JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

التحليل تجميع تاو الموصوفة في هذه المخطوطة يحاكي الميزات المتوقعة في فيفو ميسفولدينج تاو والتجميع.

Abstract

تجميع البروتين تاو وتشكيل خيوط حلزونية المزدوجة السمة مميزة لمرض الزهايمر وغيرها تاوباثيس. بالمقارنة مع غيرها من البروتينات المرتبطة بأمراض الأعصاب، حركية تجميع المبلغ عنها في المختبر للبروتين تاو أقل اتساقا تقديمه تقلب عالية نسبيا. هنا يصف لنا وضع في المختبر تجميع الإنزيم الذي يحاكي الخطوات المتوقعة المرتبطة مع تاو ميسفولدينج والتجميع في فيفو. ويستخدم المقايسة isoform تاو أطول (huTau441) الذي يحتوي على كلا من الطرفي ن إدراج الحمضية فضلا عن أربعة مجالات ملزمة ميكروتوبولي (مليون برميل يوميا). التجميع في المختبر هو سببها إضافة الهيبارين وتليها الأسفار ثيوفلافين تي في شكل 96 ميكروسكوبية جيدا باستمرار. التحليل تجميع تاو استنساخه عاليا بين آبار مختلفة وتشغيل تجريبي ودفعات من البروتين. التجميع يؤدي إلى تاو مورفولوجيا هوكي الشبيهة التي فعالة جداً في بذر تشكيل هياكل نوفو دي فيبريلار. بالإضافة إلى تطبيقه في دراسة إليه misfolding تاو والتجميع، التحليل الحالي هو أداة قوية لفحص المخدرات التي يمكن أن تتداخل مع إمراضية تاو.

Introduction

مرض الزهايمر هو اضطراب الأعصاب مدمرة هيستوباثولوجيكالي المعرف بواسطة تراكم لويحات خرف خارج الخلية من مجمعة اميلويد بيتا1 والتشابك نيوروفيبريلاري داخل الخلايا التي تحتوي على تجميع هايبرفوسفوريلاتيد تاو البروتين2. تاو الفسيولوجية أحادي وتقديمها ستة isoforms الفريدة التي تحتوي على 0-2 إدراج الطرفي ن والربط ميكروتوبولي 3 أو 4 المجالات3،4 الناجمة عن الربط بديلة ومتوسط فوسفوريليشنز 2-3. ويعتقد أن هايبرفوسفوريليشن وميسفولدينج والتجميع الذاتي في الهياكل فيبريلاري تشكل العناصر الرئيسية في تاو المرضية، مرضية المقررة في الأفراد الجنونية5،6.

التشابك تاو neurofibrillary المجمعة السمة مميزة للإعلان ليس فقط بل أيضا لسائر تاوباثيس، بما في ذلك انحطاط فصي فرونتوتيمبورال (فتلد) لاختيار المرض والشلل التدريجي supranuclear (PSP)، الخرف فرونتو الزمانية (FTD) والابتدائية تاوباثي المتعلقة بالعمر (الجزء)2. من وجهة نظر الكيمياء الحيوية، فهم إليه misfolding تاو والتجميع يمكن إلقاء الضوء على العمليات المرضية المرتبطة بالإعلانات وأخرى تاوباثيس. بالإضافة إلى الجانب العلمي، قوية في المختبر فحوصات تجميع أدوات قيمة لفحص المخدرات المرشحين7،،من89،10. ويعتقد أن تراكم تاو يتبع التنو بلمرة تعتمد عملية (الحزب الوطني)11،12،،من1314. حركية الحزب الوطني سيجمويدال ويبدأ بخطوة التنو نشاط غير مواتية تليها عملية انحدار سريع نشاط تجميع.

خلافا لغيرها من البروتينات أميلويدوجينيك، بما في ذلك بروتين بريون، وبيتا اميلويد و α-سينوكلين، وتاو لا تجميع عفويا في ظل الظروف الفسيولوجية وتتمثل حتى المتطرفة أو درجات حرارة عالية غير مواتية لتجميع15. وهذا على الأرجح بسبب التفاعلات هيدروفيليك موجودة في واجهة تجميع تاو. ومع ذلك، تاو المجاميع كفاءة عند التركيزات الفسيولوجية عندما تستخدم الحمام مثل الهيبارين16 أو17،بوليانيونس أخرى18 .

الجهود السابقة لإعداد في المختبر فحوصات التجميع تاو قد يلقي بعض الضوء على تفاصيل misfolding تاو والتجميع، ولكن جاءت قصيرة لمحاكاة ما يعتقد أن حركية التجميع تاو في فيفو . في معظم الحالات، كانت تفتقر إلى حركية التجميع تاو في المرحلة الأولى تأخر المرتبطة مع نويات تاو. وهذا قد يكون نتيجة لاستخدام تركيزات البروتين تاو عالية جداً، وجود المجاميع في البروتين تاو انطلاق الأعمال التحضيرية و/أو استخدام أجزاء تاو مع كثير الميل تجميع أعلى مما تاو كامل طول الفسيولوجية أكثر بروتين19،،من2021،،من2223. وعلاوة على ذلك، لم تتناول الدراسات السابقة بإمكانية تكرار نتائج وجوانب قوة تاو التجميع حركية.

وهنا يصف لنا قوية في المختبر تاو تجميع الإنزيم الذي يحاكي الخصائص الرئيسية البلمرة تعتمد التنو مع مرحلة متخلفة أولية المقابلة إلى نويات تاو تليها مرحلة نمو المتسارع. وعلاوة على ذلك، المجاميع تاو المؤتلف الذي تم إنشاؤه فيبريلار في الطبيعة ولها فاعلية بذر مرتفعة للغاية. المقايسة استنساخه بشدة أيضا بين دفعات تاو ويمثل أداة قيمة الشاشة لمثبطات التجميع.

Protocol

1-كاشف إعداد

  1. رد فعل المخزن المؤقت
    1. إعداد رد فعل المخزن المؤقت: 0.5 مم تسيب في برنامج تلفزيوني، pH 6.7 بتذويب مسحوق جاف تسيب (MW = 286.65 g/mol) في حل ببستوك، ودرجة الحموضة 7.4.
      ملاحظة: وجود تسيب سبب سد دراسات التجميع باستخدام نوع البرية تاو البروتين الذي يحتوي على سيستينيس. وفي البروتوكول الحالي، يستخدم فقط لضبط الأس الهيدروجيني لبرنامج تلفزيوني من 7.4 إلى 6.7 تسيب ولا تلعب أي دور في تنظيم أي تفاعلات الأكسدة والاختزال.
    2. مزيج دقيق وتصفية الحل من خلال مرشح غشاء عقيمة 0.22 ميكرومتر المسامية حجم الدائرة.
    3. قاسمة ومخزن في ˚C-80.
    4. ذوبان الجليد على مقاعد البدلاء ويستقر عند RT قبل الاستخدام.
  2. huTau441
    1. إزالة huTau441 (للبروتين، انظر التعبير وتنقية أبيتري et al. 24) من-80 ˚C المجمد.
    2. ذوبان الجليد على مقاعد البدلاء وحجته إلى درجة حرارة الغرفة (RT).
    3. تدور أنبوب مع مخزون البروتين لمدة 5 دقائق في 12,000 س ز في ˚C 20-25 للقضاء على فقاعات الهواء.
    4. قياس تركيز امتصاص huTau441by في 280 نانومتر باستخدام معامل انقراض مل 0.31 ملغم-1سم-1
  3. تي ثيوفلافين
    1. إعداد 500 ميكرومتر الأسهم ثيوفلافين تي (تي إتش تي) الحل بتذويب 10 ملغ مسحوق جاف تي إتش تي (MW = 318.86 g/mol) في 35 مل رد فعل المخزن المؤقت.
    2. مزيج دقيق، دوامة 3 مرات لمدة 20 ثانية بأقصى سرعة ممكنة وتصفية الحل من خلال عقيمة 0.22 ميكرومتر المسامية حجم الدائرة العامة غشاء مرشح.
    3. تحديد تركيز بقياسات الاستيعاب في 411 استخدام معامل انقراض م 22,000-1 سم-1 نانومتر وضبط تركيز تي إتش تي إلى 500 ميكرومتر. تخزين في الرايت محمية من الضوء. إعداد جديدة كل شهرين.
  4. الهيبارين
    1. إعداد الحل الهيبارين ميكرومترات 55 الطازجة بإذابة 1 ملغ مسحوق جاف الهيبارين حمو (MW = كاتشين 17-19) في 1 مل رد فعل المخزن في الرايت
    2. اهتز بشدة ودوامه 2 مرات لمدة 5 ثوان.
    3. تصفية الحل من خلال عقيمة ميكرومترات 0.20 مسام حجم الدائرة العامة غشاء مرشح (المحاقن).

2-مواصلة وضع تي إتش تي تجميع المقايسة على قارئ الميكروسكوبية الوضع المتعدد

ملاحظة: يتم إضافة صبغة تي إتش تي لرد الفعل على رصد حركية تجميع huTau441 في وضع مستمر (القياسات التلقائية). على الرغم من أن رد فعل يمكن أن تتبعها فلوروميتير عادية باستخدام ومبومو تقليدية، الطابع اليدوي للعملية يحد من تكرار القياسات وينال من دقة منحنيات الحركية المسجلة. ولهذا السبب، يستخدم قارئ تلقائي وضع متعدد ميكروسكوبية.

  1. قم بإعداد الصك
    1. قم بتشغيل الكمبيوتر والقارئ الميكروسكوبية وضع متعددة. واسمحوا معدات استقرار لمدة 10 دقائق.
    2. بدء تشغيل البرنامج وإعداد بروتوكول.
      1. قم بتحديد نوع البروتوكول: بروتوكول قياسي (يتم الحد من البيانات بشكل مستقل لكل لوحة).
      2. ضبط درجة حرارة في 37 ˚C وحدد بريهيتمينت قبل المتابعة في البروتوكول.
      3. تعيين تشغيل الحركية: تشغيل الوقت ح 50/قياس الفاصل الزمني: 15 دقيقة.
      4. تعيين المداري تهتز في ظهور 425 (3 مم) في وضع مستمر.
      5. حدد أسلوب القراءة: Fluorescence الكثافة--نقطة النهاية/الحركية-"مونوتشروماتورس أطوال موجية": الإثارة 440 نانومتر (نانومتر 20 عرض النطاق الترددي)/الانبعاثات 485 نانومتر (20 نانومتر عرض النطاق الترددي)-ضع البصريات: أعلى-عادي قراءة السرعة-قراءة الارتفاع: مم 4.50
      6. بدء تشغيل باستخدام البروتوكول الذي تم إنشاؤه. اسم التجربة، وحدد وجهة الملف الذي تم إنشاؤه حديثا والسماح للصك حجته مسبقاً إلى درجة الحرارة المطلوبة.
  2. التحويل huTau441 عفوية
    1. إعداد نموذج رد الفعل في أنبوب 1.5 مل. استخدام 200 ميكروليتر ميكس كل رد فعل و replicates على الأقل 4 (يتطابق حجم رد فعل ل 4 = 800 ميكروليتر).
    2. إعداد ميكروليتر 800 رد فعل العينة (في حالة 4 replicates) التي تحتوي على 15 ميكرو huTau441، 8 ميكرومتر الهيبارين و 50 ميكرومتر إضافة الهيبارين وتي إتش تي تي إتش تي. ابدأ بخلط البروتين مع رد فعل المخزن المؤقت، ومزيج جيد من قبل بيبيتينج صعودا وهبوطاً 5 مرات. احترام الترتيب الموضح لإضافة كاشف.
    3. تدور العينات في 12,000 س ز و ˚C 25 لمدة 5 دقائق للقضاء على فقاعات الهواء.
    4. الاستغناء عن 200 ميكروليتر من عينة رد فعل كل بئر في ميكروبلاتيس 96-جيدا (ميكروسكوبية الصلبة السوداء 96، حسنا، ميكروليتر جيدا-حجم 360، مسطحة القاع). تجنب تكوين فقاعات الهواء.
    5. ختم الميكروسكوبية لتجنب التبخر.
    6. ضع الميكروسكوبية في القارئ الميكروسكوبية المتعدد وضع وبدء القياسات.
    7. وبعد انتهاء تجربة، إزالة لوحة من المعدات وتصدير البيانات إلى برنامج معالجة البيانات.
  3. فحص الجودة للتحويل، وجمع البذور وتخزينها.
    1. إزالة السدادة من اللوحة وتجمع replicates مختلفة في أنابيب 1.5 مل. مزيج جيد من العينة الإجمالية في الآبار التي بيبيتينج 2 مرات صعودا وهبوطاً أمام جمع. مجاميع تميل إلى إيداع في أسفل البئر.
    2. مزيج دقيق في مل 1.5 أنبوب من بيبيتينج صعودا وهبوطاً 5 مرات والاستغناء عن 10-20 ميكروليتر على سطح ميكا لتحليل المجاميع حسب فؤاد (للاطلاع على مزيد من التفاصيل، انظر أبيتري et al. 24).
    3. الحصاد في المجاميع بالغزل أنبوب 1.5 مل 000 20 شخص × ز و 4 ˚C لمدة ساعة واحدة. مجاميع النموذج بيليه.
    4. فصل وتحليل المادة طافية من S-مالس للتأكد من عدم وجود تاو أحادي في العينة التي تشير إلى تحويل ناجح في المجاميع (لمزيد من التفاصيل، انظر أبيتري et al. 24).
    5. قم بتسمية الأنبوب 1.5 مل تحتوي على مجاميع المتبقية (بيليه) التي تشير إلى تركيز البروتين huTau441 الأولية وحجم العينة. تجميد المجاميع المفاجئة وتخزينها في ˚C-80.
  4. رد فعل المصنف
    1. إزالة المجاميع huTau441 من الثلاجة ˚C-80. إضافة حجم المخزن المؤقت لرد الفعل المشار إليه على التسمية (حجم العينة الأولى) وترك الأنبوب استقرار إلى "الرايت ريسوسبيند" المجاميع التي بيبيتينج صعودا وهبوطاً 5 إلى 8 مرات.
    2. Sonicate العينة المجمعة. عينة 200 ميكروليتر (15 ميكرو huTau441)، sonicate على الجليد باستخدام ميكروتيب 1/8 "(من 100 ميكروليتر يصل إلى 10 مل) لفترة مجموعها 15 s باستخدام نبضات ق 1 وتوقف 2 s بسعة 30% (سونيكاتور 250 وات). نموذج إعادة حجته إلى الرايت
      ملاحظة: شروط sonication العاملين يؤدي إلى عدد سكانها ييفات تاو متجانسة مع أطوال من 20-50 نانومتر24.
    3. إعداد نموذج رد الفعل في أنابيب 1.5 مل. استخدام 200 ميكروليتر ميكس كل رد فعل و replicates على الأقل 4 (يتطابق حجم رد فعل ل 4 = 800 ميكروليتر).
    4. إعداد 800 ميكروليتر رد فعل عينة تحتوي على 15 ميكرو huTau441، 8 ميكرومتر الهيبارين و 50 ميكرومتر إضافة الهيبارين وتي إتش تي تي إتش تي. ابدأ بخلط البروتين مع رد فعل المخزن المؤقت، ومزيج جيد من قبل بيبيتينج صعودا وهبوطاً 5 مرات. احترام الترتيب الموضح لإضافة كاشف.
    5. تدور العينات في 12,000 س ز و ˚C 25 لمدة 5 دقائق للقضاء على فقاعات الهواء.
    6. الاستغناء عن 200 ميكروليتر من عينة رد فعل كل بئر في 96-جيدا (ميكروسكوبية الصلبة السوداء 96، حسنا، ميكروليتر جيدا-حجم 360، مسطحة القاع). تجنب تكوين فقاعات الهواء.
    7. مجانسة دقة العينة فيبريل بريفورميد المتكررة من أعلى وأسفل بيبيتينج (5 مرات) وإضافة إلى المبلغ المقابل للنسبة المئوية المطلوبة من بذور كل جيدا. لوحدة تخزين جيدا إجمالي 200 ميكروليتر، هو 2 ميكروليتر من البذور بريفورميد بالإضافة 1% (v/v). مزيج من بيبيتينج صعودا وهبوطاً 3 مرات عند إضافة إلى البئر وتجنب تكوين فقاعات الهواء.
    8. ختم الميكروسكوبية لتجنب التبخر.
    9. ضع الميكروسكوبية في القارئ الميكروسكوبية المتعدد وضع وبدء القياسات.
    10. إزالة لوحة من المعدات وتصدير البيانات إلى جدول بيانات.

النتائج

HuTau441 التوليفية التي تحتوي على الطفرات C291A و C322A والطرفي ن كان أعرب له والمحطة الطرفية ج ج-العلامات وتنقيتها كما سبق وصف24. دفعات huTau441 نقية جداً كتصور في الحزب الديمقراطي الصربي صفحة وتقريبا 100% أحادي كما يقيمها S-مالس (الشكل 1). حملت تجميع 15 ميكرون huTau441 بإضافة 8 ميكرومتر حمو الهيبارين ورد فعل أعقب باستمرار الأسفار تي إتش تي باستخدام قارئ ميكروسكوبية المتعدد. الطول الموجي الإثارة كان 440 نانومتر (عرض النطاق الترددي 20 nm) في حين تم قياس الانبعاثات في 485 نانومتر (عرض النطاق الترددي 20 nm). المقايسة يتم استنساخه بدرجة عالية، مع النتائج من 10 آبار الفردية التي لا يمكن تمييزها تقريبا (الشكل 2A). تم تقييم مورفولوجيس للمجاميع الإيجابية huTau441 تي إتش تي بعد ح 50 قبل فؤاد. Hutau441 المجمعة من خليط متجانس من هياكل فيبريلار ذات أطوال مختلفة مشابهة للإبلاغ عن السابقين فيفو مورفولوجيس (الشكل 2). وعلاوة على ذلك، لا يحتوي المخلوط الرد النهائي على مونومر، مما يوحي تحويل كامل إلى المجاميع كما يتضح من قياسات مالس S (الشكل 2). الحركية تجميع huTau441 في تشغيل تجريبي المستقلة متشابهة جداً كما أكد منحنيات سيجمويدال مماثلة ومراحل متخلفة والنمو لا يمكن تمييزها (الشكل 3). هو الحفاظ على المستوى العالي في إمكانية تكرار نتائج عندما يتم استخدام مجموعات مختلفة من البروتين (الشكل 4). وعلاوة على ذلك، huTau441 بريفورميد والمجاميع فعالة جداً في تجنيد مونومر تاو، وحفز تشكيل المجاميع تاو حيثياته . كميات منخفضة قدر 0.0025% (v/v) من المجاميع تاو بريفورميد قادرون على تجاوز التنو وتوليد الزناد ييفات دي نوفو (الشكل 5).

figure-results-1803
رقم 1: huTau441 المؤتلف أحادي ونقية جداً- A) تقييم النقاء تحت يشوه الأوضاع في جل صحيفة بيانات السلامة-صفحة 4-12% بما في ذلك سلم البروتين معيار الوزن الجزيئي (في كاتشين) (لين 1)؛ تتدفق من الخطوة تنقية تقارب ج-العلامة النهائية (لين 2)؛ كسر أغسل العمود (3 لين)، التيد huTau441 البروتين الذروة، قبل (لين 4) وبعد المخزن المؤقت تبادل (ممر 5)، على التوالي). ب) تحليل S-مالس huTau441. يظهر أن يكون أحادي مع كتلة مولى من كاتشين 51 > 99.9% البروتين ولا تحتوي على أجزاء أو مجموعات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

figure-results-2577
رقم 2: تجميع المؤتلف huTau441 تم استنساخه بدرجة عالية، ويؤدي كمياً للهياكل فيبريلار. A) حركية الهيبارين الناجمة عن تجميع huTau441 يراقبها باستمرار في 96 الميكروسكوبية جيدا شكل الأسفار تي إتش تي. تركيزات huTau441 والهيبارين هي 15 ميكرون و 8 ميكرومتر، على التوالي. منحنيات الفردية 10 تتوافق مع التحويل لنفس الدفعة البروتين في عشرة آبار الميكروسكوبية نفسه وتتميز بمرحلة تأخر متوسط (بالتنمية المستدامة) من 14.2 ± ح 0.38 و t50 ± 18.8 0.40 h. البيانات الحركية كانت مزودة لوجيستي 5-معلمة ج المنحنى مع انخفاض خطي في الخط المقارب العلوي. تأخر مرحلة و t50 حسبت بالتداخل بين القيم المتوقعة بالانحدار الخطي. مرحلة انتقالية يحسب على أساس الزيادة 3% من الإشارات الأسفار تي إتش تي. المنحنى المناسب وموجز إحصاءات يتم الحصول عليها باستخدام أي بي أم الإحصائي للعلوم الاجتماعية الإحصاءات الإصدار 20.0.0.2. ب)-إظهار المجاميع تاو مورفولوجيس مثل هوكي كما هو مبين بتصوير فؤاد في ح 50؛ ج). تحليل أحادي huTau441 مالس S (t = 0 ح) والمادة طافية في خليط رد الفعل عند الانتهاء من رد فعل (t = ح 50). في النقطة الزمنية ح 50 كان فصل الخليط رد فعل ح 1 000 20 شخص × ز و 4 ˚C والمادة طافية أدى حقن في S-مالس. ويؤكد اختفاء ذروة مونومر تجميع كاملة من تاو. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

figure-results-4021
الشكل 3: مقايسة التجميع تاو يبين إمكانية تكرار نتائج عالية بين تشغيلات تجريبية مستقلة. عرض الفريقان أربعة آثار حركية فردية لتجميع huTau441 العفوية التي جمعت في تجربتين مستقلة باستخدام نفس الدفعة من البروتين huTau441. تركيزات huTau441 والهيبارين هي 15 ميكرون و 8 ميكرومتر، على التوالي. حركية تتميز بمرحلة تأخر متوسط (بالتنمية المستدامة) من 12.2 ± 0.18 ح و ر50 من 17.8 ± 0.8 ح (تشغيل 1) و 11.6 ± 0,52 ح و تي50 من 17.8 ± ح 0.23 (تشغيل 2)، على التوالي. كانت مزودة البيانات الحركية مع منحنى سوقي 5-المعلمة مع انخفاض خطي في الخط المقارب العلوي. تي50 حسبت بالتداخل بين القيم المتوقعة بالانحدار الخطي. مرحلة انتقالية يحسب على أساس الزيادة 3% من الإشارات الأسفار تي إتش تي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

figure-results-5022
الشكل 4: مقايسة التجميع تاو يبين إمكانية تكرار نتائج عالية بين مجموعات مختلفة من البروتين huTau441. ويبين كل فريق أربعة يتطابق المقابلة لدفعة huTau441 محددة. وأعقب بتجميع كل دفعة في تجارب مستقلة. تركيزات huTau441 والهيبارين هي 15 ميكرون و 8 ميكرومتر، على التوالي. تجميع حركية تناظر تاو الفردية أربع دفعات تتميز بمرحلة تأخر متوسط (بالتنمية المستدامة) من 15.3 ± ح 0.38 و تي50 من 21.1 ± 0.46 ح (المجموعة 1)؛ المرحلة الفاصلة 12.5 ± 0.07 ح و ر50 من 19.8 ± ح 0.34 (المجموعة 2)؛ متخلفة عن المرحلة من 15.1 ± ح 0.34 و تي50 ± 21.9 ح 0.86 (المجموعة 3) وتأخر المرحلة من 11.5 ± ح 0.29 و تي50 من 17.8 ± ح 0.29 (دفعة 4)، على التوالي. كانت مزودة البيانات الحركية مع منحنى سوقي 5-المعلمة مع انخفاض خطي في الخط المقارب العلوي. تأخر مرحلة و t50 حسبت بالتداخل بين القيم المتوقعة بالانحدار الخطي. مرحلة انتقالية يحسب على أساس الزيادة 3% من الإشارات الأسفار تي إتش تي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

figure-results-6227
الرقم 5: المجاميع hutau441 بريفورميد قد بذر عالية النشاط. للشروع في زرع البذور، أضيفت المجاميع تاو سونيكاتيد إلى hutau441 مونومر. من اللون الأحمر إلى اللون الأزرق، يمثل كل لون منحنيات الحركية المختلفة مقدار مختلفة من البذور وأضاف: 1.25% 0.63 في المائة و 0.31 في المائة، 0.16 في المائة، 0.08 في المائة، 0.04%، 0.02 في المائة، 0.01 ٪، 0.005 في المائة و 0.0025% (v/v)، على التوالي. يتم تمثيل التحويل التلقائي من hutau441 باللون الأسود. تم اختبار كافة الشروط في البيلوروسية. Replicates الحركية الأربعة المرتبطة بتركيز معين من البذور يتم استنساخه بدرجة عالية، وفي معظم الحالات لا يمكن تمييزها. تركيزات hutau441 والهيبارين هي 15 ميكرون و 8 ميكرومتر، على التوالي. إضافة كميات صغيرة من قبل تشكيل هياكل فيبريلار سونيكاتيد يلغي المرحلة الفاصلة الأولى لوحظ في تحويل عفوية والأثر غير متناسب مع كمية بذور. من اللون الأحمر إلى اللون الأزرق، الفرق في تي50 لاحظ (50 تي تي spont.conv البذر50 ) 18.9، 18.40، 17.8، 17.3، 16.6، 16.1، 15.4، 14.7، 14.2 و 13.7 ساعة، على التوالي. التحويل التلقائي ل hutau441 يتسم تي متوسط50 (بالتنمية المستدامة) من 19.85 ± h. 0.54 البيانات الحركية كانت مزودة بمنحنى سوقي 5-المعلمة مع انخفاض خطي في الخط المقارب العلوي. تي50 حسبت بالتداخل بين القيم المتوقعة بالانحدار الخطي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Discussion

وعلى الرغم من الجهود العديدة، أفادت حركية التجميع تاو في الأدب التاريخ الافتقار إلى المستوى المطلوب في إمكانية تكرار نتائج و/أو بعض الميزات من نويات البلمرة تعتمد19،،من2021 , 22 , 23 , 25-وهذا كثيرا ما شددت على عدم وجود مرحلة انتقالية وبذر عدم كفاءة والطبيعة غير فيبريلار تاو المجاميع. وسبب هذه العيوب يمكن أن تختلف، ويشمل تاو دون المستوى الأمثل نوعية البروتين (التجزؤ، وجود المجاميع، ونقاء منخفضة، إلخ.)، اختيار البروتين وحمل الكواشف واو الظروف التجريبية. عامل تعقيد آخر بقايا سيستين اثنين تقع حول واجهة تجميع تاو التي يمكن أن تشكل داخل أو جملة-ثنائي كبريتيد الجزيئية الجسور تبعاً للبيئة الأكسدة ويؤثر على كفاءة التجميع تاو. في معظم نهج الحد من الكواشف مثل DTT أو تسيب استخدمت للحفاظ على بقايا سيستين في أشكال أقل وبالتالي زيادة مستويات من إمكانية تكرار نتائج25. وعلاوة على ذلك، معامل الانقراض تاو منخفضة جداً مما يؤدي إلى صعوبات في قياسات دقيقة لتركيز البروتين.

نحن تركز خصوصا على عدد قليل من المعلمات والسمات النوعية التي نحن تعتبر حاسمة بالنسبة لملف تجميع قوية واستنساخه والممثل للبروتين تاو: القضاء على إمكانية داخلها-وجملة-تشكيل ثنائي كبريتيد الجزيئية، توليد من مونومر تاو نقية جداً وتحسين دقة تحديد تركيز. كل كاشف هذه المتصلة بمسائل هي نقاط الاهتمام المحتملة التي نحن تعتبر حاسمة بالنسبة للتنمية المثلى بالانزيم. وأعرب huTau441 طول كامل لمعالجة هذه القضايا، مع الطفرات اثنين، C291A، و C322A، والعلامات الطرفي ن وج. طفرة مخلفات سيستين له الحد الأدنى من التأثير على البروتين تاو حين القضاء على خلاف ذلك الصعوبة بمكان السيطرة على سد ثنائي كبريتيد. التعبير عن البروتين مع العلامات الطرفي ن وج قصيرة نسبيا سمح لنا بمتابعة بروتوكول تنقية تقارب خطوتين مما أدى إلى درجة نقاء عالية جداً، والسلامة ومركب المحتوى. وعلاوة على ذلك، قدمنا طفرة F8W زاد معامل الانقراض من البروتين، ويسمح بتركيز أكثر دقة القياسات24.

بالإضافة إلى استخدام كواشف جودة عالية البروتين، كانت أيضا الأمثل المعلمات مقايسة الأخرى. تاو الأمثل: تم تحديد نسبة الهيبارين حوالي 0.5 (M/M) وما يتماشى مع الدراسات المنشورة سابقا26. وعلاوة على ذلك، الإعدادات الآلي الميكانيكية والبصرية حاسمة لضمان إمكانية تكرار نتائج والمعلمات الأمثل قد تختلف إلى حد ما حسب الشركة المصنعة.

تجميع تاو الموصوفة في هذا التحليل يبين الخصائص التي ترتبط مع تاو المرضية في الإعلان والمتعلقة تاوباثيس. العملية تبدأ بمرحلة تأخر أولية المقابلة لتشكيل نواة ذات الطاقة العالية وتبعتها مرحلة نمو سريع الذي يتوافق مع النمو فيبريل. وقت تأخير طويلة بما يكفي لفتح نافذة واسعة للدراسة بالتفصيل عملية البذر تغطي طائفة واسعة من البذور تركيزات (الشكل 5) في حين لا يزال ليس وقتاً طويلاً حتى يتم تفادي تدهور البروتين و/أو التجميع غير محددة (الشكل 2). يمكن أن يحدث هذه الأحداث الثانوية وبخاصة عندما يتعرض بروتين اضطرابه ارتباطاً وثيقا مثل huTau441 لفترات طويلة من الوقت للظروف الفسيولوجية. عرض المجاميع تاو حصل على مورفولوجية ففس معزولة عن أدمغة المرضى الإعلانية، وهي فعالة جداً في توظيف تاو أحادي وتحويله إلى حيثياته إنشاء المجاميع، هي عملية يشار إليها كالبذر. المقايسة يتم استنساخه بدرجة عالية، المنحنيات الحركية التي لا يمكن تمييزها تقريبا بين الآبار وتشغيل تجريبي ودفعات البروتين. على الرغم من أن الفحص الحالي يركز فقط على isoform تاو أطول، huTau441، التطبيق يمكن تكييفها لدراسة تحويل أشكال أخرى من تاو (أمييجدي et al., Acta نيوروباثولوجيكا الاتصالات، في الصحافة) علاوة على ذلك، فإنه تمكن الدراسات الميكانيكية تركز على التفاعل بين إيسوفورمس تاو وربما يلقي الضوء على الاختلافات بين تاو المرضية في الإعلان حيث isoforms 3R و 4R موجودة في ففس وانتقاء للمرض أو العته فرونتوتيمبورال حيث يحتوي على أمراض تاو أساسا 3R و 4R تاو isoforms، على التوالي27.

إمكانية تكرار نتائج عالية جداً للمقايسة ينبغي السماح للقراء بتنفيذ ذلك بسهولة نسبية في إعداداتها معمل محددة. المقايسة يحاكي ما يعتقد أن في فيفو ميسفولدينج وتجميع تاو، تمكين الدراسات الميكانيكية التي سوف تسلط الضوء على تاو المرضية وأنه يشكل أداة قيمة لفرز المرشحين المخدرات وتقييم تدخلها مع الخطوات المختلفة لعملية المرضية.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

الكتاب يود أن يشكر "هيكتور كويرانتي" للتعبير وتنقية huTau441، Inganäs حنا ومارغو van فينسن للدعم الفني الممتاز ومارتن كولديجك لتحليل البيانات.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Thioflavin TSigma-AldrichT3516-5Gdry powder (Mw = 318.86 g/mol)
Heparin Sigma-AldrichH3393-50KUdry powder (Mw = 17-19 kDa)
TCEPSigma-Aldrich75259-1Gdry powder (MW= 286.65 g/mol)
PBSGibco-Life Technologies10010-015Sterile, pH 7.4 (1X)
0.22 μm sterile filterCorning431160PES membrane 
0.20 μm sterile serynge filterCorning431229PES membrane 
96-well microplatesThermo Scientific9502867Black, flat botton
Microplate sealers R&D SystemsDY992Adhesive strips 
Synergy Neo2 Multi-Mode Microplate Reader BiotekSynergy Neo2Hybrid Technology, Gen5 Software
Eppendorf TubesEppendorf 0030 120.0861,5 ml tubes
Ultrasonics-Branson SFX250Branson101-063-966R1/2" Solid Horn and 1/8" microtip 

References

  1. Querfurth, H. W., LaFerla, F. M. Alzheimer's disease. The New England Journal of Medicine. 362 (4), 329-344 (2010).
  2. Lee, V. M., Goedert, M., Trojanowski, J. Q. Neurodegenerative tauopathies. Annual Review of Neuroscience. 24, 1121-1159 (2001).
  3. Goedert, M., Wischik, C. M., Crowther, R. A., Walker, J. E., Klug, A. Cloning and sequencing of the cDNA encoding a core protein of the paired helical filament of Alzheimer disease: identification as the microtubule-associated protein tau. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (11), 4051-4055 (1988).
  4. Himmler, A., Drechsel, D., Kirschner, M. W., Martin, D. W. Tau consists of a set of proteins with repeated C-terminal microtubule-binding domains and variable N-terminal domains. Molecular and Cellular Biology. 9 (4), 1381-1388 (1989).
  5. Mandelkow, E., von Bergen, M., Biernat, J., Mandelkow, E. M. Structural principles of tau and the paired helical filaments of Alzheimer's disease. Brain Pathology. 17 (1), 83-90 (2007).
  6. Lee, V. M., Balin, B. J., Otvos, L., Trojanowski, J. Q. A68: a major subunit of paired helical filaments and derivatized forms of normal Tau. Science. 251 (4994), 675-678 (1991).
  7. Wischik, C. M., Harrington, C. R., Storey, J. M. Tau-aggregation inhibitor therapy for Alzheimer's disease. Biochemical Pharmacology. 88 (4), 529-539 (2014).
  8. Pickhardt, M., et al. Identification of Small Molecule Inhibitors of Tau Aggregation by Targeting Monomeric Tau As a Potential Therapeutic Approach for Tauopathies. Current Alzheimer Research. 12 (9), 814-828 (2015).
  9. Paranjape, S. R., et al. Azaphilones inhibit tau aggregation and dissolve tau aggregates in vitro. ACS Chemical Neuroscience. 6 (5), 751-760 (2015).
  10. Seidler, P. M., et al. Structure-based inhibitors of tau aggregation. Nature Chemistry. 10 (2), 170-176 (2018).
  11. Apetri, A. C., Vanik, D. L., Surewicz, W. K. Polymorphism at residue 129 modulates the conformational conversion of the D178N variant of human prion protein 90-231. Biochemistry. 44 (48), 15880-15888 (2005).
  12. Crespo, R., Rocha, F. A., Damas, A. M., Martins, P. M. A generic crystallization-like model that describes the kinetics of amyloid fibril formation. Journal of Biological Chemistry. 287 (36), 30585-30594 (2012).
  13. Holmes, B. B., et al. Proteopathic tau seeding predicts tauopathy in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (41), E4376-E4385 (2014).
  14. Surewicz, W. K., Jones, E. M., Apetri, A. C. The emerging principles of mammalian prion propagation and transmissibility barriers: Insight from studies in vitro. Accounts of Chemical Research. 39 (9), 654-662 (2006).
  15. Jeganathan, S., von Bergen, M., Mandelkow, E. M., Mandelkow, E. The natively unfolded character of tau and its aggregation to Alzheimer-like paired helical filaments. Biochemistry. 47 (40), 10526-10539 (2008).
  16. Goedert, M., et al. Assembly of microtubule-associated protein tau into Alzheimer-like filaments induced by sulphated glycosaminoglycans. Nature. 383 (6600), 550-553 (1996).
  17. Kampers, T., Friedhoff, P., Biernat, J., Mandelkow, E. M., Mandelkow, E. RNA stimulates aggregation of microtubule-associated protein tau into Alzheimer-like paired helical filaments. FEBS Letters. 399 (3), 344-349 (1996).
  18. Wilson, D. M., Binder, L. I. Free fatty acids stimulate the polymerization of tau and amyloid beta peptides. In vitro evidence for a common effector of pathogenesis in Alzheimer's disease. American Journal of Pathology. 150 (6), 2181-2195 (1997).
  19. Barghorn, S., Mandelkow, E. Toward a unified scheme for the aggregation of tau into Alzheimer paired helical filaments. Biochemistry. 41 (50), 14885-14896 (2002).
  20. Friedhoff, P., Schneider, A., Mandelkow, E. M., Mandelkow, E. Rapid assembly of Alzheimer-like paired helical filaments from microtubule-associated protein tau monitored by fluorescence in solution. Biochemistry. 37 (28), 10223-10230 (1998).
  21. Morozova, O. A., March, Z. M., Robinson, A. S., Colby, D. W. Conformational features of tau fibrils from Alzheimer's disease brain are faithfully propagated by unmodified recombinant protein. Biochemistry. 52 (40), 6960-6967 (2013).
  22. Ramachandran, G., Udgaonkar, J. B. Mechanistic studies unravel the complexity inherent in tau aggregation leading to Alzheimer's disease and the tauopathies. Biochemistry. 52 (24), 4107-4126 (2013).
  23. Sui, D., Liu, M., Kuo, M. H. In vitro aggregation assays using hyperphosphorylated tau protein. Journal of Visualized Experiments. (95), e51537 (2015).
  24. Apetri, A., et al. A common antigenic motif recognized by naturally occurring human VH5-51/VL4-1 anti-tau antibodies with distinct functionalities. Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 43 (2018).
  25. Barghorn, S., Biernat, J., Mandelkow, E. Purification of recombinant tau protein and preparation of Alzheimer-paired helical filaments in vitro. Methods Mol Biol. 299, 35-51 (2005).
  26. Zhu, H. L., et al. Quantitative characterization of heparin binding to Tau protein: implication for inducer-mediated Tau filament formation. Journal of Biological Chemistry. 285 (6), 3592-3599 (2010).
  27. Buee, L., Delacourte, A. Comparative biochemistry of tau in progressive supranuclear palsy, corticobasal degeneration, FTDP-17 and Pick's disease. Brain Pathology. 9 (4), 681-693 (1999).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

141

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved