JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

محددة مستضد خلايا تي من الصعب أن تميز أو تستخدم في العلاج بسبب هذه الغاية منخفضة التردد. هنا، نحن نقدم بروتوكول لتطوير جسيمات مغناطيسية التي يمكن ربط محددة مستضد خلايا تي لإثراء هذه الخلايا ومن ثم توسيعها عدة عف لتوصيف والعلاج على حد سواء.

Abstract

قمنا بتطوير أداة لكل من إثراء وتوسيع نطاق خلايا تي حدة مستضد. وهذا يمكن أن يكون مفيداً في حالات مثل A) الكشف عن وجود خلايا تي مستضد على حدة، ب) التحقيق في ديناميات استجابات محددة مستضد، ج) فهم كيف تؤثر ردود محددة مستضد على حالة المرض مثل المناعة الذاتية، د) الغموض غير متجانسة استخدام استجابات محددة مستضد خلايا تي، أو ه) محددة مستضد الخلايا للعلاج. الأداة تستند جسيمات مغناطيسية نحن متزاوجة مستضد على حدة وإشارات الخلية تي كوستيمولاتوري، ونحن المدى مصطنعة مستضد تقديم الخلايا (آبكس). ونتيجة لذلك، ولما بسيطة لإنتاج التكنولوجيا، يمكن بسهولة يتم اعتماده بمختبرات أخرى؛ وهكذا، هدفنا هنا لوصف بالتفصيل بتصنيع واستخدام اللاحقة آبكس. نشرح كيفية إرفاق إشارات محددة مستضد وكوستيمولاتوري آبكس وكيفية الاستفادة منها لإثراء لخلايا تي حدة مستضد وكيفية توسيع نطاق خلايا محددة مستضد تي. وعلاوة على ذلك، سوف نسلط الضوء التصميم الهندسي الاعتبارات استناداً إلى المعلومات التجريبية والبيولوجية من تجربتنا مع تميز خلايا تي محددة مستضد.

Introduction

مع ظهور العديد من إيمونوثيرابيس، هناك حاجة لتكون قادرة على توصيف والتحكم في الاستجابات المناعية. على وجه الخصوص، الاستجابة المناعية التكيفية للفائدة بسبب خصوصية ومتانة الخلايا. في الآونة الأخيرة، تمت الموافقة على العلاج خلايا تي مستقبلات مستضد تشيميريك لعلاج السرطان؛ ومع ذلك، تستند المستضد-المستقبلات قبالة المشتركة الخلية السطحي antigen CD19، بدلاً من مولدات المضادات الخاصة ب السرطان1. تتجاوز الخصوصية، يمكن إيمونوثيرابيس تعاني أيضا من عدم وجود مراقبة، وفهم الاستجابة المناعية الحيوية داخل السرطان أو المناعة الذاتية المحدودة.

يتمثل أحد التحديات دراسة استجابات محددة مستضد تلك الغاية منخفضة التردد، على سبيل المثال.، محددة مستضد خلايا تي هي 1 من كل 104 إلى6 ر 10 خلايا2،3. وهكذا، للتحقيق في أي تي الخلايا موجودة أو الاستجابة، الخلايا تحتاج إلى أما إثراء وتوسيع، أو الإشارة بحاجة إلى تفصيل. أنها مكلفة وصعبة للحفاظ على تغذية الخلايا باستخدام التقنيات الحالية التي تركز على توسيع نطاق خلايا محددة مستضد. التقنيات الحالية التي تركز على تضخيم إشارة محددة مستضد تي الخلايا، مثل الاعتداء إيمونوسبوت المرتبط بالانزيم (السبت)، والحد من إعادة استخدام تلك الخلايا تي4. أخيرا، بسبب حساسية منخفضة، غالباً ما هذه التقنيات اثنين تحتاج إلى تكون مجتمعة لتعداد محددة مستضد.

لمعالجة هذه القضايا، وقد وضعنا مستضد الاصطناعي المغناطيسي على أساس نانوحبيبات عرض الخلية (آبك)5،6،7،8. يمكن فونكتيوناليزيد آبك مع مجمع محددة مستضد إشارة هضميد تحميل histocompatibility رئيسية (الرهن العقاري)-وجزيئات كوستيمولاتوري-مثلاً.، جسم CD28 مكافحة-على حد سواء إثراء محددة مستضد خلايا تي ومن ثم في وقت لاحق حفز التوسع فيها (الشكل 1). وهكذا يمكن الجسيمات منتجات جاهزة فعالة من حيث التكلفة التي يمكن أن يكون على حد سواء تخصيصها لتلبية محددة مستضد التحفيز بعد موحدة عبر التجارب والمرضى. القيام بتخصيب اليورانيوم وتوسيع عملية النتائج في مئات آلاف إضعاف توسيع نطاق خلايا CD8 + "تي" حدة مستضد ويمكن أن ينتج ترددات تصل إلى 60 في المائة بعد أسبوع واحد فقط، يمكن توصيف أو الاستخدام العلاجي الكبير عدد الخلايا. هنا، ونحن تصف كيفية جعل نانوحبيبات آبكس، بعض اعتبارات التصميم الحاسم في اختيار خصائص نانوحبيبات، وإظهار بعض النتائج النموذجية عن طريق الاستفادة من هذه الجسيمات في عزل وتوسيع نطاق خلايا CD8 + "تي" محددة مستضد نادرة.

Protocol

وأبقى على جميع الفئران كل المبادئ التوجيهية التي أقرها "مجلس المراجعة المؤسسية" جامعة جونز هوبكنز.

1. تحميل الكبرى Dimeric Histocompatibility مجمع الغلوبولين المناعي الانصهار البروتين (MHC-Ig) مع تسلسل الببتيد مستضد المرجوة.

ملاحظة: إذا كان استخدام ح 2 كيلو بايت: المفتش العام، ثم اتبع البروتوكول بالتفصيل في "الخطوة 1، 1"؛ في حالة استخدام ح-2Db:Ig، ثم اتبع البروتوكول بالتفصيل في الخطوة 1.2.

  1. نشط تحميل الببتيد تسلسل إلى ح-2 كيلو بايت: المفتش العام.
    1. تجهيز المخازن المؤقتة الضرورية. إعداد المخزن المؤقت تمسخ بجعل حل لكلوريد الصوديوم 150 و 15 ملم Na2CO3 في المياه. وثم تعديل درجة الحموضة إلى 11.5. إعداد المخزن المؤقت ريناتوراتيون بجعل حل من 250 ملم HCl تريس في المياه وضبط درجة الحموضة إلى 6.8.
      ملاحظة: عادة، فإنه سيتطلب حوالي 5 مل من المخازن المؤقتة لكل من تمسخ وريناتوريشن ل 1 مغ من ح-2 كيلو بايت: المفتش العام.
    2. تؤذي ح 2 كيلو بايت: المفتش العام للسماح بتعزيز الببتيد ملزمة. إحضار ح-2Kb: تركيز المفتش العام إلى بين 0.5-2 مغ/مل مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS). ثم تضعف ح-2Kb: المفتش العام لتركيز نهائي من 100-200 ميكروغرام/مل مع 5-10 حجم المخزن المؤقت مكافئات تمسخ والسماح لاحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
    3. إضافة 50 الزائدة المولى من الببتيد تسلسل (عادة ما يتم الاحتفاظ الببتيد الأسهم في 1 مم في-80 درجة مئوية) إلى ح-2 Kb: حل المفتش العام.
      ملاحظة: عادة المستضدات الببتيد سوف تحتاج إلى حل ضمن 10 في المائة على الأقل ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس]) ثم إضافتها ببطء لبرنامج تلفزيوني أن تظل قابلة للذوبان. حسب تسلسل الأحماض الأمينية، قد تحتاج المبلغ [دمس] لزيادة.
    4. ح ريناتوري 2 كيلو بايت: المفتش العام مع الببتيد. فور إضافة الببتيد، تحقيق الحل للرقم الهيدروجيني 7.4 بإضافة ريناتوريشن المخزن المؤقت. تسمح حل معادلتها لاحتضانها ح 48 في 4 درجات مئوية.
    5. التركيز وتغسل محملة الببتيد ح 2 كيلو بايت: Ig-الاستفادة من مركزات الطرد مركزي مع وقف وزن الجزيئي كاتشين 50 (موكو)، اتبع إرشادات الشركة المصنعة يغسل تحميل الببتيد ح 2 كيلو بايت: حل Ig 3 مرات مع برنامج تلفزيوني، تركز على الأقل 1 ملغ/مل والتحديد الكمي للتركيز على جهاز المطياف الضوئي.
  2. تحميل التسلسل الببتيد إلى ح النشطة--2Db:Ig.
    1. تجهيز المخازن المؤقتة الضرورية. إعداد المخزن المؤقت تمسخ بجعل حل لحمض الستريك مم 131، 150 كلوريد الصوديوم، و 124 ملم Na2هبو4 في المياه. وثم تعديل درجة الحموضة إلى 6.5. إعداد المخزن المؤقت ريناتوريشن بجعل حل من عيار 120 ملم HCl تريس في المياه وضبط درجة الحموضة إلى 8.8.
      ملاحظة: بشكل عام، فإنه سيتطلب حوالي 5 مل من المخزن المؤقت تمسخ و 1 مل من المخزن المؤقت ريناتوريشن ل 1 مغ ح-2Db:Ig.
    2. تؤذي ح-2Db:Ig للسماح بتعزيز الببتيد ملزمة. إحضار H-تركيز 2Db:Ig بتركيز نهائي من 0.5-2 مغ/مل مع برنامج تلفزيوني. ثم تضعف H-2Db:Ig بتركيز نهائي من 100-200 ميكروغرام/مل مع 5-10 مكافئات حجم المخزن المؤقت تمسخ.
    3. إضافة 50 الزائدة المولى من الببتيد تسلسل (عادة ما يتم الاحتفاظ الببتيد الأسهم في 1 مم في-80 درجة مئوية) إلى ح-حل 2Db:Ig، والسماح لاحتضانها ح 1 في 37 درجة مئوية.
    4. إضافة β2 microglobulin وريناتوري ح-2Db:Ig مع الببتيد. إضافة إضعاف الزيادة المولى β2 microglobulin. ثم، تحقيق الحل للرقم الهيدروجيني 7.4 بإضافة ريناتوريشن المخزن المؤقت. تسمح حل معادلتها لاحتضانها ح 24 في 4 درجات مئوية.
    5. التركيز ويغسل ح الببتيد-تحميل-2Db:Ig. الاستفادة من مركزات الطرد مركزي مع 50 كاتشين موكو، اتبع إرشادات الشركة المصنعة يغسل تحميل الببتيد ح 2 كيلو بايت: حل Ig 3 مرات مع برنامج تلفزيوني، تركز على الأقل 1 ملغ/مل وتحديدها كمياً التركيز على جهاز المطياف الضوئي.

2-متزاوجة مجمعات MHC-الببتيد وجزيئات كوستيمولاتوري على سطح جسيمات نانوية مغناطيسية لتشكيل مستضد نانوحبيبات الاصطناعية عرض الخلايا. استخدم واحدة من ثلاث طرق مختلفة اعتماداً على حجم الجسيمات، والتطبيق.

ملاحظة: يمكن استخدام عدد من التقنيات المختلفة متزاوجة البروتينات على سطح من الجسيمات. هنا، يتم وصف نهج منفصلة 3: جسيمات المغلفة بأمين (الخطوة 2-1)، ن-هيدروكسيسوكسينيميدي (NHS)-جسيمات المغلفة (2.2 خطوة)، والجسيمات المضادة بيوتين المغلفة (الخطوة 2، 3). كما وصفت هذه العمليات بالتفصيل ضمن المقطع طرق ورقتي المنشورة6،7. تنفيذ كافة الخطوات في غطاء دخان السلامة الأحيائية مع الحلول العقيمة للحفاظ على عقم جسيمات aAPC الأسهم.

  1. معطف إشارات محددة مستضد وحفزا للجسيمات المغناطيسية المغلفة بأمين (الشكل 2). ويرد وصف هذه العملية عن 100 نانومتر، وجسيمات نانوية سوبيرباراماجنيتيك المغلفة بأمين.
    ملاحظة: بروتوكولات مفصلة لإرفاقها الجسم بسطح الجسيمات المغلفة أمين ويمكن الاطلاع على https://www.micromod.de/en/technotes-2.html، حيث يصف Technote 201 كيف إلى ثيولاتي الأجسام المضادة والمتقارن ماليميدي فونكتيوناليزي وتصف الجسيمات و 202 العملية الضرورية للجسيمات المغلفة بأمين مع المجموعات الوظيفية ماليميدي فونكتيوناليزي. هنا، يبرز سوى تعديلات طفيفة للمفتش العام MHC وإشارات كوستيمولاتوري تعلق على هذه الجسيمات.
    1. ثيولاتي الأجسام المضادة مع كاشف تروت (Technote 201).
      1. إعداد 10 × المخزن المؤقت لحمض (يدتا) برنامج تلفزيوني-الإيثيلين (0.1 M برنامج تلفزيوني و 100 ملم يدتا). إضافة 10 × برنامج تلفزيوني-يدتا المخزن المؤقت للأجسام المضادة في 01:10 نسبة لمنع أكسدة ثيولس الحرة إضافة إلى الأجسام المضادة.
      2. إضافة 20 فائض المولى الكاشف تروت (2-إيمينوثيولاني) إلى الجسم واحتضانها ح 2 في درجة حرارة الغرفة مع الاختلاط. قياس كاشف تروت (مسحوق جاف) داخل غطاء الأبخرة كيميائية لتجنب التنفس كما أنه يحول أمين الجماعات إلى جماعات ثيول.
      3. يغسل جيدا مع 1 × برنامج تلفزيوني-يدتا المخزن المؤقت باستخدام 3 مرات مركزات الطرد مركزي مع 50 كاتشين موكو، واتبع إرشادات الشركة المصنعة، تركز حتى وحدة تخزين نهائي من 500 ميليلتر. قياس تركيز استخدام حل جسم جهاز المطياف الضوئي.
    2. تحويل المجموعات الوظيفية أمين على نانوحبيبات المغناطيسي لمجموعات ماليميدي باستخدام سولفوسوكسينيميديل 4-(ن-ماليميدوميثيل) الحلقي-1-كاربوكسيلات (بين الموظفين سالفو، Technote 202).
      1. إضافة 10 × برنامج تلفزيوني-يدتا المخزن المؤقت للأجسام المضادة في 01:10 نسبة للجسيمات.
      2. حل سالفو-بين الموظفين في المياه ودوامه ريسوسبيند بتركيز 1 ملغ/مل. قياس (مسحوق جاف) سالفو-بين الموظفين داخل غطاء الأبخرة كيميائية لتجنب التنفس كما أنه يحول أمين المجموعات إلى مجموعات ماليميدي.
      3. إضافة نمول 0.016 الحل سالفو-بين الموظفين لكل ملليمتر مربعة المساحة السطحية للجسيمات. 1 ملغ الجسيمات 100 نانومتر، استخدام 0.3 ملغ سالفو-بين الموظفين. السماح بالرد على 1.5 ح في درجة حرارة الغرفة.
      4. يغسل مع 1 × المخزن المؤقت برنامج تلفزيوني-يدتا 3 مرات باستخدام حقل مغناطيسي مع عمود مغناطيسي الجسيمات وريسوسبيند في 500 ميليلتر من 1 × برنامج تلفزيوني-يدتا المخزن المؤقت.
        ملاحظة: إذا كان استخدام جسيمات أصغر من 200 نانومتر، مثل الجزيئات nm 100 الموضحة هنا، المغناطيس الدائم على الأرجح لن تكون قوية بما يكفي لسحب الجسيمات للغسيل أو تركيز الأغراض. وهكذا، أن يغسل جسيمات أصغر، استخدام عمود مغناطيسي تتألف من المجالات المغناطيسية لتضخيم المجال المغناطيسي.
    3. تتفاعل جزيئات فونكتيوناليزيد ماليميدي مع الأجسام المضادة ثيولاتيد (Technote 201).
      1. إضافة الجسيمات لقنينة التﻷلؤ زجاج وإضافة شريط إثارة ميني-مغناطيسية، ضع فقط شبر واحد فوق صفيحة إثارة مغناطيسية والحث على خلط المغناطيسي الجسيمات الحل.
      2. حل الاختلاط، إضافة الأجسام المضادة ثيولاتيد (0.5 ملغ من الأجسام المضادة لكل 1 ملغ من الجسيمات) دروبويسي. يسمح بالتفاعل بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة.
      3. يغسل مع المخزن المؤقت لبرنامج تلفزيوني 1 x 3 مرات باستخدام حقل مغناطيسي وريسوسبيند في 500 ميليلتر من برنامج تلفزيوني 1 x. تسمية وتخزينها عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر.
        ملاحظة: يحدث أقصى كفاءة التصريف عند اختلاط الجسيمات فونكتيوناليزيد ماليميدي فورا مع البروتين ثيولاتيد.
  2. معطف إشارات محددة مستضد وحفزا للجسيمات المغناطيسية المغلفة بالمستشفيات العامة (الشكل 3). ويرد وصف هذه العملية ل 200 نانومتر، وجسيمات نانوية سوبيرباراماجنيتيك المغلفة بدائرة الصحة الوطنية.
    1. إعداد المخزن المؤقت لاستثارة ومخزن التبريد، ومخزن المخزن المؤقت. المخزن المؤقت استثارة 25 مم 2-(ن-morpholino) حمض اثانيسولفونيك (MES) مع 0.01 ٪ 20 توين تعديلها لدرجة الحموضة 6.0. المخزن المؤقت التبريد حل 100 مم من تريس-HCl في درجة الحموضة 7.4. المخزن المؤقت التخزين حل 10 مم PBS و 0.01 ٪ توين في درجة الحموضة 7.4.
    2. ريسوسبيند الجسيمات المجففة بالتبريد في 1 مل من استثارة المخزن المؤقت. الدوامة بقوة لمدة 15 دقيقة على الأقل حتى لا المجاميع مرئية.
    3. ضع الجسيمات المغناطيسية على الوقوف مغناطيسي لإزالة المادة طافية، ريسوسبيند مع 0.5 مل من المخزن المؤقت لاستثارة ونقل إلى قنينة زجاج التﻷلؤ. دوامة حتى المجاميع لا تكون مرئية.
    4. إضافة 0.1 مغ من مجموع البروتين 1 مغ جسيمات حراكه. دوامة لخلط والتفاعل في درجة حرارة الغرفة ح 2.5 بينما خلط.
    5. إضافة 0.1 مل من تبريد المخزن المؤقت والتفاعل في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة أثناء الخلط.
    6. ضع القنينة التﻷلؤ على الوقوف مغناطيسية وتغسل الجسيمات. انتظر حتى واضحة لإزالة المادة طافية. إزالة الجسيمات من موقف المغناطيسية، وإضافة 1 مل من المخزن المؤقت لاستثارة ودوامه حتى المجاميع لا تكون مرئية. كرر هذه العملية ثلاث مرات وريسوسبيند الجسيمات في 1 مل من استثارة المخزن المؤقت. تخزين الجسيمات عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر.
  3. معطف إشارات محددة مستضد وحفزا للجسيمات المغناطيسية المضادة بيوتين المغلفة (الشكل 4). ويرد وصف هذه العملية عن 50-100 نانومتر، البيوتين المضادة سوبيرباراماجنيتيك جسيمات نانوية.
    1. بيوتينيلاتي MHC-Ig أو جزيئات كوستيمولاتوري.
      1. ضبط تركيز البروتين إلى 0.5-2 مغ/مل في المخزن المؤقت لبرنامج تلفزيوني. ريسوسبيند سالفو--دائرة الصحة الوطنية--البيوتين بتركيز 10 ملغ/مل في المياه وإضافة برنامج جسم الزائدة تنشيطية المولى. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 45 دقيقة.
      2. يغسل جيدا مع برنامج تلفزيوني 3 مرات باستخدام مركزات الطرد مركزي مع كاتشين 50 موكو، اتبع إرشادات الشركة المصنعة، التركيز حتى وحدة تخزين نهائي من 500 ميليلتر. قياس تركيز الضد الحل باستخدام جهاز المطياف الضوئي.
    2. بيوتينيلاتيد المتقارنة MHC-Ig و/أو إشارات كوستيمولاتوري إلى جسيمات نانوية البيوتين المضادة. 500 ميليلتر من الأسهم البيوتين المضادة الجسيمات، أضف نمول 0.5 من جسم تنشيطية واحتضان في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.
    3. أغسل aAPC مترافق جسيمات نانوية. لأن هذه الجسيمات أقل من 200 نانومتر، الرطب عمود مغناطيسية ووضع على الوقوف مغناطيسية.
    4. أضف تعليق الجسيمات/البروتين للعمود. السماح لجميع البروتينات/الجزيئات تماما إدخال العمود.
    5. أغسل بإضافة 0.5 مل من برنامج تلفزيوني ثلاث مرات للعمود.
    6. الوت بإزالة العمود من موقف المغناطيسية وإضافة 0.5 مل من برنامج تلفزيوني للعمود باستخدام المكبس، اكسبولسي آبكس الجسيمات في قنينة زجاج التﻷلؤ. تخزين الجسيمات عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر.
      ملاحظة: جسيمات مستقرة عند 4 درجة مئوية (ينبغي أن لا تكون مجمدة) لمدة تصل إلى 6 أشهر. ارتفاع درجات الحرارة ينخفض الأداء الوظيفي للجسيمات، وقد لوحظت بعض تجميع الجسيمات (البيانات لا تظهر). لا تبقى في درجة حرارة الغرفة لفترات طويلة من الزمن، وهذا يقلل بشكل ملحوظ في الجرف حياة الجسيمات.

3-تميز محتوى البروتين الاصطناعي مستضد عرض الخلية جسيمات نانوية استخدام الكشف عن جسم الفلورسنت.

ملاحظة: هذا عنصر تحكم نوعية مفيدة من مستضد الاصطناعية المنتجة عرض الخلايا. أيضا، يستخدم مقدار إشارة محفزة لإنتاج جرعة آبك أي ما يعادل عبر دفعات وأنواع آبك مختلفة (على سبيل المثال-، أحجام مختلفة).

  1. قياس تركيز الجسيمات آبكس المغلفة.
    1. استخدام جسيمات unconjugated من الحل الأسهم وجعل معايرة جرعة 1:2 في التوصل إلى حل لبرنامج تلفزيوني عبر صفيحة زراعة الأنسجة مغلوطاً 96-جيدا مع 100 ميليلتر كل بئر.
    2. قراءة الجسيمات في لوحة القراءة جهاز المطياف الضوئي في 405 نانومتر لإنشاء منحنى قياسي من تركيز جسيمات معروفة.
    3. أخذ عينة من آبكس مترافق وتمييع في برنامج تلفزيوني لإجمالي حجم 100 ميليلتر والقراءة جهاز المطياف الضوئي.
  2. إزالة عينة آبكس ملفقة ووصمة عار مع الأجسام المضادة الفلورسنت.
    1. لحساب مقدار عينة لإزالة، وتقدير عدد الأجسام المضادة على سطح الجسيمات.
      ملاحظة: للحصول على هذه التقنيات، تفترض بكثافة من حوالي 1000 الأجسام المضادة/ميكرون2 من مساحة سطح الجسيمات. لتكون قادراً على الكشف عن الأسفار، فإنه يتطلب حوالي 1011 MHC-Ig أو جزيئات CD28 مجموع كل اختبار الفلورسنت.
    2. الحجم الإجمالي آبكس ما يصل إلى 100 ميليلتر في برنامج تلفزيوني، وإضافة الأجسام المضادة المصبوغة في إضعاف 1: 100 واحتضانها ح 1 في 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: المثال الأجسام المضادة استخدمت بنجاح هي فيتك مترافق مكافحة الفئران الماوس Ig λ1، λ2، السلسلة الخفيفة λ3، استنساخ 46 R26 للكشف عن استنساخ MHC Ig، والماوس فيتك مترافق مكافحة اﻷرمنية/السورية الهامستر IgG، G192-1، الكشف عن الماوس المضادة CD28.
  3. أغسل الجسيمات وقراءة الأسفار على قارئ لوحة نيون.
    1. أغسل مغناطيسيا (كما هو موضح في الخطوة 2) كسور aAPC الملون ثلاث مرات مع 0.5 مل من برنامج تلفزيوني.
    2. الوت آبكس غسلها مع 0.5 مل من برنامج تلفزيوني.
    3. إضافة 100 ميليلتر من آبكس الوتيد إلى لوحة مغلوطاً 96-جيدا لقراءة تركيز باستخدام امتصاص كما هو الحال في "الخطوة 3، 1".
    4. تأخذ ميليلتر 400 المتبقية، وانقسم إلى مختبرين اثنين 200 ميليلتر وإضافة إلى بئرين في لوحة سوداء، البوليستيرين 96، حسنا، مغلوطاً. تيتراتي بنسبة 1:2 أسفل اللوحة بأخذ 100 ميليلتر من الحل وخلط مع البئر التالي يحتوي على 100 ميليلتر من برنامج تلفزيوني في كل جيد على الأقل أربع مرات.
      ملاحظة: متوسط متعددة يتطابق القياس الحد من الضوضاء في القياس.
    5. على نفس اللوحة السوداء 96، حسنا، جعل منحنى قياسي من جسم الفلورسنت تستخدم لوصمة عار، عن طريق إضافته في 1: 200 في بئر مع 200 ميليلتر من برنامج تلفزيوني والمعايرة انخفاض في نسبة 1:2 لمالا يقل عن 12 بئرا.
    6. بعد الأجسام المضادة آبك ونيون على اللوحة، قراءة اللوحة مع قارئ لوحة نيون.
  4. حساب كمية البروتين للجسيمات. تحديد تركيز الأجسام المضادة بمقارنة القيم الموجودة على المنحنى القياسي، حيث من المعروف أن تركيز الأجسام المضادة، على افتراض نسبة 1:1 لتلطيخ جسم مضاد للكشف عن الأجسام المضادة. ثم يقسم هذا التركيز للكشف عن الأجسام المضادة مع تركيز جسيمات يحددها المقايسة امتصاص سيعطي عدد الأجسام المضادة للجسيمات.

4-إثراء محددة مستضد CD8 + تي الخلايا مع مستضد نانوحبيبات معدّة اصطناعية عرض الخلايا.

  1. عزل خلايا CD8 + "تي".
    1. Euthanize الحيوانات بالتعرض إلى isoflurane متبوعاً بخلع عنق الرحم.
    2. إزالة الطحال والغدد الليمفاوية من الفئران C57BL/6j wildtype وفي إيجاد حل لبرنامج تلفزيوني. مسرات الأجهزة والوت الخلايا من خلال عقيمة 70 ميكرومتر خلية مصفاة مع يغسل المتكرر لبرنامج تلفزيوني.
    3. للقضاء على الخلايا غير CD8 + "تي"، استخدم مجموعة عزل خلية CD8 + T عدم لمس واتبع إرشادات الشركة المصنعة.
      ملاحظة: كل شرط مستضد يتطلب على الأقل 3 × 106 خلايا CD8 + "تي".
  2. إضافة آبكس نانوحبيبات لربط الخلايا CD8 + T.
    1. بعد العزلة، التركيز إلى وحدة تخزين من 100 ميليلتر في برنامج تلفزيوني مع ألبومين المصل البقري 0.5% (BSA) و 2 مم يدتا.
    2. تحديد العدد من آبكس لإضافة حساب استناداً إلى نسبة 1011 aAPC زمنياً، الببتيد محملة MHC-المفتش العام لكل 10 خلايا CD8 + "تي"6 .
    3. احتضان جسيمات أعبك وخلايا CD8 + "تي" ح 1 في 4 درجات مئوية مع الاختلاط المستمر في البوليسترين عقيمة 5 مل جولة الأنبوبة السفلي.
  3. إعداد الوسائط المكملة وعامل نمو الخلايا T (تكجف) الوت والثقافة خلايا CD8 + "تي".
    1. لوسائط الإعلام، وتستكمل الملحق الإعلامي RPMI 1640 كاملة (مع الجلوتامين) مع 1 × الأحماض الأمينية غير الأساسية، بيروفات صوديوم 1 مم، 0.4 x حل فيتامين، 2 ميكرومتر 92-mercaptoethanol، 10 السيبروفلوكساسين ميكرومتر و 10% مصل بقرى الجنين (FBS).
    2. لجعل تكجف، يتبع البروتوكولات المتبعة بالفعل والمشار إليها هنا9.
      ملاحظة: تكجف هو كوكتيل داخلية السيتوكينات المناعة البشرية هو أمر أساسي لتوفير خلايا تي مع إشارات التحفيز الإضافية اللازمة للنمو. يمكن أن يكون تبادل تكجف لخلية تي معروفة السيتوكينات تنشيطية مثل إيل-2، إيل-7، أو إيل-15؛ ومع ذلك، كل قد تستقطب استجابة الخلية تي تبعاً لذلك. وقد تم تحسين البروتوكول الموضحة هنا لا مع هذه المشروبات؛ ومن ثم ينبغي استشارة التقنيات الأخرى لتركيزات وتركيبات إذا لم يتم استخدام تكجف مع الأمثلة المذكورة10،11.
  4. أغسل وإثراء آبك وخليط الخلية CD8 + T.
    1. أغسل آبكس المغناطيسي الجسيمات كما هو موضح في الخطوة 2. إلا أن يغسل أولاً باستخدام المخزن المؤقت برنامج تلفزيوني مع يدتا جيش صرب البوسنة ومم 2 0.5% واستخدام الثانية تستكمل وسائل الإعلام، واستخدام الثالثة تستكمل وسائل الإعلام مع 1% تكجف.
    2. الوت آبكس وخلايا CD8 + "تي" المخصب في 500 ميليلتر من الوسائط المكملة مع 1% تكجف.
    3. عد الخلايا باستخدام هيموسيتوميتير ولوحة في لوحة القاع ش 96 في ميليلتر 160 كل بئر لتستكمل وسائل الإعلام مع 1% تكجف بتركيز 2.5 × 105 CD8 + T خلايا/مل.
    4. إذا عزل باستخدام آبكس مع الببتيد-تحميل فقط MHC-Ig على السطح (لا إشارات كوستيمولاتوري)، ثم أكمل الخطوة 4.5. إذا عزل باستخدام آبكس مع كلا محملة الببتيد MHC-Ig على إشارات السطحية وكوستيمولاتوري، ثم تابع إلى الخطوة 5.
  5. إضافة الجسيمات المغناطيسية المغلفة مع إشارات كوستيمولاتوري في السطح للكسر الإثراء وإضافة حقل مغناطيسي شاركت المجموعة إشارات محفزة على سطح الخلايا T.
    1. للكسور المخصب، إضافة اكويمولار (أو أكبر تبعاً للتطبيق-انظر قسم حول أعبك الخصائص لعنصر التحكم) من جسم تنشيطية لعدد تحميل الببتيد MHC-Ig على الجسيمات.
    2. السماح للجسيمات المغناطيسية كوستيمولاتوري لربط المخصب خلايا CD8 + "تي" ح 1 في 4 درجات مئوية.
    3. قم بإضافة الحقل المغناطيسي بوضع لوحة الثقافة بين اثنين نيوديميوم N52 القرص المغناطيس 1.9 سم (0.75 بوصة) في الطول.
      ملاحظة: قد N52 القرص المغناطيس حقل قوية للغاية. ينبغي الحرص على حد سواء لتخزينها مع الفواصل بين المغناطيس، كما أنه من الصعب إزالة من بعضها البعض، وعند وضعها على لوحات الثقافة. للتقليل من المغناطيس من الالتصاق بالمكونات المعدنية للحاضنة، وضعها في حاويات الستايروفوم الأنبوبة المخروطية 50 مل في الجزء السفلي والعلوي.

5-توسيع وكشف محددة مستضد CD8 + تي الخلايا مع مستضد نانوحبيبات معدّة اصطناعية عرض الخلايا.

  1. إضافة لوحة جيدا القاع ش 96 مع آبكس وخلايا CD8 + "تي" في 5% هوميديفيد CO2، حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 3 أيام. في يوم 3، تغذية الخلايا مع ميليلتر 80 كل بئر لتستكمل وسائل الإعلام مع 2% تكجف ومكان العودة إلى الحاضنة حتى يوم 7.
  2. في يوم 7، حصاد الخلايا تحفز إلى 5 مل جولة الأنبوبة السفلي للعد.
  3. كل مرة الحل هو المقطوع، تدور أسفل الخلايا المقطوع ريسوسبيند في 0.5 مل من برنامج تلفزيوني مع أزيد الصوديوم 0.05 في المائة و 2 في المائة FBS. حساب عدد الخلايا قادرة على البقاء تلطيخ مع تريبان الأزرق ونعول هيموسيتوميتير.
  4. إزالة الخلايا التي تم جردها 50,000 500,000 إلى اثنين مل 5 الجديدة جولة أسفل أنابيب لتلطيخ حدة مستضد. سيتم استخدام أنبوب واحد لوصمة عار المشابهة الببتيد-MHC، وستستخدم وصمة عار غير قرابة الأنبوبة الأخرى لتحديد تلوين الخلفية.
  5. أضف 1 ميكروغرام من بيوتينيلاتيد MHC-Ig (باستخدام الأسلوب الموصوفة في الخطوة 2) إلى قرابة كل منهما وأنابيب غير قرابة 100 ميليلتر من برنامج تلفزيوني مع أزيد الصوديوم 0.05% و 2% FBS مع اللوفيكوسيانين (APC)-استنساخ الفئران مترافق الماوس المضادة CD8a، 53-6.7 (نسبة التخفيف من 1: 100) ح 1 في 4 درجات مئوية.
  6. إضافة ستريبتافيدين الثانوية ويعيش الميت وصمة عار. تغسل بيوتينيلاتيد الزائدة Ig MHC مع برنامج تلفزيوني عن طريق الطرد المركزي. ثم وصمة عار جميع العينات بنسبة 1:350 فيكوريثرين (PE)-وصفت نسبة ستريبتافيدين و 1: 1000 من وصمة خلية ميتة خضراء يعيش الميت يمكن حلها لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية.
  7. قراءة جميع العينات في سيتوميتير تدفق لتحديد الخصوصية وعدد الخلايا المحددة مستضد.
    1. تغسل الثانوية الزائدة ويعيش الميت وصمة عار بالطرد المركزي وريسوسبيند مع 150 ميليلتر من المخزن المؤقت لبرنامج تلفزيوني مع أزيد الصوديوم 0.05% و 2% FBS للقراءة على سيتوميتير تدفق.
  8. تحديد عدد وفي المئة من خلايا محددة مستضد مع برامج تحليل البيانات.
    1. لتحديد النسبة المئوية لخلايا محددة مستضد، استخدام البوابات التالية في ترتيب كل منهما يعيش + اللمفاويات + (المبعثر إلى الأمام بجانب مبعثر)، CD8 +، وديمر +. تحديد بوابة ديمر + بمقارنة غير قرابة إلى وصمة عار المشابهة.
    2. تحديد النسبة المئوية لخلايا محددة مستضد في عينة بطرح نسبة ديمر + وصمة عار MHC-Ig المشابهة من غير قرابة MHC-Ig وصمة عار.
    3. باستخدام هذه النسبة المئوية من خلايا محددة مستضد، اضربها بعدد الخلايا التي تم عدها، مما أسفر عن العدد خلايا محددة مستضد الناتجة من إثراء وتوسيع.
      ملاحظة: سيكون التعويض إعدادها على cytometer تدفق نظراً لتداخل الطيفية مع فلوروفوريس المستخدمة في هذا الفريق.

النتائج

لإكمال نجاح الإثراء والتوسع في خلايا تي حدة مستضد، محملة الببتيد MHC-Ig وجزيئات كوستيمولاتوري بنجاح ترفق بالجسيمات آبك. استناداً إلى أساليب 3 من مرفق الجسيمات، نقدم بعض بيانات تمثيلية لنتيجة إجراء اقتران ناجحة (الشكل 5a). وفي الواقع، إذا كانت كثافة يجند منخف?...

Discussion

وقد أنشأنا تكنولوجيا عزلة رواية خلية T حدة مستضد استناداً إلى مستضد نانوحبيبات الاصطناعية عرض الخلايا (آبكس). آبكس نانوحبيبات الببتيد-بتحميله MHC على السطح يسمح ملزمة محددة مستضد T الخلية والتنشيط جنبا إلى جنب مع تنشيط كوستيمولاتوري. آبكس باراماجنيتيك، هي أيضا، وهكذا يمكن استخدامها لإثراء ...

Disclosures

الكتاب يعلن interest(s) المالية المتنافسة التالية: بموجب اتفاق ترخيص بين نيكسيموني وجامعة جونز هوبكنز، بعنوان شنك جوناثان في حصة الإتاوات التي تلقتها الجامعة على مبيعات منتجات المذكورة في هذا المادة. وكان أيضا مؤسس نيكسيموني وتملك الأسهم في الشركة. ويعمل كعضو في "مجلس الإدارة" والمجلس الاستشاري العلمي في نيكسيموني. تم استعراض أحكام هذه الترتيبات وأقرتها "جامعة جونز هوبكنز" وفقا لسياساته تضارب في المصالح.

Acknowledgements

بفضل J.W.H. في مركز تدريب تقنية النانو السرطان المعاهد الوطنية للصحة في معهد جونز هوبكنز النانوية، والوطني العلم مؤسسة الدراسات العليا بحوث الزمالة (DGE-1232825)، ومؤسسة جمعية الهلال الأحمر الأفغاني لدعم الزمالة. تم تمويل هذا العمل بدعم من المعاهد الوطنية للصحة (P01-AI072677، R01-CA108835، R21-CA185819)، ومبادرة الابتكار تيدكو/ولاية ماريلاند، ومؤسسة كولتر (JPS).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
DimerX I: Recombinant Soluble Dimeric Human HLA-A2:Ig Fusion ProteinBD Biosciences551263
DimerX I: Recombinant Soluble Dimeric Mouse H-2D[b]:IgBD Biosciences551323
DimerX I: Recombinant Soluble Dimeric Mouse H-2K[b]:Ig Fusion ProteinBD Biosciences550750
Vivaspin 20 MWCO 50 000GE Life Sciences28932362
Vivaspin 2 MWCO 50 000GE Life Sciences28932257
Purified Human Beta 2 MicroglobulinBio-RadPHP135
nanomag-D-spio, NH2, 100 nm nanoparticlesMicromod79-01-102
Super Mag NHS Activated Beads, 0.2 µmOcean NanotechSN0200 
Anti-Biotin MicroBeads UltraPureMiltenyi130-105-637
EZ-Link NHS-BiotinThermoFisher20217
Sulfo-SMCC Crosslinker ProteoChemc1109-100mg
2-Iminothiolane hydrochlorideSigma-AldrichI6256 Sigma 
96 Well Half-Area Microplate, black polystyreneCorning3875
FITC Rat Anti-Mouse Ig, λ1, λ2, & λ3 Light Chain  Clone  R26-46  BD Biosciences553434
FITC Mouse Anti-Armenian and Syrian Hamster IgG  Clone  G192-1BD Biosciences554026
B6.Cg-Thy1a/Cy Tg(TcraTcrb)8Rest/J (transgenic PMEL) miceJackson Laboratory005023
C57BL/6J (B6 wildtype) miceJackson Laboratory000664
CD8a+ T Cell Isolation Kit, MouseMiltenyi130-104-075
MS ColumnsMiltenyi130-042-201
LS ColumnsMiltenyi130-042-401
Streptavidin-Phycoerythrin, SAv-PEBiolegend405203
N52 disk magnets of 0.75 inches K&J MagneticsDX8C-N52
APC anti-mouse CD8a Antibody, clone 53-6.7Biolegend100711
LIVE/DEAD Fixable Green Dead Cell Stain Kit, for 488 nm excitation ThermoFisherL-34969

References

  1. Prasad, V. immunotherapy: Tisagenlecleucel-the first approved Car-t-cell therapy: implications for payers and policy makers. Nature Reviews Clinical Oncology. 15 (1), 11 (2018).
  2. Jenkins, M. K., Moon, J. J. The role of naive T cell precursor frequency and recruitment in dictating immune response magnitude. The Journal of Immunology. 188 (9), 4135-4140 (2012).
  3. Rizzuto, G. A., et al. Self-antigen-specific CD8+ T cell precursor frequency determines the quality of the antitumor immune response. Journal of Experimental Medicine. 206 (4), 849-866 (2009).
  4. Newell, E. W., Davis, M. M. Beyond model antigens: high-dimensional methods for the analysis of antigen-specific T cells. Nature biotechnology. 32 (2), 149 (2014).
  5. Perica, K., et al. Enrichment and expansion with nanoscale artificial antigen presenting cells for adoptive immunotherapy. ACS nano. 9 (7), 6861-6871 (2015).
  6. Kosmides, A. K., Necochea, K., Hickey, J. W., Schneck, J. P. Separating T Cell Targeting Components onto Magnetically Clustered Nanoparticles Boosts Activation. Nano Letters. , (2018).
  7. Hickey, J. W., Vicente, F. P., Howard, G. P., Mao, H. Q., Schneck, J. P. Biologically Inspired Design of Nanoparticle Artificial Antigen-Presenting Cells for Immunomodulation. Nano Letters. 17 (11), (2017).
  8. , ., et al. Efficient magnetic enrichment of antigen-specific T cells by engineering particle properties. Biomaterials. , (2018).
  9. Oelke, M., et al. Generation and purification of CD8+ melan-A-specific cytotoxic T lymphocytes for adoptive transfer in tumor immunotherapy. Clinical Cancer Research. 6 (5), 1997-2005 (2000).
  10. Riccione, K., Suryadevara, C. M., Snyder, D., Cui, X., Sampson, J. H., Sanchez-Perez, L. Generation of CAR T cells for adoptive therapy in the context of glioblastoma standard of care. Journal of visualized experiments: JoVE. (96), (2015).
  11. Ho, W. Y., Nguyen, H. N., Wolfl, M., Kuball, J., Greenberg, P. D. In vitro methods for generating CD8+ T-cell clones for immunotherapy from the naive repertoire. Journal of immunological methods. 310 (1-2), 40-52 (2006).
  12. Rudolf, D., et al. Potent costimulation of human CD8 T cells by anti-4-1BB and anti-CD28 on synthetic artificial antigen presenting cells. Cancer immunology, immunotherapy : CII. 57 (2), 175-183 (2008).
  13. Gulukota, K., Sidney, J., Sette, A., DeLisi, C. Two complementary methods for predicting peptides binding major histocompatibility complex molecules1. Journal of molecular biology. 267 (5), 1258-1267 (1997).
  14. Castle, J. C., et al. Exploiting the mutanome for tumor vaccination. Cancer research. 72 (5), 1081-1091 (2012).
  15. Duan, F., et al. Genomic and bioinformatic profiling of mutational neoepitopes reveals new rules to predict anticancer immunogenicity. Journal of Experimental Medicine. 211 (11), 2231-2248 (2014).
  16. Srivastava, P. K., Duan, F. Harnessing the antigenic fingerprint of each individual cancer for immunotherapy of human cancer: genomics shows a new way and its challenges. Cancer Immunology, Immunotherapy. 62 (5), 967-974 (2013).
  17. Yadav, M., et al. Predicting immunogenic tumour mutations by combining mass spectrometry and exome sequencing. Nature. 515 (7528), 572 (2014).
  18. Gros, A., et al. Prospective identification of neoantigen-specific lymphocytes in the peripheral blood of melanoma patients. Nature medicine. 22 (4), 433 (2016).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

141 T

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved