النقد الفلسطينية (125 ميكرومتر)
    1. تضعف من قاسمة 10 ميليلتر من رصيد سلطة النقد الفلسطينية 5 مم إلى 390 ميليلتر من PBS العقيمة.
    2. يبقى الحل على الجليد واستخدامه من جديد.
    3. عنصر تحكم سيارة لسلطة النقد الفلسطينية، تستخدم 10 ميليلتر من [دمس] في ميليلتر 390 من برنامج تلفزيوني.
  9. كلوريد ديفينيليودونيوم (DIP) (2.5 مم)
    1. حل 3.2 ملليغرام من تراجع (316.57 g/mol) في مل 4 للحصول على أسهم 2.5 ملم.
    2. إعداد الحل واستخدامه من جديد.
  10. الملح mesylate ديفيروكسامين (DFO) (20 مم)
    1. حل ملغ 4.5 من DFO (ز 656.79/mol) في 340 ميليلتر للحصول على رصيد 20 مم.
    2. إعداد الحل واستخدامه من جديد.
  11. إعداد أنتيميسين A (أإ) الأسهم (5 ملم)
    1. حل 5.4 ملغ AA (532 g/mol) في 2 مل إيثانول (التركيز النهائي = 5 ملم).
    2. قاسمة المخزون في قارورة من الزجاج ومخزن في-20 درجة مئوية.
  12. إعداد تحقيقات تدور
    1. فقاعة 50 مم الفوسفات العازلة التي تحتوي على 100 ميكرومتر دتبا مع النيتروجين لمدة 30 دقيقة لإزالة الأوكسجين الذائب من المخزن المؤقت.
    2. إزالة المسبار تدور من الثلاجة-20 درجة مئوية والسماح للحاويات القادمة إلى RT (10-15 دقيقة).
    3. تزن من 2.4 ملغ 1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine· HCl (غروهارلم) (237.8 غ/مول)
    4. يذوب غروهارلم في 1 مل فوسفات deoxygenated المخزن المؤقت الخاص بتركيز نهائي 10 ملم.
    5. تزن من 5 ملغ كلوريد 1-hydroxy-4-[2-triphenylphosphonio)-acetamido]-2,2,6,6-tetramethylpiperidine,1-hydroxy-2,2,6,6-tetramethyl-4-[2-(triphenylphosphonio)acetamido]piperidinium (ميتو-الإيقاع-ح) (529.1 g/mol).
    6. يذوب ميتو-الإيقاع-ح في 1 مل فوسفات deoxygenated المخزن المؤقت الخاص بتركيز نهائي من 9.5 ملم.
    7. تزن من 4.9 مغ 1-hydroxy-3-carboxy-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine· HCl (CPH) (223.7 g/mol).
    8. حل CPH إلى 1 مل فوسفات deoxygenated المخزن المؤقت الخاص بتركيز نهائي من 22 ملم.
    9. مخزن في-80 درجة مئوية وقاسمه (لا ينصح بتجميد أذاب).

2-الكشف عن أكسيد فائق في المختبر

  1. الكشف عن فائق أكسيد الكامل وخارج الخلية وداخل الخلية في الخلايا 264.7 الخام حفز سلطة النقد الفلسطينية في الرايت
    1. وبعد الأسلوب العقيم السليم، إذابة الخلايا 264.7 الخام وممر لهم في وسائل الإعلام دميم وتستكمل مع 10% FBS (منخفضة خالية من الذيفان) و 1% فطري/الأمبيسلّين عند 37 درجة مئوية في حاضنة2 CO.
    2. خلايا 264.7 الخام البذور في 1 × 106 خلايا/كذلك في لوحات 6-جيدا قبل العلاج بيوم واحد.
    3. بلطف قم بإزالة الوسائط وغسل الخلايا مرة واحدة مع 1 مل KHB المخزن المؤقت.
    4. إضافة KHB تحتوي على 100 ميكرومتر دتبا لكل بئر، وعلاج في إجمالي حجم 500 ميليلتر بما يلي:
    5. لآبار pretreated مع الهيئة العامة للسدود، إضافة 15 ميليلتر/جيدا لحل العمل الأحمق (1000 يو/مليلتر؛ والتركيز النهائي للهيئة العامة للسدود = 30 U/mL) واحتضانها لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية قبل إضافة غروهارلم وسلطة النقد الفلسطينية.
    6. إضافة ميليلتر/جيدا 12.5 ملم 10 غروهارلم المخزون (التركيز النهائي = 0.25 مم).
    7. إضافة 40 ميكروليتر/جيدا من 125 ميكرومتر PMA العامل الحل (تركيز النهائية = 10 ميكرون) أو 40 مركبة ميليلتر (الأوراق المالية 10 ميليلتر من [دمس] في ميليلتر 390 من برنامج تلفزيوني).
    8. احتضان لمدة 50 دقيقة في 37 درجة مئوية في حاضنة2 CO.
    9. إزالة اللوحات من الحاضنة ووضعها مباشرة على الجليد.
    10. تجمع المخزن المؤقت من كل بئر منفصلة، مل 1.5، المسمى أنابيب. الحفاظ على الجليد في جميع أنحاء.
    11. إضافة 100 ميليلتر من جديد KHB مخزن يحتوي على 100 ميكرومتر دتبا ولطف كشط الخلايا وريسوسبيند من بيبيتينج صعودا وهبوطاً عدة مرات. الحفاظ على الجليد في جميع أنحاء استثارة الخلية.
    12. تحميل العينة التي جمعت في الخطوات 2.1.10 و 2.1.11 (50 ميليلتر) في كل من هذه الأنابيب الشعرية. ختم كلا طرفي وتشغيل الجيش الشعبي الثوري.
      ملاحظة: دائماً اختبار أنبوب أو جيدا (بدون خلايا) التي تتضمن التحقيق في المخزن المؤقت (نفس تركيز = 0.25 مم)، والمعالجة تحت نفس الشروط المطبقة على الخلايا (نفس الحضانة الوقت ودرجة الحرارة) كعنصر تحكم، نظراً لكثافة الخلفية للتحقيق هو درجة الحرارة- وتعتمد على الوقت.
    13. تعيين معلمات اقتناء الجيش الشعبي الثوري على ما يلي: تردد الموجات = 9.65 غيغاهرتز؛ مركز الحقل = 3432 ز؛ تعديل السعة = ز 2.0؛ اكتساح العرض = 80 ز؛ الميكروويف السلطة = 19.9 ميغاواط؛ العدد الإجمالي لعمليات التفحص = 10؛ اكتساح الوقت = 12.11 s; ووقت ثابت = 20.48 مرض التصلب العصبي المتعدد.
  2. الكشف عن فائق أكسيد الميتوكوندريا في الخلايا 264.7 الخام
    1. اتبع الخطوات 2.1.1 و 2.1.2 للبذور الخام 264.7 الخلايا قبل التجربة بيوم واحد.
    2. قم بإزالة الوسائط وغسل الخلايا مرة واحدة مع 1 مل KHB المخزن المؤقت.
    3. إضافة 200 ميليلتر من KHB التي تحتوي على 100 ميكرومتر دتبا لكل بئر.
    4. إضافة 5.3 ميليلتر/جيدا من الأسهم ميتو-الإيقاع-ح 9.5 مم (التركيز النهائي = 0.25 مم)
    5. احتضان لمدة 10 دقائق في الرايت
    6. أضف 1 ميليلتر/بئر أنتيميسين A (أإ)، حل الأسهم 5 ملم في الإيثانول (التركيز النهائي = 25 ميكرومتر).
    7. احتضان لمدة 50 دقيقة في 37 درجة مئوية في حاضنة2 CO.
    8. إزالة اللوحات من الحاضنة ووضعها مباشرة على الجليد.
    9. بلطف كشط الخلايا وريسوسبيند بيبيتينج صعودا وهبوطاً. الحفاظ على الجليد.
    10. تحميل العينة في أنبوب شعري. ختم كلا طرفي.
    11. راجع المقطع السابق لإعداد الجيش الشعبي الثوري.
  3. الكشف عن أكسيد فائق في زنزانات 264.7 الخام في ك 77
    1. مكان المخزن المؤقت التي تم جمعها في الخطوة 1.1.10 في المعدة مسبقاً PTFE أنابيب 1-2 بوصة في الطول (3/16 "OD x 1/8" معرف). تأكد من أنابيب PTFE مستقيم حتى أنه يمكن بسهولة إدراجها وإزالتها من الإصبع ديوار. استخدام سداده مطاطية لإغلاق واحدة من نهاية الأنبوب PTFE، "الماصة؛" المخزن المؤقت أو تعليق خلية (100 إلى 150 ميليلتر) في الأنبوب PTFE، وختم الأنبوب بسداده ثانية.
    2. فلاش تجميد العينة في نيتروجين سائل. يمكن تحويلها إلى أنبوب للواسمات مسمى للتخزين في-80 درجة مئوية العينة أو تشغيل فورا.
    3. ملء الإصبع ديوار مع النتروجين السائل وإدراج الأنبوب PTFE المحتوية على العينة في الإصبع ديوار. يجب التأكد من العينة تركزت في الفضاء النشطة من جهاز رنان وتشغيل الجيش الشعبي الثوري في 77 ك.
      ملاحظة: بدء تدفق غاز النيتروجين إلى جهاز مطياف 15-30 دقيقة قبل القياسات، وتواصل هذا التدفق في جميع أنحاء القياسات لمنع التكثيف الماء في جهاز رنان.
    4. تعيين معلمات اقتناء الجيش الشعبي الثوري على ما يلي: تردد الموجات = 9.65 غيغاهرتز؛ مركز الحقل = ز 3438؛ تعديل السعة = 4.0 ز؛ اكتساح العرض = 150 غ؛ الميكروويف السلطة = 0.316 ميغاواط؛ العدد الإجمالي لعمليات التفحص = 10؛ اكتساح الوقت = 60 ثانية؛ ووقت ثابت = 1.28 مرض التصلب العصبي المتعدد.

3-الجيش الشعبي الثوري القياسات في السوائل

  1. الدم كله
    1. علاج الفئران (8-12 أسابيع من العمر) مع جرعة واحدة لإعطاء بليوميسين (بلو؛ 100 ميليلتر في 1 يو/مليلتر) حله في برنامج تلفزيوني أو برنامج تلفزيوني وحدها كما هو موضح سابقا16،17.
    2. Euthanize الفئران بإدارة isoflurane المستنشقة (1.5-4 ٪) تليها اكسسانجوينيشن والتفكك عنق الرحم. نضح الدم عن طريق البطين الأيمن في محقن المغلفة مع الهيبارين (جامعة جنوب المحيط الهادئ 1000 مليلتر) التي تحتوي على 100 ميكرومتر دتبا ونقل إلى أنبوب 1.5 مل.
    3. في أنبوب منفصل 1.5 مل، إضافة 15 ميليلتر من برنامج تلفزيوني يحتوي على 100 ميكرومتر دتبا و 3 ميليلتر من غروهارلم (10 مم) إلى 132 ميليلتر من الدم لإجمالي حجم 150 ميليلتر وتركيز غروهارلم النهائي من 0.2 مم.
    4. احتضان الدم لمدة 10 دقائق في 37 درجة مئوية في حمام مائي.
    5. إزالة الأنابيب من حوض ماء.
    6. تأخذ قاسمة بتحميل الدم في أنبوب شعري وتشغيل الجيش الشعبي الثوري في الرايت مع الجيش الشعبي الثوري الحصول على المعلمات التالية: الموجات التردد = 9.65 غيغاهرتز؛ مركز الحقل = 3432 ز؛ تعديل السعة = 1.0 ز؛ اكتساح العرض = 80 ز؛ الميكروويف السلطة = 19.9 ميغاواط؛ العدد الإجمالي لعمليات التفحص = 3؛ اكتساح الوقت = 12.11 s; ووقت ثابت = السيدة 20.48 بدلاً من ذلك، يمكن فلاش العينات المجمدة كما هو موضح في الخطوة 2، 3 للقياسات في 77 ك. الجيش الشعبي الثوري لبارامترات هي التالية: الموجات التردد = 9.65 غيغاهرتز؛ مركز الحقل = ز 3438؛ تعديل السعة = 4.0 ز؛ اكتساح العرض = 150 غ؛ الميكروويف السلطة = 0.316 ميغاواط؛ العدد الإجمالي لعمليات التفحص = 2؛ اكتساح الوقت = 60 ثانية؛ ووقت ثابت = 1.28 مرض التصلب العصبي المتعدد.
  2. للفيسيولوجيا الغسل السائل (بالف)
    1. بعد القتل الرحيم (راجع الخطوة 3.1.2)، جمع بالف بغرس ببطء وسحب 1 مل من برنامج تلفزيوني يحتوي على 100 ميكرومتر دتبا ثلاث مرات في حقنه عن طريق وضع قنية في القصبة الهوائية.
    2. في أنبوب 1.5 مل، علاج 200 ميليلتر من بالف مع 4 ميليلتر من غروهارلم (10 مم) للحصول على تركيز نهائي من 0.2 مم.
    3. احتضان بالف لمدة 50 دقيقة في 37 درجة مئوية في حمام مائي.
    4. أنابيب من حوض ماء ووضعها على الجليد.
    5. تحميل بالف في الأنبوبة الشعرية وتشغيل الجيش الشعبي الثوري في الرايت مع الجيش الثوري الشعبي نفس الإعدادات المستخدمة في الخطوة 1-1-13، أو تجميد فلاش في النتروجين السائل كما هو موضح في الخطوة 2، 3.
  3. قياسات الجيش الشعبي الثوري في الدم وبالف في ك 77
    1. اتبع البروتوكول أعلاه لجمع الدم (الخطوات 3.1.1. إلى 3.1.4) وبالف (خطوات 3.2.1 إلى 3.2.4).
    2. مكان 150 ميليلتر من الدم المعالجة أو بالف في PTFE أنابيب (في 1-2). استخدام سداده مطاطية لإغلاق واحدة من نهاية الأنبوب PTFE قبل إضافة العينة وسداده أخرى لإغلاق الأنبوب.
    3. فلاش تجميد العينة في نيتروجين سائل.
    4. انظر الفرع 2-3 للحصول على تفاصيل حول تشغيل الجيش الشعبي الثوري في العينات المجمدة في أنابيب PTFE استخدام الإصبع ديوار في 77 ك. تشغيل المجمدة غروهارلم تعامل مع عينات الدم في غضون أسبوع.

4-الجيش الشعبي الثوري القياسات في أنسجة الرئة

  1. فلاش أنسجة الرئة المجمدة
    1. بعد جمع بالف في الخطوة 3.2.1، يتم فتح الصدر والرئتين مع 10 مل من برنامج تلفزيوني الباردة عن طريق مسح البطين الأيمن لإزالة الدم. فلاش تجميد أنسجة الرئة في نيتروجين سائل. ويمكن تخزين أنسجة الرئة المجمدة في-80 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر حتى استخدام للقياسات الجيش الشعبي الثوري.
    2. تثبيت أنسجة الرئة على الثلج الجاف بملاقط وقطع قطع صغيرة متعددة (5-15 ملغ) من أنسجة الرئة باستخدام شفرة حافة واحدة.
    3. وزن الأنسجة في أنبوب 1.5 مل ووضع الأنبوب بالمقياس والفارغة في الجدول، ثم إضافة قطع الأنسجة وتسجيل الوزن.
    4. للنسيج في أنبوب 1.5 مل، إضافة 196 ميليلتر من KHB المحتوية على دتبا و 4 ميليلتر من غروهارلم (0.2 مم) لتحقيق إجمالي 200 ميليلتر.
    5. احتضانها ح 1 في 37 درجة مئوية في حمام مائي.
    6. تدور إلى أسفل (لثوان قليلة) في ميكروسينتريفوجي في 3,884 س ز.
    7. على الجليد و "الماصة؛" 150 ميليلتر من المادة طافية في الأنبوب PTFE وتجميد للقياسات ك 77 كما هو موضح في الفرع 2-3.
      ملاحظة: لاستخدام هذا الأسلوب، إلى التباين في الضرر الذي يلزم النظر فيها. من إصابة في الرئة الناجمة عن بليوميسين، نظراً لأن ذلك إصابة شديدة غير متجانسة، من المستحسن قطع عدة قطع الأنسجة من أجزاء مختلفة من الرئة من كل الماوس. وبدلاً من ذلك، يمكن تجانس أكبر قطعة من النسيج في KHB المخزن المؤقت الذي يحتوي على 100 ميكرومتر دتبا على نسبة الوزن إلى حجم 1:6 (ملغم/ميليلتر) كما هو موضح أدناه.
  2. أنسجة الرئة الطازجة تحفظ في المخزن المؤقت السكروز
    1. مسح الرئتين لافاجيد مع برنامج تلفزيوني الباردة لإزالة الدم كما فعلت في الخطوة 3.1.2.
    2. مجانسة أنسجة الرئة الطازجة في تريس يدتا المخزن المؤقت الذي يحتوي على السكروز 0.25 م بنسبة 1:6 الرئة/المخزن مؤقت (ملغم/ميليلتر) استخدام طاحونة الأنسجة دونس مع الزجاج أو مدقة PTFE.
    3. إضافة 50 ميليلتر من هوموجيناتي الرئة إلى 450 ميليلتر من KHB التي تحتوي على 100 ميكرومتر دتبا.
    4. في أنبوب 1.5 مل (في إجمالي حجم 100 ميليلتر)، إلى 98 ميليلتر من الرئة هوموجيناتي في KHB، إضافة 2 ميليلتر من غروهارلم رصيد 10 ملم للحصول على تركيز نهائي من 0.2 مم.
    5. احتضان لمدة 20 دقيقة 37 درجة مئوية في حمام مائي.
    6. وضع العينات في الثلج وتحميلها في أنبوب شعري. تشغيل الجيش الشعبي الثوري في الرايت (الإعدادات المستخدمة في الخطوة 2.1.13).
    7. لاختبار مساهمة محددة الأنواع والمصادر باستخدام مثبطات مختلفة، قبل علاج ميليلتر 88 من الرئة هوموجيناتي +/-مثبط، ضبط مع KHB لتحقيق وحدة تخزين نهائي من 98 ميليلتر. وفي هذه التجربة، شملت مثبطات 10 ميليلتر من الهيئة العامة للسدود (100 U/mL)، 4 ميليلتر من ديفيروكسامين (DFO؛ التركيز النهائي = 800 ميكرون)، أو 4 ميليلتر من كلوريد ديفينيليودونيوم (DIP؛ والتركيز النهائي = 100 ميكرومتر). احتضان لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية في حمام مائي.
    8. إضافة 2 ميليلتر من غروهارلم واحتضانها لآخر 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية، تليها القياسات الجيش الشعبي الثوري كما هو موضح أعلاه. وتشمل عينة فارغة مطابقة مرة واحدة مع KHB غروهارلم تحتوي على السكروز المخزن المؤقت. وبدلاً من ذلك، تخزن مختبرين homogenates الرئة المتبقية (الخطوة 3.1.2) في-80 درجة مئوية للقياسات المقبلة.
      ملاحظة: يمكن تغيير الحجم الإجمالي حسب الحاجة.
  3. قياسات الجيش الشعبي الثوري في أنسجة الرئة من الفئران حقن تدور تحقيقات في فيفو (باستخدام خلايا الأنسجة RT)
    1. تحضير حل الأسهم CPH بإذابة 4.9 مغ CPH في 1 مل من المخزن المؤقت للفوسفات التي تمت تصفيتها و deoxygenated 50 مم.
    2. تخدير الفئران مع isoflurane المستنشقة (1.5-4%) لمدة 20-30 ثانية حتى لا يستجيب إلى أخمص القدمين قرصه. حقن الفئران عبر الطريق ريتروربيتال مع 100 ميليلتر CPH تدور المسبار لوزن جسم ماوس ز 25 (الجرعة النهائية = 20 مغ/كغ)، وتسمح بالتحقيق معه لتعميم حاء 1 فورا بعد الحقن ريتروربيتال، أضف قطره واحدة من بروباراكيني 0.5% HCl على منطقة العين إلى بريف ألم nt في العين وجفاف. رصد الفئران ح 1 والشروع في قطع الأنسجة.
    3. حصاد أنسجة الرئة كما هو موضح أعلاه وفلاش تجميد الرئتين.
    4. قص 20-30 ملغ أنسجة المجمدة في الثلج الجاف وتسجيل الوزن الدقيق.
    5. امسح برفق الأنسجة مع التنظيف مناديل ﻻستيعاب أي المياه السطحية.
    6. ضع الأنسجة داخل إطار الخلية الأنسجة (ملحق يسمح قياسات الجيش الشعبي الثوري لعينات الأنسجة) وتشغيل الجيش الشعبي الثوري لتحديد مجموع يدور. ويمكن التعبير عن البيانات كمجموع يدور كل مغ أنسجة.

5-بيانات التحليل

  1. محاكاة الأطياف المنتجين استخدام الوحدة النمطية سبينفيت إدراجها في برامج زينون من مطياف امكسنانو الجيش الشعبي الثوري في مقاعد البدلاء-أعلى. تحديد تركيز نيتروكسيدي من قبل الوحدة النمطية سبينكونت. وبدلاً من ذلك، يمكن إجراء منحنى معايرة من نيتروكسيدي مستقرة مثل 4-هيدروكسي-الإيقاع أو تيمبول، والتركيز يمكن الحصول عليها عن طريق مقارنة كثافة إشارة بعينه ومعيار.
  2. للبيانات التي تم جمعها في ك 77، استخدام التكامل المزدوج متبوعاً سبينكونت.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

تم التحقق من صحة الكشف عن فائق أكسيد استخدام غروهارلم استخدام X/إكس فائق أكسيد توليد نظام لإثبات أن كان تماما تحول دون إشارة نيتروكسيدي (سم.) من الهيئة العامة للسدود، بينما حدث ليس له أي أثر (الشكل 1A). ثم تم تقييم دِيسمُوتاز المجموع، خارج الخلية في الخ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

تقييم الإنتاج الحرة الراديكالية في إعدادات البيولوجية مهم في فهم الأكسدة ينظم الإشارات في الصحة والمرض، ولكن هذه الأنواع صعبة نظراً لأن نصف العمر القصير للأنواع الحرة الراديكالية والتقنية العالية قيود مع الأساليب استخداماً. الجيش الثوري الشعبي أداة قيمة وقوية في مجال البيولوجيا الأكسد...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

وأيد هذا العمل جامعة كولورادو مدرسة الطب عميد جائزة "الهياكل الأساسية للبحوث الاستراتيجية"، R01 HL086680-09 و 1R35HL139726-01، على جائزة الزمالة E.N.G. وكفريت كلية جامعة دبلن (أنه). يشكر المؤلفون الدكتورة ساندرا إيتون والدكتور جيرالد روزين الدكتور غاريث إيتون (جامعة دنفر)، والدكتور جوزيف ب. كاو (جامعة ميريلاند)، والدكتور المفارق إهداء (جامعة كولورادو دنفر) لإجراء مناقشات مفيدة وجوان مالتزاهن، أشلي ترومبي واللبلاب ماكدرموت (جامعة كولورادو دنفر) لتقديم الدعم التقني.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
DMEMLifeTech10566-016cell culture media
Diethylenetriaminepentaacetic acid (DTPA)Sigma AldrichD6518-5G
sodium chloride (NaCl) Fisher Scientific  BP358-212used to prepare 50 mM phosphate saline buffer  according to Sigma aldrish  
potassium phosphate dibasic (HK2PO4 )Fisher Scientific  BP363-500used to prepare 50 mM phosphate saline buffer  according to Sigma aldrish  
potassium phosphate monobasic (KH2PO4 )Sigma AldrichP-5379used to prepare 50 mM phosphate saline buffer  according to Sigma aldrish  
Krebs-Henseleit buffer (KHB) (Alfa Aesar, Hill)J67820
Bovine erythrocyte superoxide dismutase (SOD)Sigma Aldrich S7571-30KU
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) Sigma AldrichP1585-1MGDissolve in DMSO
Antimycin A (AA)Sigma AldrichA8674-25MGDissolve in Ethanol and store in glass vials(MW used is the averaged molecular weights for four lots)
1-Hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine . HCl (CMH)Enzo Life SciencesALX-430-117-M050
1-Hydroxy-3-carboxy-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine . HCl (CPH)Enzo Life SciencesALX-430-078-M250
1-Hydroxy-4-[2-triphenylphosphonio)-acetamido]-2,2,6,6-tetramethylpiperidine, 1-Hydroxy-2,2,6,6-tetramethyl-4-[2-(triphenylphosphonio)acetamido]piperidinium dichloride ( mito-TEMPO-H)Enzo Life SciencesALX-430-171-M005
1-Hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidin-4-yl-trimethylammonium chloride . HCl (CAT1H)Enzo Life SciencesALX-430-131-M250
Heparin Sagent PharmaceuticalsNDC 25021-400-10
Diphenyliodonium chloride Sigma Aldrich43088
Deferoxamin mesylate saltSigma AldrichD9533-1G
CritosealLeica39215003
BRAND disposable BLAUBRAND micropipettes, intraMarkSigma Aldrich708733Capillaries
PTFE FRACTIONAL FLUOROPOLYMER TUBING
3/16” OD x 1/8” ID		NORELL1598774ATeflon tubing 
SILICONE RUBBER STOPPERS FOR NMR SAMPLE TUBES  FOR THIN WALL TUBES HAVING AN OD OF 4mm-5mm (3.2mm TO 4.2mm ID) TS-4-5-SRNORELL94987
EMXnano Bench-Top EPR spectrometer Bruker BioSpin GmbHE7004002
EMX NANO TISSUE CELLBruker BioSpin GmbHE7004542

References

  1. Kalyanaraman, B., et al. Measuring reactive oxygen and nitrogen species with fluorescent probes: challenges and limitations. Free Radical Biology and Medicine. 52 (1), 1-6 (2012).
  2. Bobko, A. A., et al. In vivo monitoring of pH, redox status, and glutathione using L-band EPR for assessment of therapeutic effectiveness in solid tumors. Magnetic Resonance in Medicine. 67 (6), 1827-1836 (2012).
  3. Elajaili, H. B., et al. Electron spin relaxation times and rapid scan EPR imaging of pH-sensitive amino-substituted trityl radicals. Magnetic Resonance in Chemistry. 53 (4), 280-284 (2015).
  4. Elajaili, H., et al. Imaging disulfide dinitroxides at 250 MHz to monitor thiol redox status. Journal of Magnetic Resonance. 260, 77-82 (2015).
  5. Halpern, H. J., et al. Oxymetry Deep in Tissues with Low-Frequency Electron-Paramagnetic-Resonance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (26), 13047-13051 (1994).
  6. Epel, B., et al. Imaging thiol redox status in murine tumors in vivo with rapid-scan electron paramagnetic resonanc. Journal of Magnetic Resonance. 276, 31-36 (2017).
  7. Legenzov, E. A., Sims, S. J., Dirda, N. D. A., Rosen, G. M., Kao, J. P. Y. Disulfide-Linked Dinitroxides for Monitoring Cellular Thiol Redox Status through Electron Paramagnetic Resonance Spectroscopy. Biochemistry. 54 (47), 6973-6982 (2015).
  8. Abbas, K., et al. Medium-throughput ESR detection of superoxide production in undetached adherent cells using cyclic nitrone spin traps. Free Radical Research. 49 (9), 1122-1128 (2015).
  9. Dikalov, S. I., et al. Distinct roles of Nox1 and Nox4 in basal and angiotensin II-stimulated superoxide and hydrogen peroxide production. Free Radical Biology and Medicine. 45 (9), 1340-1351 (2008).
  10. Dikalov, S. I., Kirilyuk, I. A., Voinov, M., Grigor'ev, I. A. EPR detection of cellular and mitochondrial superoxide using cyclic hydroxylamines. Free Radical Research. 45 (4), 417-430 (2011).
  11. Dikalova, A. E., et al. Therapeutic Targeting of Mitochondrial Superoxide in Hypertension. Circulation Research. 107 (1), 106-116 (2010).
  12. Dikalov, S. I., Polienko, Y. F., Kirilyuk, I. Electron Paramagnetic Resonance Measurements of Reactive Oxygen Species by Cyclic Hydroxylamine Spin Probes. Antioxidants & Redox Signaling. , (2017).
  13. Sharma, S., et al. L-Carnitine preserves endothelial function in a lamb model of increased pulmonary blood flow. Pediatric Research. 74 (1), 39-47 (2013).
  14. Berg, K., Ericsson, M., Lindgren, M., Gustafsson, H. A High Precision Method for Quantitative Measurements of Reactive Oxygen Species in Frozen Biopsies. PloS One. 9 (3), (2014).
  15. Kozlov, A. V., et al. EPR analysis reveals three tissues responding to endotoxin by increased formation of reactive oxygen and nitrogen species. Free Radical Biology and Medicine. 34 (12), 1555-1562 (2003).
  16. Van Rheen, Z., et al. Lung Extracellular Superoxide Dismutase Overexpression Lessens Bleomycin-Induced Pulmonary Hypertension and Vascular Remodeling. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 44 (4), 500-508 (2011).
  17. Mouradian, G. C., et al. Superoxide Dismutase 3 R213G Single-Nucleotide Polymorphism Blocks Murine Bleomycin-Induced Fibrosis and Promotes Resolution of Inflammation. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 56 (3), 362-371 (2017).
  18. Dikalov, S. I., Li, W., Mehranpour, P., Wang, S. S., Zafari, A. M. Production of extracellular superoxide by human lymphoblast cell lines: comparison of electron spin resonance techniques and cytochrome C reduction assay. Biochem Pharmacol. 73 (7), 972-980 (2007).
  19. Kozuleva, M., et al. Quantification of superoxide radical production in thylakoid membrane using cyclic hydroxylamines. Free Radical Biology and Medicine. 89, 1014-1023 (2015).
  20. Chen, K., Swartz, H. M. Oxidation of Hydroxylamines to Nitroxide Spin Labels in Living Cells. Biochimica Et Biophysica Acta. 970 (3), 270-277 (1988).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

143 CPH

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved