JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا، فإننا نقدم نموذجا قوية والفسيولوجية دراسة الآليات الجزيئية الكامنة وراء إفراز هرمون القناة الهضمية والامتصاص المعوي – الأمعاء الدقيقة الفئران المعزولة perfused.

Abstract

القناة الهضمية هو أكبر جهاز الغدد الصماء في الجسم، وإنتاج الهرمونات الببتيد مختلفة أكثر من 15 التي تنظم المدخول الشهية والطعام والهضم وامتصاص العناصر الغذائية والتوزيع والرحلات الجلوكوز بعد prandial. فهم الآليات الجزيئية التي تنظم إفراز هرمون الأمعاء أمر أساسي لفهم وترجمة القناة الهضمية هرمون فسيولوجيا. تقليديا، الآليات الكامنة وراء إفراز هرمون القناة الهضمية هي أما الدراسة المجراة في (في البشر أو الحيوانات التجريبية) أو استخدام القناة الهضمية إفراز هرمون الابتدائية المخاطية خلية الثقافات أو خطوط الخلية. هنا، نحن نقدم الأمعاء معزولة الفئران perfused كأسلوب بديل لدراسة إفراز هرمون القناة الهضمية. فضائل هذا النموذج أنها تعتمد على القناة الهضمية سليمة، بمعنى أنه يجمل معظم المعلمات الناحية الفسيولوجية الهامة المسؤولة عن إفراز في الدراسات المجراة في، بما في ذلك استقطاب الغشاء المخاطي والعلاقات باراكريني وطرق التعرض التروية/التحفيز. وبالإضافة إلى ذلك، وخلافا للدراسات المجراة في الأمعاء المعزولة الفئران perfused يسمح للسيطرة الكاملة تقريبا على التجريبية والتقييم المباشر لإفراز. وعلى النقيض من الدراسات في المختبر، فمن الممكن لدراسة الحجم وديناميكية لإفراز، وإلى معالجة المسائل الهامة، مثل ما هي المحفزات يتسبب في إفراز هرمونات القناة الهضمية المختلفة، من أي جانب من القناة الهضمية (لومينال أو الأوعية الدموية) إفراز وحفز، وتحليل بالتفصيل المجسات الجزيئية الكامنة وراء الاستجابة الافرازية. وبالإضافة إلى ذلك، الإعداد نموذج قوية لدراسة الامتصاص المعوي، والتفاصيل المتعلقة بالقوى المحركة لامتصاص الأمعاء بما في ذلك الناقلون مسؤولة.

Introduction

القناة الهضمية هو أكبر جهاز الغدد الصماء في الجسم، وإنتاج الهرمونات الببتيد مختلفة أكثر من 15 التي تنظم امتصاص العناصر الغذائية والتصرف في المواد الغذائية، ونمو الأمعاء وتعدل الشهية1. هرمونات القناة الهضمية، لذلك، تشارك في العديد من العمليات الفسيولوجية الأساسية، وفهم هذه الأنماط من إفراز والتفاصيل الجزيئية التي تتحكم في إفراز الهرمونات كل منهما مهم وبالتالي لدينا الأساسية الفسيولوجية فهم ومعالجة الجوانب المتعدية للقناة الهضمية هرمون الإجراءات؛ ولكن كيف يمكن أحد دراسة آليات الاستشعار الجزيئية الكامنة وراء إفراز هرمون القناة الهضمية؟ وبصفة عامة، يمكن دراستها في الكائنات الحية سليمة (البشر أو الحيوانات التجريبية)، من الأعمال التحضيرية الأمعاء المعزولة أو من القناة الهضمية الثقافات الخلية الابتدائية إفراز هرمون إفراز هرمون أو خلد خلية الثقافات2،3، 4 , 5 , 6-لدينا النموذج المفضل هو الأمعاء الدقيقة الفئران المعزولة perfused، التي تعد نموذجا ذات صلة فسيولوجيا يسمح إفراز هرمونات القناة الهضمية دراستها بالتفصيل مع الوقت الأمثل القرار (إفراز معدلات يمكن أن يتحدد بأي وقت قاعدة وصولاً إلى الثانية)، ومن المرجح النتائج التحويل حالة المجراة في7. هنا، نحن نقدم بروتوكول مفصلة حول كيفية تنفيذ هذا الإجراء، ولكن أولاً سوف نناقش أساليب أخرى لدراسة إفراز هرمون القناة الهضمية، بما في ذلك الفوائد والقيود المفروضة على هذه النماذج مقارنة بالفئران المعزولة perfused الأمعاء.

إذا كان أحد يرغب في تحديد ما إذا كان مركب معين ينظم إفراز بعض هرمونات القناة الهضمية، دراسات في البشر هي الهدف النهائي. وهكذا، إذا كان مركب يبين آثار كبيرة على إفراز هرمونات القناة الهضمية واحد أو عدة في القوارض (في فيفو أو بيرفوسيونس) أو من هرمون إفراز الخلايا (خطوط الخلية أو الخلايا الأولية)، هذا التأثير فقط ذات الصلة بالطب وعلم وظائف الأعضاء البشرية إذا أنه يمكن تأكيد في البشر. ومع ذلك، هناك حدود واضحة لنوع الدراسات التي يمكن أن يؤديها في البشر، والدراسات المجراة في الحيوانات التجريبية كثيرا، ولذلك، ثاني أفضل خيار لمثل هذه الدراسات. الفئران والجرذان هي الحيوانات التجريبية الأكثر استخداماً يفترض بسبب حجمها مريحة ومنخفضة التكلفة وخيار وراثيا يغير الجينات المشتبه في تورطهم في أسئلة الدراسة محددة (مثلاً، ضرب من أصل نقل بعض أو مستقبلات). وبصفة عامة، في النماذج الحية تستفيد من كونها سليمة من الناحية الفسيولوجية، ولكن لها أيضا العديد من القيود. والأهم الحجم الصغير للقوارض، خاصة من الفئران، عاملاً مقيداً، كما تتطلب معظم فحوصات للقناة الهضمية الهرمون الكمي على الأقل 20 ميليلتر البلازما (وغالباً أكثر بكثير)، مما يعني أن مالا يقل عن 100 ميليلتر من الدم قد سحب لجعل نسخة مكررة القياس الكمي. ولذلك، من الممكن فقط للحصول على عينات قليلة جداً المقابلة لخط الأساس العينات وعينات التحفيز بعد واحد أو اثنين (وحجم الدم الإجمالي في ماوس غ 20 مل ~1.4). ونتيجة لذلك، الاستجابات المحتملة الافرازية (مثلاً، وسرعة أو تأخر حدوث استجابات) قد غاب عن ذلك.

في طراز التروية، هو التغلب على هذه المشكلة، كعينة كبيرة ويتم الحصول على وحدات التخزين (معدل التدفق: 7.5 مل/دقيقة) وفترات جمع يمكن تعديلها حسب الحاجة لضمان عدم ضياع الردود السريعة وقصيرة الأمد (ونحن جمع عينات كل دقيقة)7 . هناك مسألة أخرى مع في الدراسات فيفو في القوارض هو أن معظم هرمونات القناة الهضمية أكثر سرعة القضاء أو استقلاب من البشر8،،من910، مما قد يؤدي إلى تعقيد التحليل الكيميائية الحيوية اللاحقة. على سبيل المثال، أظهرنا أن يتم استقلاب GLP-1 في الفئران معدل أسرع حتى من البشر (حيث هو T1/2 1-2 دقيقة11)، والأهم من ذلك، ينطوي الانقسام ومن GLP-1 في الفئران، بالإضافة إلى الانقسام الطرفي ن ب ديبيبتيديل-بيبتيداسي-4 (DPP4) (وهو إنزيم المهينة GLP-1 الرئيسية في البشر)، المزيد من الانقسام ومحايدة endopeptidase 24.11 إنزيم12. ونتيجة لذلك، إلى حد كبير فحوصات التجارية الحالية للتحديد الكمي ل GLP-1، التي تقوم أما على isoform سليمة GLP-1 (7-36amide) أو إيسوفورم الحزب الديمقراطي التقدمي-4 المشقوق (9-39amide)، يقلل من إفراز GLP-1 في الفئران، ويؤدي إلى نتائج مضللة 12-في الأمعاء الدقيقة الفئران المعزولة perfused، معظم التمثيل الغذائي للهرمونات يفرزها هو إلغاء أو تخفيض ملحوظ، حيث يتم تجنب تدهور بوساطة البلازما، ويمنع استخراج/تدهور الكبد/الكلي/الرئة (بسبب بيرفوساتي هو جمع كما أنه يترك القناة الهضمية).

وبطبيعة الحال، فكرة هامة يمكن إنشاؤها بواسطة استخدام الحيوانات المحورة وراثيا، مثل، الصوديوم-الجلوكوز الناقل-1 خروج المغلوب الفئران13، لكن يتطلب إجراء تقييم مفصل لأجهزة الاستشعار الجزيئية المشاركة في إفراز غالباً النظر في العديد من مواقع الجزيئية، تتراوح بين الناقلين الجزيئية للقنوات الأيونية ومن مستقبلات مختلفة إلى جانب البروتين ز للبروتينات داخل الخلايا. على سبيل المثال، نحن تستهدف نشاط تسعة مواقع الجزيئية مختلفة عندما كشف أجهزة الاستشعار الجزيئية المسؤولة عن تحفيز الجلوكوز إفراز GLP-17. لن يكون إجراء تحقيق مماثل ممكن المجراة في بعض المركبات المستخدمة يكون غير محدد أو الآثار الضارة/القاتلة. على سبيل المثال، عند استخدام القناة الهضمية بيرفوسيد، كان من الممكن لتقييم دور استقلاب الجلوكوز داخل الخلايا لإفراز GLP-1 ونيوروتينسين بعرقلة تشكيل ATP مع14 من 2-4-دينيتروفينول7،، فضلا عن دور قنوات الكالسيوم الجهد عن طريق بوابة للأحماض الصفراوية تحفز إفراز GLP-1 و NT وبيي3. في الواقع، يمكن تطبيق تيدرودوتاكسين مانع قناة الصوديوم شديدة السمية بنجاح في الدراسات التروية. وأخيراً، في نموذج التروية يمكن مباشرة تقييم فيها في الأمعاء يحفز مركب معينة إفراز هرمون معينة، كما المحقق ببساطة اختيار وإعداد المنطقة المطلوب نتخلل، وفي الوقت نفسه فإنه يمكن أن يحقق ما إذا كانت الأسباب حافزا إفراز بتنشيط أجهزة الاستشعار الجزيئية من جانب لومينال أو الأوعية الدموية الأمعاء3،،من1516.

استخدام آليات الافرازية الأساسية إفراز هرمون القناة الهضمية قد أيضا أن تدرس قطع أنسجة القناة الهضمية (بما في ذلك الأنسجة البشرية)، ثقافات المعوية الأولية (عادة من الفئران)، خلد هرمون إفراز خطوط الخلايا (للماوس أو الأصل البشري)، بالقناة الهضمية الأنسجة المركبة في الدوائر أوسينج أو أورجانويدس (سواء في أغلب الأحيان من الفئران)2،3،4،،من56،،من1718. مقارنة بيرفوسيونس المعوية، دراسات بشأن قطع القناة الهضمية البشرية والثقافات الخلية الأولية وخطوط الخلية هي أسهل من الناحية الفنية لأداء وهي أسرع وأرخص وسيلة لتوليد البيانات، ولكن بطبيعة الحال يتطلب دراسة قطع القناة الهضمية الوصول إلى القناة الهضمية البشرية الطازجة العينات. ومع ذلك، في هذه النماذج استقطاب الخلية العادية للقناة الهضمية المفقودة أصلاً، بمعنى أنه لا يمكن استخدام هذه النماذج لتقييم التنشيط العادي من أجهزة الاستشعار الجزيئية، وعمليات الاستيعاب أيضا لا يمكن أن تدرس. وعلاوة على ذلك، تستخدم هذه الدراسات عادة إينكوباتيونس ثابتة (لتصل إلى ح عدة) الذي هو الغاية غير الفسيولوجية ولا علاقة له مع ديناميات الخلايا الافرازية العادي، لأنه لا يتم إزالة المنتج يفرزها ومما قد يؤثر على ردود الفعل إفراز الهرمونات. وفي المقابل، في الأمعاء بيرفوسيد، جزيئات يفرزها واستيعابها كفاءة إزالة بدوران الأوعية الدقيقة المخاطية كما الحية، ضمان الإبقاء على التدرجات ترانسموكوسال حيث يمكن أن يحدث امتصاص وإفراز بمعدل طبيعي. وعلاوة على ذلك، قد يكون ديديفيرينتياتيد الثقافات الخلية من أصلهم خلية انتيروندوكريني الأصلي، بمعنى أنها لم تعد الممثل للخلايا الأصلية من حيث المحتوى الببتيد والتعبير عن أجهزة الاستشعار الجزيئية، على الرغم من أنها قد لا تزال إفراز الهرمون في السؤال. على سبيل المثال، هذا هو الحال بالنسبة للخلية المبيضي GLP-1 خطوط19.

أنها، لذلك، رأينا أن الثقافات الخلية الأولية أو الخلية خط الدراسات الأكثر ملاءمة لأغراض الفرز وأداء أنواع التجارب التي لا يمكن أن يؤديها في فيفو أو في القناة الهضمية perfused معزولة. على سبيل المثال، هو قوة حقيقية الخلية الابتدائية الثقافات والثقافات خط الخلية الثانوية داخل الخلوية أن الرسل (مثل Ca2 +، مخيم، NAD(P)H) يمكن رصدها في الوقت الحقيقي، والإشارات الكهربائية من هرمون إفراز الخلايا يمكن أن تكون التحقيق في20،،من2122. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يتم siRNA ضربة قاضية، وهي مفيدة بشكل خاص إذا كانت مثبطات محددة غير متاح20،،من2122،،من2324. واستخدمت أنسجة القناة الهضمية من الفئران التي شنت في الدوائر أوسينج مؤخرا لدراسة الآليات الجزيئية الكامنة وراء حفز إفراز GLP-1 حامض الصفراء، بينما أورجانويدس المعوية (من الفئران) وقطع القناة الهضمية البشرية قد استخدمت أيضا لدراسة تفاصيل الجزيئية للقناة الهضمية إفراز هرمون17،25. في حين أن الفوائد السابقة من أن الاستقطاب2 جميع هذه النماذج تنطوي إينكوبيشنز ثابتة. دراسات بشأن قطع القناة الهضمية البشرية، إلا أن تستفيد من استخدام الأنسجة البشرية، بدلاً من القوارض، هو أمر مهم منذ اختلاف الأنواع في التعبير الأنسجة مستقبلات 7TM والناقلين الجزيئية قد يسفر عن مسارات الاستشعار الجزيئية مختلفة بين الأنواع. وفي الحقيقة، معظم البيانات في هذا الحقل تم إنشاؤها بواسطة الدراسات على الخنازير، الفئران أو الجرذان، وأنه لا يزال بعيد المنال، ما إذا كان يمكن نقل هذه النتائج إلى البشر. بيد أنه من المطمئن أنه يبدو أن آليات الاستشعار الجزيئية التي تكمن وراء حفز الجلوكوز إفراز GLP-1 مماثلة بين الماوس وفار، والرجل، وكشف ترانسكريبتوميك والتنميط بيبتيدوميك الماوس ولالخلايا البشرية قوي عالمية أوجه التشابه بين هذين النوعين7،18،،من2627.

ومع ذلك، قد الفئران المعزولة perfused الأمعاء الدقيقة، أيضا بعض القيود التي يجب أن تعتبر. الأهم من ذلك، من المستحيل تحديد ما إذا كانت استجابة افرازية معينة ناتجة عن التنشيط المباشر بمضمون اختبار الخلايا المنتجة لهرمون المستهدفة أو بالأحرى بسبب إليه غير مباشرة. على سبيل المثال، بوكل يزيد على الفور إفراز GLP-1 من الأمعاء بيرفوسيد7، ولكن لا يزال غير معروف ما إذا كان هذا هو نتيجة ل depolarization المباشرة للأم-الخلية أو ناتجة عن ديبولاريزيشن من الخلايا العصبية القريبة من L-الخلايا أو آثار في الوقت نفسه أطلق سراح paracrine المنبهات/مثبطات. البيانات الناشئة عن الدراسات باستخدام الأمعاء بيرفوسيد التي تهدف إلى توضيح الآليات الجزيئية الكامنة وراء إفراز ينبغي، ولذلك دائماً أن توضع في سياق مع البيانات التي تم الحصول عليها من نماذج أخرى أكثر تحديداً لزيادة القدرة على إنشاء العلاقة السببية. على سبيل المثال، حفزت الجلوكوز إفراز GLP-1 من خط خلية المبيضي GLP-1 جلوتاج28،29 ومن الماوس الأساسي لالخلايا تعتمد على نشاط الناقلين الجلوكوز (SGLT1 و GLUT2). حجب هذه الناقلين في الأمعاء perfused الفئران كما يخفف إفراز20، بمعنى أنه من المرجح أن تحفز الجلوكوز إفراز GLP-1 هو إلى حد كبير بوساطة من الإجراءات المباشرة الجلوكوز في الخلية-L. قيد هام آخر من الأمعاء perfused معزولة بعض من الدهون صعوبة في الدراسة بسبب ما هيدروفوبيسيتي. على الرغم من أنه من الممكن للتحقيق في المنتجات النهائية لهضم الدهون (الأحماض الدهنية، جليسيرولس دياسيل، ليسوفوسفاتيديلجليسيرولس، إلخ) وعلى الرغم من أن الإعداد قد تكون قادراً على إعادة استيريفي الدهون داخل سيلولارلي وربما حزمة لهم في هو تعطل chylomicrons، والنقل ل chylomicrons خارج الخلايا وعلى امتصاص لاكتيلس الزوائد اللاحقة، إذ لا يمكن تأمين تدفق الليمفاوية في الأمعاء المعزولة. على الأرجح، ولذلك امتصاص الدهن توقف بمجرد بدء استيعاب المنتجات التي تتراكم في الخلايا. نظم الخلايا في المختبر حتى أقل ملاءمة للدراسات الدهن بسبب افتقارها إلى الاستقطاب. ومن الواضح أن هذا القيد هو فقط ذات الصلة للدهون التي يتم استيعابها وتنقل عبر لاكتيلس، بينما تلك التي استوعبت عبر الأوعية الدموية المعوية من المرجح أن تعامل عادة.

Protocol

وأجريت جميع الدراسات بإذن من "مفتشية التجارب الحيوانية الدانمركية" (2013-15-2934-00833) واللجنة الأخلاقية المحلية، وفقا للمبادئ التوجيهية للتشريع الدانمركي تنظم التجارب الحيوانية (1987) والوطنية المعاهد الصحية (المنشور رقم 85-23).

1-التجريبية الحيوانات

  1. الحصول على ذكور الفئران ويستار (250 غرام) والبيت 2 في قفص، مع الوصول ad متواصلة إلى تشو القياسية، والمياه، والحفاظ عليها في 12:12 ح دورة الضوء الظلام. لدينا مرافق الحيوانات تستخدم المياه غير المعالجة، وتشو الرترومين القوارض (1319 فورتي، بروجاردين، لينغي، الدانمرك).
    ملاحظة: تسمح الحيوانات بأسبوع واحد على الأقل من التأقلم.

2-قبل الجراحة الاستعدادات

  1. جعل نضح المخزن المؤقت: استكمال كريبس-المسابقة بيكربونات المخزن المؤقت مع جيش صرب البوسنة 0.1% (جزء الخامس)، فيوماريت 5% ديكستران T-70 3.5 ملمول/لتر جلوكوز وبيروفات 5 ملمول/لتر، ومن الغلوتامات (إذا لزم الأمر)؛ الرقم الهيدروجيني 7.4.
  2. إعداد كمية كافية من نضح المخزن المؤقت عن طريق تصفية أنه عبر حجم مناسب لتصفية وضبط الأس الهيدروجيني إلى ~7.5 بالإضافة دروبويسي من 5 م HCl.
  3. إضافة 3-إيسوبوتيل-1-زانتين (إيبمكس) (إذا لزم الأمر) مباشرة إلى المخزن المؤقت في اليوم للدراسة بتركيز نهائي من 10 ميكرون.
    ملاحظة: إيبمكس هو مثبط فوسفوديستريس أن يزيد [المخيم]أنا ومما يعيد الحساسية والاستجابة للقناة الهضمية من حيث إفراز الهرمونات إلى حافز افرازية.
  4. إعداد اختبار اﻷض. تحضير المحفزات الأوعية الدموية في 20 x تركيز أعلى من التركيز النهائي المطلوب في المخزن المؤقت التروية التي تمت تصفيتها وضبط الأس الهيدروجيني. إعداد اختبار لومينال المحفزات في المحلول الملحي متساوي التوتر في تركيز النهائي.
  5. حل المركبات عدم سهولة الذوبان في 100% ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس]) وتضعف زيادة في المخزن المؤقت التروية أو المحلول الملحي متساوي التوتر. للمنبهات والأوعية الدموية، إبقاء التركيز [دمس] النهائي في 1 في المائة أو أقل، تركيزات أعلاه هذا الضرر الأمعاء وقد يؤدي إلى إفراز هرمون الأمعاء غير محدد. قياس درجة الحموضة والتكيف مع ~7.5 إذا لزم الأمر.

3-العملية والتروية

ملاحظة: مثال على إعداد نضح يرد في الشكل 1.

  1. تخدير الفئران باستخدام نظام مخدر يمكن المحافظة على التخدير الجراحي والتسكين لمدة 30-40 دقيقة قبل هيبنورم/الميدازولام (0.3 مل/100 غرام من وزن الجسم، كل مل: هيبنورم: شيفتشنكو 0.08 ملغ، فلوانيسوني 2.5 ملغم، 0.45 مغ باراهيدروكسيبينزواتي الميثيل، 0.05 مغ باراهيدروكسيبينزواتي روبيل، الميدازولام: 1.25 ملغ، مصفوفة المستحضرات الصيدلانية، هيليروب، الدانمرك)
  2. تحقق من عدم وجود ردود الفعل (قرصه تو) ومكان الفئران على طاولة العمليات ساخنة وتنفيذ شق الجلد لفضح الأمعاء.
  3. يعرض الجزء الطرفي من القولون عن طريق تحريك الأمعاء جانبا بقدر الإمكان. التعادل ليمدها المفرج إلى القولون والمكوس تدريجيا بدءاً من الجزء الطرفي من القولون، تتحرك نحو الأمعاء.
    1. إذا كان فقط جزء معين من الأمعاء الدقيقة المطلوبة التروية (النصف العلوي)، المكوس أجزاء غير مطلوبة بعد ربط إيقاف تزويد المفرج. لتقليل الضرر الأنسجة وترطيب الأمعاء مع المحلول الملحي متساوي التوتر واستخدام مسحات لإزالة النسيج الضام.
  4. إدراج أنبوب بلاستيكي (الطول: ~ 15 سم، القطر الخارجي: ~0.4 سم) في التجويف المعوي (في الجزء الدانية) والتعادل بشكل صحيح باستخدام خياطة الجروح. مسح بعناية مع المحلول الملحي متساوي التوتر (درجة حرارة الغرفة) إفراغ التجويف كيموس.
  5. نتخلل التجويف مع المحلول الملحي متساوي التوتر في تدفق من 0.25 مل/دقيقة، واستخدام حقنه 10 مل متصلاً بمضخة الحقن.
  6. تحريك الأمعاء جانبا حتى الشريان المساريقي العلوي العلوي موجوداً وإزالة النسيج الضام والدهون لفضح الشريان.
  7. وضع خياطة الجروح اثنين تحت الشريان المساريقي العلوي باستخدام الملقط غرامة نقطة؛ يتمثل خيوط لرفع الشريان لمراقبة النزيف مرة واحدة وقد تم قطع الشريان والآخر لتأمين القسطرة التي توضع في الشريان. أخذ الحيطة والحذر لا ثقب الشريان.
  8. وضع خياطة الجروح اثنين تحت الوريد البابي لتأمين القسطرة المعدنية التي سوف توضع في الوريد لجمع النفايات السائلة التروية.
  9. قبل قطع الثقب في الشريان المساريقي العلوي، التأكد من أن القسطرة التي تم إدراجها إلى الخوض في الشريان مليئة نضح العازلة لمنع تشكيل صمة الجوية.
  10. قطع ثقب صغير في الشريان المساريقي العلوي باستخدام زوج من المقص الجراحي وإدخال قسطرة بلاستيكية مباشرة بعد.
  11. البدء فورا بعد وقد تم تأمين القسطرة، نضح من القناة الهضمية قبل بدء تشغيل المضخة الدوارة (معدل التدفق = 7.5 مل/دقيقة).
  12. التأكد من أن الأوعية الدموية في القناة الهضمية بدوره بالي في غضون ثوان، ويتحول الوريد البابي شاحبة.
  13. فورا بعد تأسيس التروية المناسبة، قطع ثقب في الوريد البابي، إدخال قسطرة معدنية وتأمينه مع الخياطة.
    ملاحظة: القسطرة يمكن أن يكون صعباً للمكان ولكن حتى رفع الوريد عن طريق سحب حذر يساعد خياطة الدانية أكثر.
  14. مرة واحدة القسطرة في المكان والإخراج نضح مرضية، قتل الفئران انثقاب الحجاب الحاجز، مع الحرص على عدم التمزق خارجاً القسطرة.
  15. جمع الإخراج نضح لمدة 1 دقيقة وقياس الحجم. بدء تشغيل ضغط التروية اقتناء/التسجيلات انقر فوق تنفيذ التجربة في برنامج تسجيل الضغط.
  16. وتغطي القناة الهضمية مع ترطب الأنسجة لمنعه من الجفاف خلال التجربة.
  17. تأكد من أن نهاية الأمعاء القاصي غير محظور حتى أنه يمكن الخروج من النفايات السائلة لومينال، خلاف ذلك سوف تضخم الأمعاء وستضع ذمة، سيزيد ضغط التروية وسوف ينخفض الإنتاج التروية.
  18. اترك إعداد لمدة حوالي 30 دقيقة قبل البدء التجربة.
    ملاحظة: نواتج افرازية من هرمونات القناة الهضمية متقلب جداً لأول 15 دقيقة من نضح، حيث هناك حاجة إلى هذه الخطوة الموازنة للحصول على خط ثابت.

4-التجربة

  1. بعد حوالي 30 دقيقة من نضح، بدء التجربة قبل جمع العينة الأساس الأولى استخدام جامع كسر. جمع العينات في الفاصل الزمني المطلوب (على سبيل المثال، عادة ما تجمع كل دقيقة، مل 6.5-7.5) ووضعها على الجليد في غضون دقائق قليلة.
  2. تفتيش في فخ فقاعة بانتظام، وإذا أفرغت، الملء مع المخزن المؤقت التروية.
    1. تجمع المخزن المؤقت عن طريق الديك-صمام ثلاثي فورا قبل أن يدخل الجهاز ومن القسطرة إدراجها في الوريد البابي (بعد أن كان قد تم perfused من خلال الجهاز) للتأكد من أن الجهاز النشط أيضي. جمع العينات في بداية ونهاية التجربة لتقييم جدوى طوال التجربة.
    2. قياس العينات بسرعة، مع محلل غاز دم الآلي، كما يحتوي على أكثر من البلاستيك/المحاقن غير محكم تماما، مما أدى تبادل مع الهواء الجوي.
  3. بعد 10-15 دقيقة لجمع خط الأساس، تحفز على مضمون الاختبار الأول. إدارة التحفيز داخل الشرايين مع مضخة الحقن عن طريق محبس الحنفية ثلاثية (تدفق = 0.350 مل/دقيقة).
  4. إجراء التحفيز لومينال بحقن بلعه أولية (2.5 مل/دقيقة على مدى 5 دقائق الأولى)، لتحل محل المياه المالحة متساوي التوتر موجود بالفعل في التجويف، تليها الإدارة من الاختبار حل انخفاض معدل تدفق (0.5 مل/دقيقة).
  5. لضمان أن التجويف بسرعة إفراغ جوهر الاختبار بعد انتهاء فترة التحفيز لومينال، مسح التجويف المعوي مع المحلول الملحي متساوي التوتر عن طريق تطبيق معدلات تدفق نفس النحو الوارد أعلاه.
  6. جمع عينات خط الأساس لمدة 15-30 دقيقة قبل أن تتولى تطبيق مضمون الاختبار القادم. اعتماداً على البروتوكول، يمكن عادة ما تكون 2-3 اختبار المنشطات شملت كل تجربة. إذا كان البروتوكول التجريبي يتضمن تنشيط/تثبيط لموقع معين الجزيئية في وقت واحد مع الإدارة للارتباط عينها، دائماً ما قبل تنشيط مع المنشط/المانع 10-15 دقيقة قبل إدارة الارتباط إلى التأكد من أن الموقع الجزيئية هو إعاقة في البداية لضخ الارتباط.
  7. في نهاية البروتوكول، إدارة (5-10 دقيقة) عنصر تحكم إيجابية مناسبة لاختبار مدى استجابة للإعداد وجمع عينات خط الأساس 10-15 دقيقة بعد فترة التحفيز.
    ملاحظة: عدة اختبار مواد يمكن أن تستخدم كمراقبة إيجابية، مثلاً، المنبهات لزيادة [المخيم]أنا (على سبيل المثال، فوسكولين أو إيبمكس)، [Ca2 +]أنا (مثلاً، بومبيسين أو نيورومالدين ج)، ديبولاريزينج وكلاء (مثل، 30-50 ملم بوكل) أو أكثر المحفزات فسيولوجيا ذات الصلة مثل المغذيات الكبيرة: الجلوكوز، هضمون، الأحماض الأمينية، إلخ. ومع ذلك، خيار التحكم الإيجابي يعتمد على نتائج تجريبية. الجلوكوز على سبيل المثال إفراز سيكريتين فقيرة (CCK) بينما بومبيسين ليس إفراز قوية تعتمد على الجلوكوز إينسولينوتروبيك إفراز الببتيد (GIP)30.
  8. بعد انتهاء التجربة، المكوس القناة الهضمية perfused وتزن عليه وقياس طوله. وضعها في بارافورمالدهيد وتخزينها (4 درجة مئوية) المحتملة فيما بعد من تحليل histochemical لسلامة الأنسجة/الضرر، على سبيل المثال تلطيخ ح & ه.

5. البيوكيميائية القياسات

  1. قياس تركيزات الببتيدات يفرز في النفايات السائلة وريدي باستخدام الكلون (RIA) داخلية أو المتاحة تجارياً أو فحوصات ELISA. للدراسات أن التحقيق في امتصاص الأمعاء، تحديد حجم جزيء الاهتمام، مثل، الجلوكوز أو الأحماض الأمينية، في النفايات السائلة وريدي.
    ملاحظة: بيرفوساتي هو عادة مخزن مؤقت القاعدية جيدة لمعظم التحليلات، بما في ذلك الاختبارات التي تعتمد على التفاعلات الانزيمية (مثل التحديد الكمي الجلوكوز بواسطة الأسلوب جلوكوسيوكسيداسي).

6-بيانات التحليل

  1. تقديم البيانات بطرق مختلفة، على سبيل المثال كرسم تركيز الوقت يظهر الإخراج الافرازية الفعلية (تدفق × تركيز) وارسم العمود يصور الافرازية إجمالي الإنتاج خلال فترات الأساس واستجابة (عادة ما تكون النقاط الزمنية 10-15).
  2. ارسم التركيز المقاس الفعلي من الهرمونات كل منهما كوحدات تركيز. (pmol/L)،
    ملاحظة: فمن الأفضل للتعبير عن البيانات بدلاً من ذلك كإخراج (فمول/دقيقة) نظراً لأن مع هذا النموذج، على النقيض من الدراسات المجراة في القيم التي تم الحصول عليها هي الإخراج الافرازية الفعلية (بسبب جمع النفايات السائلة نضح ثابتة).
  3. اعتماداً على عدد المجموعات يتم تحليلها إحصائيا، استخدام ثنائي الطرف إقران اختبار t (الفريقين) أو أحادي الاتجاه ANOVA للقياسات المتكررة (أكثر من فريقين) متبوعاً بإجراء اختبار وظيفة مناسبة-مخصصة لإجراء مقارنات متعددة.

النتائج

القدرة على تحديد ما إذا كان حافز معين يسبب إفراز هرمون القناة الهضمية للفائدة يعتمد على إفراز خط ثابت. وعلاوة على ذلك، إذا لوحظ أي استجابة للحافز، يجب أن تكون استجابة افرازية قوية لمراقبة إيجابية واضحة لاستبعاد أن عدم استجابة لحافز الاختبار لا يعبر عن نقص عام في القدرة ع?...

Discussion

الأمعاء الدقيقة الفئران المعزولة perfused هو أداة قوية لبحث يسمح لديناميات والآليات الجزيئية الكامنة وراء إفراز هرمون القناة الهضمية دراستها بالتفصيل. أن الخطوة الأكثر أهمية للنجاح في إنتاج البيانات بهذا النموذج هو العملية الجراحية. التعامل مع القناة الهضمية حتما سوف يسبب بعض الضرر للامعا?...

Disclosures

مرتكبي هذا العمل تعلن لا تضارب محتمل في المصالح ذات الصلة بهذه المادة.

Acknowledgements

هذا العمل وأيده على منحة غير مقيد إلى البروفيسور ينس يول هولست من مركز نوفو نورديسك "البحوث الأساسية الأيضية" (نوفو نورديسك مؤسسة، الدانمرك)، منحة منفصلة من مؤسسة نوفو نورديسك للقيام بدراسات نضح القوارض (منحة لا. NNF15OC0016574)، منحة إلى الأستاذ هولست من مجلس البحوث الأوروبي (منحة no.695069) والاتحاد theEuropean في "البرنامج الإطاري السابع" للبحوث، تيتشنولوجيكالديفيلوبمينت، وأنشطة البيان العملي (المنحة رقم 266408)، فضلا عن مأزق منحة لكوري أ رون من مؤسسة Lundbeck (R264-2017-3492). ونحن نشكر جينا هاء هانت وكارولين ف. الشماس لتصحيح التجارب المطبعية حذراً.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Chemicals for perfusion buffer
Bovine serum albumin (BSA)Merck1.12018.0500
Calcium chloride dihydrate (CaCl2 x 2 H2O)Merck102382
Dextran 70Pharmacosmos40014
Fumaric acid disodium salt (C44H2Na2O4)Sigma AldrichF9642
Glucose (C6H12O6)Merck108342
Magnesium sulfate hepatahydrate (MgSO4)Merck105886
Potasium chloride (KCl)Merck104936
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4)Merck104873
Pyruvic acid sodium salt (C3H3NaO4)Merck106619
Sodium bicarbonate (NaHCO3)Merck
Sodium chloride (NaCl)Merck106404
Sodium L-glutamate monohydrate (C5H8NNaO4 x H2O)Merck106445
NameCompanyCatalog NumberComments
Perfusion equitment
Universial perfusion systemHarvard Bioscience, Inc.732316
BASIC UNIT UNIPER UP-100, TYPE 834Harvard Bioscience, Inc.
Roller Pump, with four channelsHarvard Bioscience, Inc.730100
WindkesselHarvard Bioscience, Inc.732068
Thermostatic Circulator,Bath Volume 3L, 230V/50HzHarvard Bioscience, Inc.730125
Operating table, heated on tripod stand, type 873Harvard Bioscience, Inc.733776
Cannula with basked, OD = 2.0 mm, ID = 1.0 mmHarvard Bioscience, Inc.733313

References

  1. Rindi, G., Leiter, A. B., Kopin, A. S., Bordi, C., Solcia, E. The "normal" endocrine cell of the gut: changing concepts and new evidences. Annals of the New York Academy of Sciences. 1014, 1-12 (2004).
  2. Brighton, C. A., et al. Bile Acids Trigger GLP-1 Release Predominantly by Accessing Basolaterally Located G Protein-Coupled Bile Acid Receptors. Endocrinology. 156, 3961-3970 (2015).
  3. Kuhre, R. E., et al. Bile acids are important direct and indirect regulators of the secretion of appetite- and metabolism-regulating hormones from the gut and pancreas. Molecular Metabolism. , (2018).
  4. Roberge, J. N., Brubacker, P. L. Secretion of Proglucagon-Derived Peptides in Response to Intestinal Luminal Nutrients. Endocrinology. 128, 3169-3174 (1991).
  5. Brubaker, P. L., Schloos, J., Drucker, D. J. Regulation of glucagon-like peptide-1 synthesis and secretion in the GLUTag enteroendocrine cell line. Endocrinology. 139, 4108-4114 (1998).
  6. Jacobsen, S., et al. Changes in Gastrointestinal Hormone Responses, Insulin Sensitivity, and Beta-Cell Function Within 2 Weeks After Gastric Bypass in Non-diabetic Subjects. Obesity Surgery. 22, 1084-1096 (2012).
  7. Kuhre, R. E., Frost, C. R., Svendsen, B., Holst, J. J. Molecular mechanisms of glucose-stimulated GLP-1 secretion from perfused rat small intestine. Diabetes. 64, 370 (2014).
  8. Svendsen, B., Holst, J. J. Regulation of gut hormone secretion. Studies using isolated perfused intestines. Peptides. 77, 47-53 (2016).
  9. Ratner, C., et al. Effects of Peripheral Neurotensin on Appetite Regulation and Its Role in Gastric Bypass Surgery. Endocrinology. 157, 3482-3492 (2016).
  10. Wewer Albrechtsen, N. J., et al. Dynamics of glucagon secretion in mice and rats revealed using a validated sandwich ELISA for small sample volumes. American Journal of Physiology Endocrinology and Metabolism. 311, E302-E309 (2016).
  11. Vilsboll, T., Agerso, H., Krarup, T., Holst, J. J. Similar elimination rates of glucagon-like peptide-1 in obese type 2 diabetic patients and healthy subjects. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 88, 220-224 (2003).
  12. Windelov, J. A., et al. Why is it so difficult to measure glucagon-like peptide-1 in a mouse?. Diabetologia. 60, 2066-2075 (2017).
  13. Gorboulev, V., et al. Na+-d-glucose Cotransporter SGLT1 is Pivotal for Intestinal Glucose Absorption and Glucose-Dependent Incretin Secretion. Diabetes. 61, 187-196 (2012).
  14. Kuhre, R. E., Bechmann, L. E., Wewer Albrechtsen, N. J., Hartmann, B., Holst, J. J. Glucose stimulates neurotensin secretion from the rat small intestine by mechanisms involving SGLT1 and GLUT2, leading to cell depolarization and calcium influx. American Journal of Physiology Endocrinology and Metabolism. 308, E1123-E1130 (2015).
  15. Kuhre, R. E., Christiansen, C. B., Saltiel, M. Y., Wewer Albrechtsen, N. J., Holst, J. J. On the relationship between glucose absorption and glucose-stimulated secretion of GLP-1, neurotensin, and PYY from different intestinal segments in the rat. Physiological Reports. 5, (2017).
  16. Svendsen, B., et al. An analysis of cosecretion and coexpression of gut hormones from male rat proximal and distal small intestine. Endocrinology. 156, 847-857 (2015).
  17. Goldspink, D. A., et al. Mechanistic insights into the detection of free fatty and bile acids by ileal glucagon-like peptide-1 secreting cells. Molecular Metabolism. 7, 90-101 (2018).
  18. Sun, E. W., et al. Mechanisms Controlling Glucose-Induced Glp-1 Secretion in Human Small Intestine. Diabetes. , (2017).
  19. Kuhre, R. E., et al. Peptide production and secretion in GLUTag, NCI-H716 and STC-1 cells: a comparison to native L-cells. Journal of Molecular Endocrinology. 56, 11 (2016).
  20. Reimann, F., et al. Glucose sensing in L cells: a primary cell study. Cell Metabolism. 8, 532-539 (2008).
  21. Reimann, F., et al. Characterization and functional role of voltage gated cation conductances in the glucagon-like peptide-1 secreting GLUTag cell line. The Journal of Physiology. 563, 161-175 (2005).
  22. Kuhre, R. E., et al. Fructose stimulates GLP-1 but not GIP secretion in mice, rats and humans. American journal of physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 306, G622-G630 (2014).
  23. Reimann, F., Tolhurst, G., Gribble, F. M. G-Protein-Coupled Receptors in Intestinal Chemosensation. Cell Metabolism. 15, 421-431 (2012).
  24. Parker, H. E., et al. Molecular mechanisms underlying bile acid-stimulated glucagon-like peptide-1 secretion. British Journal of Pharmacology. 165, 414-423 (2012).
  25. Petersen, N., et al. Generation of L cells in mouse and human small intestine organoids. Diabetes. 63, 410-420 (2014).
  26. Parker, H., et al. Predominant role of active versus facilitative glucose transport for glucagon-like peptide-1 secretion. Diabetologia. 55, 2445-2455 (2012).
  27. Roberts, G. P., et al. Comparison of Human and Murine Enteroendocrine Cells by Transcriptomic and Peptidomic Profiling. Diabetes. , (2019).
  28. Reimann, F., Gribble, F. M. Glucose-Sensing in Glucagon-Like Peptide-1-Secreting Cells. Diabetes. 51, 2757-2763 (2002).
  29. Drucker, D. J., Jin, T., Asa, S. L., Young, T. A., Brubaker, P. L. Activation of proglucagon gene transcription by protein kinase-A in a novel mouse enteroendocrine cell line. Molecular Endocrinology. 8, 1646-1655 (1994).
  30. Svendsen, B., et al. GLP1- and GIP-producing cells rarely overlap and differ by bombesin receptor-2 expression and responsiveness. The Journal of Endocrinology. 228, 39-48 (2016).
  31. Bak, M. J., et al. Specificity and sensitivity of commercially available assays for glucagon-like peptide-1 (GLP-1): implications for GLP-1 measurements in clinical studies. Diabetes, Obesity & Metabolism. 16, 1155-1164 (2014).
  32. Jacobsen, S. H., et al. Effects of gastric bypass surgery on glucose absorption and metabolism during a mixed meal in glucose-tolerant individuals. Diabetologia. 56, 2250-2254 (2013).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

144 perfused 1

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved