تنقية H3 و H4 هستون بروتينات والتحديد الكمي لعلامات هيستون أسيتيلاتيد في خلايا وأنسجة المخ

Summary

والغرض من هذه المقالة توفير دليل شامل ومنهجي لفعالية تنقية histones H3 و H4 والتحديد الكمي لبقايا هيستون أسيتيلاتيد.

Abstract

في جميع الكائنات الحية حقيقية النواة، الكروماتين، القالب الفسيولوجية للمعلومات الوراثية كل شيء، أمر أساسي للوراثة. الكروماتين يخضع لمجموعة تعديلات بوسترانسلاشونال متنوعة (بتمس) أن معظمها تحدث في تيرميني الأمينية البروتينات هستون (أي، ذيل هيستون) وتنظيم الوصول والدولة الوظيفية من الحمض النووي الأساسية. هيستون ذيول تمتد من جوهر نوكليوسومي وتخضع لإضافة مجموعات أسيتيل أسيتيلترانسفيراسيس هستون (القبعات) وإزالة مجموعات أسيتيل هيستون ديسيتيلاسيس (هداكس) أثناء النمو الخلوي والتمايز. تحديد أنماط acetylation محددة على بقايا يسين (K) في ذيول هستون التوازن ديناميكي بين الكروماتين ترانسكريبتيونالي النشطة أو مكبوتة ترانسكريبتيونالي بالتأثير على الجمعية هيستون الأساسية (1) و (2) توظيف التآزر أو معادية من البروتينات المرتبطة الكروماتين إلى موقع النسخ. الآلية التنظيمية الأساسية للطبيعة المعقدة للذيل هيستون بتمس يؤثر معظم الكروماتين templated العمليات والنتائج في التغييرات في نضوج الخلية، والتمايز في التنمية العادية والمرضية على حد سواء. والهدف من هذا التقرير تزويد المبتدئين بطريقة فعالة لتنقية البروتينات هستون الأساسية من خلايا وأنسجة المخ وقياس موثوق بها علامات أسيتيليشن على هيستونيس H3 و H4.

Introduction

التخلق مصطلح يشير إلى التغييرات الموروثة في نشاط الجينات التي تحدث بصورة مستقلة عن التغييرات في تسلسل الحمض النووي^1،2. النسخ الجيني والقمع مصممون (1) إمكانية الحصول على الحمض النووي الكروموسومات ملفوفة حول أوكتامير البروتينات هستون الأساسية (اثنان نسخ كل من H2A H2B، H3 و H4) ومن (2) توافر عوامل النسخ وسقالة البروتينات وعين للمروج محددة المواقع^3،4. ينظم النسخ الجيني بوساطة إنزيم تعديلات محددة المواقع المروج الحمض النووي وبتمس هيستون ذيول^5،،من⁶⁷. ن-تيرميني من هستون H3 و H4 بين تسلسلات أشد المصانة المعروفة في الكائنات الحية حقيقية النواة³، وتم توثيق هذه التعديلات بوستترانسلاشونال على نطاق واسع تلعب دوراً محوريا في تحديد هيكل الكروماتين و وظيفة^8،9. بتمس في ذيول هستون (أي، أسيتيليشن، مثلايشن، الفسفرة وأوبيكويتينيشن) تغيير إمكانات التفاعل من الذيول والتأثير في هيكلية الدولة وقابلة للطي للألياف الكروماتين، ومن ثم، تنظيم وصول الحمض النووي وتجهيز^4،10،،من¹¹¹². إضافة إلى مجموعات أسيتيل وإزالتها من بقايا ك في ذيول هستون بمجموعة محددة تتفاعل هيستون جينية الإنزيمات، هما القبعات وهداكس، على التوالي¹³. على سبيل المثال، أسيتيليشن هيستون H4 في يسين 12 (H4K12ac) قد ثبت سابقا لتفعيل نسخ الجينات المتصلة ب اكتساب وترسيخ الذاكرة¹⁴. بالإضافة إلى ذلك، عدة أسطر من الأدلة تشير إلى أن سيطرة جينية بوساطة إنزيم النسخ الجيني أحد جوانب الهامة لصحة الخلوية النمو والتمايز^6،15. وقد ثبت التناوب في تنظيم التعبير الجيني، بتعديلات جينية في الحمض النووي أو بطفرة من الإنزيمات جينية أنفسهم، جينية dysregulated في الأمراض التي تصيب الإنسان حيث تغير في نشاط جينات خاصة علامة مميزة ^16،علم الأمراض (مثلاً، السرطان)^6،17. وهكذا، تقييم التغييرات في هيستون الأساسية بتمس تبرز كهدف ذات القيمة العالية للتدخلات العلاجية المحتملة. بيد تحديد الوفرة، شركاء المتفاعلة، والأدوار المحددة بتمس histones قد ثبت تحديا¹⁸.

ويرد في التقرير الحالي، واستراتيجية محسنة والإنتاجية المتوسطة لتنقية histones الأساسية من خلايا وأنسجة المخ في جزء واحد، وبروتوكول كامل للتحديد الكمي ل histones H3 و H4 بتمس. ملاحظة، على الرغم من أن تنشر حاليا على أساس حمض هيستون المستندة إلى جسم الكشف عن استراتيجيات وتقنيات تنقية قد اعتمدت على نطاق واسع لتوصيف هستون، أنها تفتقر إلى التفاصيل الوصفية فيما يتعلق بالخطوات الحاسمة لهذا الإجراء، وهكذا التي تعرقل استخراج هيستون سريعة وقابلة للتكرار، والتقدير الكمي. على سبيل المثال، استخراج تجهيز الخلية وخزعات الأنسجة يتطلب تكنولوجيات وأدوات مختلفة لاستخراج ناجحة. وعلاوة على ذلك، يوضح البروتوكول الأمثل في المخطوطة الحالية اتباع نهج عملي والإنتاجية المتوسطة. يتم استخراج histones الأساسية كشريحة واحدة ونقية، التي تمكن موثوقة المتلقين للمعلومات بوساطة جسم PTM الكشف دون أي تدخل من الشوائب. وعلاوة على ذلك، تم في المخطوطة الحالية، التحايل التحديات فيما يتعلق بكشف هستون بسبب وزنها الجزيئي صغير. عادة، يعيق انعدام التوافق بين تنقية والتقدير الكمي، وبروتوكولات التفريد جل العلماء من الحصول على نتائج قابلة للتكرار وقاطعة. ويرد هنا، سير العمل أمثل لتنقية histones الأساسية من الخلايا والأنسجة وإعدادهم لتحليلات PTM المصب عبر لطخة غربية.

ويتيح البروتوكول الحالي تنقية البروتينات هستون الأساسية مع الحفاظ على تلك التعديلات بوستترانسلاشونال الأصلي (أي، أسيتيليشن، مثلايشن والفسفره). ويصور الشكل 1 الجدول الزمني للبروتوكول تنقية هيستون.

Protocol

تم إيواء جميع الفئران في يسيطر الرطوبة ودرجات الحرارة، المعتمدين من آآلاك حيوانية منشأة في جامعة ميامي ميلر مدرسة الطب. جميع التجارب التي أقرتها جامعة "ميامي ميلر مدرسة الطب المؤسسية الحيوان الرعاية" واستخدام اللجنة (إياكوك) وأجريت وفقا للمواصفات من المعاهد الوطنية للصحة.

1-إعداد استخراج عينة

1. خلايا ملتصقة
   1. لوحة الخلايا في أطباق 10 سم في وسائل الإعلام الثقافة المناسبة (1 × 10⁶ إلى 1 × 10⁹ خلايا كل طبق لخطوط الخلايا، مثل BV2، HEK-293، و SH-SY5Y، ولكن ~ 1 × 10¹⁵ خلايا كل طبق للخلايا الأولية مثل الخلايا العصبية القشرية الأولية). أؤكد أن الخلايا هي موزعة بالتساوي على كامل سطح اللوحة، وتسمح للخلايا أن تنمو على 48 ساعة للتوصل إلى التقاء ~ 100% (37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون 5%₂).
   2. حالما وصلت إلى الخلايا كونفلوينسي المرجوة، بلطف نضح وسائل الإعلام الثقافة وتغسل الخلايا 2 x مع بريوارميد وسائل الإعلام الحرة المصل تحت غطاء زراعة الأنسجة.
   3. نضح الوسائط الحرة المصل من الطبق وإضافة 1 مل من استخراج المثلج المخزن المؤقت (0.4 M حامض الكبريتيك، 1 مم بوكل، 1 مم مجكل₂, 50 مم تريس-HCl [pH 8.0] و 1 × مثبطات البروتياز كوكتيل) لكل طبق.
   4. استخدام مكشطة بلاستيكية خلية لجمع كافة الخلايا الموجودة في المخزن المؤقت لاستخراج (بواسطة القشط) ونقلها إلى 1.5 مل المسمى أنبوب مع ماصة ميليلتر 1,000. بيبيت الخلايا أعلى وأسفل x 3 لتسهيل تحقيق التجانس.
   5. قم بإغلاق جميع الأنابيب ووضعها مباشرة على الجليد.
2. أنسجة المخ
   1. إذا كان يتم استخدام الأنسجة المجمدة، وضع الأنسجة في أنبوب بريشيليد 1.5 مل وإيجاز ذوبان الجليد على الجليد. إذا كان يتم استخدام أنسجة جديدة، الشروع فورا في خطوة 1.2.2.
      ملاحظة: البروتوكول الحالي وصف الإجراءات باستخدام عينات قشرة prefrontal الماوس والدماغ الماوس المجمدة.
   2. مجانسة الأنسجة باستخدام الخالطون دونس يده استخدام المقدار المناسب من المخزن المؤقت لاستخراج والعدد الموصى به من السكتات الدماغية (الجدول 1). لتجنب تمزيق الكروماتين المفرطة، لا يتجاوز عدد الحدود الموصى بها.
   3. باستخدام ماصة ميليلتر من قناة واحدة 1,000، نقل هوموجيناتي إلى أنبوب بريشيليد 1.5 مل. قم بإغلاق جميع الأنابيب ووضعها مباشرة على الجليد.

2-إعداد استخراج النفط الخام هيستون

1. وضع أنابيب 1.5 مل يحتوي على خلايا أو أنسجة علقت في المخزن المؤقت للاستخراج على منصة الدورية وتدوير في 15 دورة في الدقيقة عند 4 درجة مئوية للسماح باستخراج النفط الخام هيستونيس.
   ملاحظة: قد تختلف عن خلية مختلفة وأنواع الأنسجة وقت استخراج ويجب أن يكون الأمثل لكل إجراء. ويقدم البروتوكول الحالي بالنتائج التي تم الحصول عليها بعد 15 دقيقة وح 2 ح 24 لاستخراج (الشكل 2و الشكل 3، الرقم 4، و الشكل 5).
2. بريتشيل ميكروسينتريفوجي إلى 4 درجات مئوية. بعد مرور الوقت المطلوب استخراج، الطرد المركزي هذه الأنابيب بأقصى سرعة لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية.
3. نقل المادة طافية بما في ذلك هيستونيس النفط الخام إلى أنبوب مل 1.5 الجديد، بريتشيليد. تجاهل بيليه.
4. تخزين المادة طافية في-80 درجة مئوية (الاستخراج يمكن وقفها في هذه الخطوة، انظر "الخطوة التوقف" في الشكل 1) أو فورا للانتقال إلى الخطوة التالية.
5. تحييد histones النفط الخام بحجم 5 × تحييد المخزن المؤقت 1/4 (مثلاً، إضافة 250 ميليلتر من 5 × تحييد المخزن المؤقت إلى 1 مل هيستونيس الخام). مزيج جيد من قبل بيبيتينج صعودا وهبوطاً 6 x.
6. فحص درجة الحموضة الخليط مع شرائح الأس الهيدروجيني. ضبط تبعاً لذلك بإضافة أكثر من المخزن المؤقت الأبطال للوصول إلى الرقم الهيدروجيني 7.
7. تقييم وجود هستون واستخراج البروتين نونهيستوني في هيستون النفط الخام على النحو التالي (الشكل 2).
   1. إضافة ميليلتر 37.5 من العينة إلى 12.5 ميليلتر من 4 × (لايملي) عينة المخزن المؤقت وتجريدها لمدة 10 دقائق على 99 درجة مئوية.
   2. العينة على جل الحزب الديمقراطي الصربي صفحة تحميل وتشغيل الهلام ح 1 في 100 V.
   3. وصمة عار الجل بين عشية وضحاها مع الحل المصبوغة R-250 "أخذ الأزرق اللامع" وديستاين خلال يغسل ثلاث متتالية (ح 1/يغسل) مع الحل ديستاينينج R-250 "أخذ الزرقاء الرائعة".
      ملاحظة: يمكن مقارنة histones الخام (الشكل 2) مع histones التيد والمنقاه (أيعمود الإدخال [الشكل 5A]).

3-تنقية Histones الأساسية

1. الموازنة عمود الدوران
   1. إضافة 500 ميليلتر من المخزن المؤقت للموازنة لكل عمود الدوران قيد الاستخدام. لا تلمس غشاء العمود.
   2. أجهزة الطرد المركزي في 4 درجات مئوية لمدة 3 دقائق في 800 x ز. تجاهل في التدفق من خلال. كرر 1 x.
2. تنقية هيستون
   1. إضافة 500 ميليلتر لعينة من الفائدة من الخطوة 2، 6 إلى العمود. أجهزة الطرد المركزي في 4 درجات مئوية لمدة 3 دقائق في 800 x ز. جمع في التدفق من خلال.
   2. كرر الخطوة السابقة عدة مرات حسب الضرورة لتحميل العينة كاملة على العمود. لا أوفيرفيل عمود الدوران.
   3. تجمع من خلال التدفق من كل خطوة الطرد المركزي لتحليل كفاءة ربط الأعمدة (الشكل 3).
   4. اتبع الخطوة 2.7 لتحليل التدفق خلال العمود.
3. عمود المياه والصرف الصحي
   1. إضافة 500 ميليلتر من المخزن المؤقت الغسيل لكل عمود. أجهزة الطرد المركزي في 4 درجات مئوية لمدة 3 دقائق في 800 x ز. جمع الغسيل من خلال تدفق (أغسل #1).
   2. كرر الخطوة 3.3.1 مجموعة يغسل ثلاث. جمع يغسل من خلال تدفق #2 و #3. لا تجمع العمود على التوالي من خلال تدفق يغسل.
   3. لمواصلة تقييم كفاءة هيستون-ملزم للعمود، تحليل يغسل ثلاثة العمود بالخطوة التالية 2.7 (الشكل 4).
4. شطف هيستون
   1. تحويل العمود إلى أنبوب توسم 1.5 مل جديدة.
   2. إضافة 50 ميليلتر من المخزن المؤقت شطف هيستون. أجهزة الطرد المركزي في 4 درجات مئوية لمدة 3 دقائق في 800 x ز. حفظ من خلال تدفق تتضمن هيستون البروتينات.
   3. بالنسبة شطف إضافي، كرر الخطوة 3.4.2. لا تجمع في الأول والثاني من خلال تدفق الواتس كما أنها تختلف في كمية هيستون والنقاء.

4-هطول الأمطار هيستونيس الأساسية

1. إضافة حمض بيرتشلوريك (PCA) إلى histones المنقي لتركيز نهائي 4% محكمة التحكيم الدائمة (مثلاً، إضافة 3 ميليلتر من 70% محكمة التحكيم الدائمة إلى 50 ميليلتر من histones المنقي من الخطوة 3.4.2.
2. أجهزة الطرد المركزي عن 3 ليالي لجمع جميع السائل المتبقية من جدار الأنبوبة. مزيج من بيبيتينج صعودا وهبوطاً 6 x.
3. ضع الأنابيب في رف واحتضانها ح 24 في 4 درجات مئوية.
4. في اليوم التالي، بريتشيل ميكروسينتريفوجي إلى 4 درجات مئوية والطرد المركزي العينات لمدة 75 دقيقة بأقصى سرعة ممكنة عند 4 درجة مئوية.
5. بعد اكتمال الطرد المركزي، ستكون مرئية في الجزء السفلي من الأنبوب بيليه أبيض صغيرة التي تحتوي على هيستونيس سرع. دوامة لا العينة.
6. عناية نضح المادة طافية، ودون الإخلال بيليه، إضافة 500 ميليلتر من المثلج 4% محكمة التحكيم الدائمة للعينة.
7. الطرد المركزي عند 4 درجة مئوية لمدة 10 دقائق بأقصى سرعة ممكنة. نضح المادة طافية بعناية.
8. كرر الخطوة 4.7 2 x.
9. دون الإخلال بيليه، إضافة 500 ميليلتر من الأسيتون المثلج. الطرد المركزي عند 4 درجة مئوية لمدة 10 دقائق بأقصى سرعة ممكنة. نضح المادة طافية بعناية.
10. كرر الخطوة 4.9 2 x.
11. بعناية نضح المادة طافية وتترك أنابيب أزم والسماح للعينة الجافة على الجليد ل 30 دقيقة الاختيار إذا قد تبخرت جميع الأسيتون المتبقية.
12. إجازة أزم الأنابيب والسماح عينة لتجف في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 5 دقائق.
13. ريسوسبيند بيليه في 30 ميليلتر من الماء المعقم. عدم بيبيت صعودا وهبوطاً. نفض الغبار الأنبوب بلطف بواسطة إصبع.
14. كاب جميع الأنابيب والسماح هيستونيس إعادة تشكيل على الجليد ل 30-50 دقيقة، تبعاً لحجم بيليه. تحقق إذا كان بيليه هو حراكه.
15. كاب جميع الأنابيب والسماح لبيليه زيادة ريسوسبيند في RT لمدة 5 دقائق.
    ملاحظة: هذا الحل (شطف الأولى والثانية من الخطوة 3.4.3) يتكون من هيستونيس المنقي وديسالتيد ويمكن استخدامها لمزيد من التحليل الكمي وهيستون أسيتيليشن.

5-التقدير الكمي للبروتينات هستون التيد

1. استخدام جهاز المطياف الضوئي وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة لتحديد كمية البروتينات هستون الإجمالية التي تم الحصول عليها بعد شطف النهائي في الخطوة 4، 15. قياس امتصاص في 230 نيوتن متر. سجل نسبة A260/A280 الإرشادية لتلوث العينة مع الحمض النووي.
2. استخدم الصيغة التالية لحساب تركيز هستون (x):
   
   هنا، هو OD الكثافة البصرية التي تقاس في A230 شمال البحر الأبيض المتوسط.
3. ويعتبر تركيز هيستون ~1.5 مغ/مل متوسط إنتاج لخطوط الخلايا، بينما تركز هيستون ~5.0 mg/mL يعتبر متوسط إنتاج ل 30 ملغ أنسجة.

6. تحليل لطخة غربية

1. ضبط هيستون المنقي والتيد من الخطوة 4.15 إلى ~ 10 ميكروغرام من هستون البروتين/عينة.
2. إضافة إلى حجم مناسب للمياه و 4 x Laemmli عينة من المخزن المؤقت لضبط تحميل وحدات التخزين.
3. تؤذي العينات لمدة 10 دقائق على 99 درجة مئوية. بارد لهم على الجليد. أجهزة الطرد المركزي ل 3 s لجمع جميع السائل المتبقية والتكثيف من جدار الأنبوبة.
4. تحميل العينات على جل الحزب الديمقراطي الصربي صفحة وتشغيل الهلام ح 1 في 100 V.
5. تصور هيستون مجموع البروتين ووصمة عار الجل بين عشية وضحاها مع الحل المصبوغة R-250 "أخذ الأزرق اللامع" وديستين خلال ثلاثة يغسل متتالية (ح 1/يغسل) مع الحل ديستينينج R-250 "أخذ الزرقاء الرائعة".
   ملاحظة: يتضمن شطف أول من البروتينات هستون هيستونيس عالية الجودة (الشكل 5A) بينما شطف الثاني يتضمن منخفضة للا مستويات histones (الشكل 5B).
6. لتحديد مقدار بتمس هستون، استخدم نظام نقل (انظر الجدول للمواد) لنقل البروتين هستون من الحزب الديمقراطي الصربي صفحة هلام (الخطوة 6.4) على غشاء PVDF.
   1. لتجميع ساندويتش نقل، فتح كاسيت نظام نقل ووضع المكدس الغشاء PVDF (وصفت بأنها أسفل +) في الجزء السفلي من الكاسيت مع الغشاء مواجهة. لفة الغشاء بلطف مع اسطوانة وصمة عار لإزالة أي الهواء من المكدس والغشاء.
   2. وضع الجل على رأس الغشاء ولفه هلام بلطف مع اسطوانة وصمة عار لإزالة أي الهواء بين الغشاء والهلام ومكان أعلى المكدس في الهلام. لفة بلطف مرة أخرى ووضع غلاف كاسيت على رأس ساندويتش واضغط لأسفل بشدة ودورة نوب اتجاه عقارب الساعة لتأمين.
   3. إدراج كاسيت بفتحه نظام نقل. على شاشة جهاز، حدد البروتوكول توربو. استخدام بروتوكول 3 دقيقة لجل ميني واحد أو بروتوكول 7 دقيقة لاثنين أو أكثر من المواد الهلامية مصغرة.
   4. وصمة عار الغشاء مع Ponceau S وصمة عار لمدة 5 دقائق ووضع تصور للبروتينات هستون المجموع.
   5. غسلها في 1 × تريس مخزنة المالحة (تبس) مع 0.1% 20 توين ح 2 وكتلة الحليب لهم في 5% ل 1 h. إينكوباتي مع جسم الابتدائي والثانوي (المبيت في 4 درجات مئوية أو ح 1 في الرايت، على التوالي) أو وفقا لبروتوكول أمثل سابقا.
      ملاحظة: في البروتوكول الحالي، والأجسام المضادة ضد هيستونيس أسيتيلاتيد H4K12 (الشكل 6 و 7 الشكل) و H3K27 (الشكل 8) واستخدمت.

النتائج

لتوضيح تطور البروتوكول تنقية هيستون وتكوين كافة الكسور تم تحليلها، نحن تقييم مقتطفات هيستون مختلفة من الخلايا البشرية ميكروجليال BV2. وللتدليل على التحديد الكمي ل histones H3 و H4 بتمس (أي، أسيتيليشن)، كنا ليساتيس أنسجة الدماغ.

الخلايا BV2 مطلي في 5 × 10⁶ خلايا كل طبق في 10 سم أطباق المعالجة بزراعة الأنسجة وسمحت ليصل إلى كونفلوينسي ل 48 h. ثم تم جمع الخلايا، وأطلق سراح histones من الكروماتين بحضانة في استخراج المخزن المؤقت الذي يحتوي على 0.4 متر حمض الكبريتيك و 1 مم بوكل، 1 مم مجكل₂، 50 مم تريس-HCl (pH 8.0) و 1 × مثبطات البروتياز. الوقت الاستخراج، بين 15 دقيقة و 24 ساعة، لم يؤثر في التكوين العام لمقتطفات هيستون الخام حسبما يقرره "أخذ الأزرق الرائعة" تلطيخ (الشكل 2). صدرت هيستونيس المقبل، والنفط الخام من خلال الأعمدة هيستون متوازن والتدفق عبر تم تحليلها. كفاءة عالية في ربط الأعمدة يتحدد بغياب البروتين هستون في التدفق من خلال عند تحليلها بواسطة تلطيخ "أخذ الزرقاء الرائعة". علينا تحديد كفاءة ربط الأعمدة لتكون 100% نظراً لوجود لا البروتينات هستون الاكتشاف الحالي في تحليل التدفق من خلال (الشكل 3). ثم جميع الأغشية مع histones منضم تم غسلها ثلاث مرات مع المخزن المؤقت للغسيل لإزالة الشوائب المتبقية أي، تاركاً البروتينات هستون فقط منضم إلى هلام السليكا. نحن قرر أن، لاستخراج هيستون جميع الأوقات (أي، 15 دقيقة، ح 2 و 24 ساعة)، يغسل الغشاء الأول الأكثر أهمية لإزالة التلوث نونهيستوني من الأعمدة، بينما يغسل الثانية والثالثة لم تؤثر عدم نقاء العينة. وهكذا، اعتماداً على نوع العينة، قد أغفل يغسل الأخيرتين. بعد شطف أول من البروتينات هستون من العمود (باستخدام شطف المخزن المؤقت الذي يحتوي على 1 مم كلوريد الصوديوم ويدتا)، histones كانت عجلت بين عشية وضحاها مع حمض بيرتشلوريك 4% وثم القريبون وغسلها وتحليلها لإثراء histones المنقي H3 و H4. ولاحظنا أن ح 24 لاستخراج الوقت الزيادات مقارنة كمية histones H3 و H4 في الكسر المنقي لمدة 15 دقيقة و 2 حاء من وقت استخراج (الشكل 5A). لم يؤد إلى شطف الثانية من العمود histones عالية الجودة أو الكمية عالية (الشكل 5 (ب)).

بعد ذلك، كنا homogenates أنسجة الدماغ كمياً هيستون H3 و H4 بتمس، إلا وهي أسيتيليشن. البرية من نوع (C57BL6/ي) ذكور الفئران كانت تدار تعمل على نطاق واسع وجمعت المانع هداك (تريبوتيرين) بجرعة 5 غ/كغ شفويا عن 3 د المخ كل الأنسجة في يوم 4 واستخرجت histones الخام وفقا لبروتوكول وصف. استخدام مزاوج تي-اختبار، عقدنا العزم على أن تريبوتيرين يزيد أسيتيليشن هيستونيس في استخراج النفط الخام (t(6) = 6.184، ف = 0.0004)؛ ومع ذلك، يتم الكشف عن الشوائب في الاستخراج (العصابات هيستون غير محددة بوضوح). وبالتالي، ليس لديه جسم H4K12ac خصوصية عالية (الشكل 6). لمواصلة تقييم مدى انطباق البروتوكول المقدم إلى مقاطع أصغر الأنسجة، جمعنا قشرة prefrontal من ثلاثية محوره وراثيا مرض الزهايمر (3 × تيراغرام-م) يعالجون يوميا 10 مغ/كغ M344، فئة الفئران ومثبطات IIb هداك، لأربعة أشهر. وأجرى تنقية هيستون وهطول الأمطار وفقا للبروتوكول هو موضح هنا. استخدام هيستون المنقي H3 و H4 الكسر، عقدنا العزم على أن يزيد M344 أسيتيليشن H4K12 الأضعاف (t(6) = 13.03، ف < 0.0001)، مع خصوصية عالية جسم H4K12ac (الشكل 7). وبالمثل، لاحظنا زيادة في هيستون H3 acetylation في الخلايا BV2 في الرد على آخر هداك المانع، إلا وهي انتقائية HDAC3 المانع، رجفب-966. 10 ميكرون من الأسباب رجفب-966 زيادة الضعفين تقريبا من أسيتيليشن في هيستون H3K27 بعد 24 ساعة من العلاج. الطالب مزاوج تي-تم استخدام اختبار لمقارنة التحكم مقابل تعامل الخلايا.

رقم 1: الجدول الزمني للبروتوكول تنقية هيستون. وترد جميع الخطوات لتحليلات هيستون أدناه جنبا إلى جنب مع الوقت المقدر اللازم لكل خطوة. الأرقام التي تصور نتائج خطوات معينة وقدم داخل المخطوطة هي المشار إليها في أقواس. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

رقم 2: الممثل جل "أخذ الأزرق اللامع" الملون مما يدل على هيستونيس النفط الخام المستخرج من الخلايا BV2- كانت مثقف خلايا BV2 عن 48 ساعة قبل بدء البروتوكول استخراج هيستون. تم استخراج histones النفط الخام لمدة 15 دقيقة و 2 ح ح 24، مع ثلاثة replicates لكل نقطة الوقت (هذا هو كما هو الحال في الشكل 3، الرقم 4، و الرقم 5). نونهيستوني وهستون بروتينات موجودة في استخراج النفط الخام هيستون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 3: الممثل جل "أخذ الأزرق اللامع" الملون إظهار عمود التدفق من خلال تنقية هيستون التالية الخطوات من الخلايا BV2- عقب هيستون الخام مرورا بالعمود ملزمة هستون، موجودة فقط نونهيستوني البروتينات في التدفق عبر. البروتينات هستون غائبة في هذا الكسر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 4: الممثل جل "أخذ الأزرق اللامع" الملون إظهار عمود يغسل بعد خطوة تنقية هستون من الخلايا BV2- بغض النظر عن أوقات استخراج هستون، الذي كانت (أ) 15 دقيقة، (ب) ح 2، أو (ج) 24 ح، كميات منخفضة من البروتينات نونهيستوني كانت فقط موجودة في العمود الأول-المياه والصرف الصحي هيستونيبيندينج. البروتينات هستون كانت غائبة في جميع يغسل. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الرقم 5: الممثل جل "أخذ الأزرق اللامع" الملون مما يدل على بعد خطوة تنقية هستون من الخلايا BV2 التيونس. (أ) عالية الجودة تنقية وديسالتيد هيستون H3 واكتشفت H4 بعد شطف الأولى من العمود تنقية هيستون. ولم تسفر عن العمود (ب) شطف الثانية من تنقية هستون جودة عالية أو كمية histones H3 أو H4. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

رقم 6: تعمل على نطاق واسع هداك يزيد المانع، تريبوتيرين، أسيتيليشن H4K12 في الدماغ كله من الفئران البرية من نوع. (أ) هذا الفريق يظهر ممثل الغربية وصمة عار تصور استخراج أي بزيادة قدرها أسيتيليشن H4K12 في هيستون الخام التي تم جمعها من الدماغ كله من الفئران البرية من نوع استجابة لهداك على نطاق واسع بالإنابة المانع، تريبوتيرين. (ب) هذا الفريق يظهر التحديد الكمي للزيادة في H4K12 أسيتيليشن في فيفو. مزاوج تي-تم استخدام اختبار لمقارنة مجموعات (t(6) = 6.076، ف = 0.0005). وتمثل القضبان ± يعني الخطأ المعياري للوسط (SEM). N = 8. ف < 0.0001. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

رقم 7: الفئة الأولى ومثبطات IIb هداك، M344، يزيد من أسيتيليشن H4K12 في قشرة prefrontal ثلاثية محوره وراثيا مرض الزهايمر (3 × تيراغرام-م) الفئران. (أ) هذا الفريق يظهر ممثل غربي لطخة تصور أي بزيادة قدرها أسيتيليشن H4K12 في تنقية واستخراج هيستون ديسالتيد التي جمعتها من قشرة 3 × الفئران تيراغرام-م استجابة لتثبيط هداكس prefrontal M344. (ب) يظهر هذا الفريق التحديد الكمي لزيادة أسيتيليشن H4K12 ردا على M344 التي تديرها بجرعة 10 مغ/كغ يوميا لمدة أربعة أشهر. مزاوج تي-تم استخدام اختبار لمقارنة مجموعات (t(6) = 13.30، ف < 0.0001). تمثل القضبان ± يعني sem. N = 8. ف < 0.00001. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 8: مثبط HDAC3 انتقائية، رجفب-966، يزيد من أسيتيليشن H3K27 في خلايا microglial BV2- (أ) هذا الفريق يظهر وصمة عار غربية تمثيلية تصور أي بزيادة قدرها أسيتيليشن H3K27 في استخراج هيستون المنقي وديسالتيد التي جمعتها من الخلايا BV2 ردا على تثبيط HDAC3 رجفب-966. (ب) رجفب-966 يسبب زيادة الضعفين تقريبا من أسيتيليشن في هيستون H3 ويسين (ك) 27 بعد 24 ساعة من العلاج. مزاوج تي-اختبار تم استخدامه لمقارنة التحكم مقابل تعامل الخلايا (t(4) = 5.981، P = 0.002). تمثل القضبان ± يعني sem. N = 6. ف < 0.01. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الأنسجة التمثيلية (واحدة نصف الكرة الأرضية) *	نسيج متوسط الوزن (mg)	استخراج المخزن المؤقت (mL)	عدد من السكتات الدماغية
المخيخ الماوس	40	1	40
قشرة أمامي الماوس	30	0.3	20
الحصين الماوس	27	0.3	18
قشرة انتورهينال الماوس	19	0.3	17
* جميع التجارب التي أجريت على الفئران الذكور البالغين.
متوسط العمر: 16 شهرا. متوسط الوزن: 30 غراما.

الجدول 1: الشرط الأمثل لتجانس أنسجة الدماغ.

Discussion

وفي العمل الحالي، أثبتنا أسلوب أمثل لتنقية البروتينات هستون الأساسية وتحديدها كمياً هيستون H3 و H4 بتمس (مثلاً، أسيتيليشن). البروتوكول المقدم هو الأمثل سير عمل شامل الذي يتضمن إجراءات تتعلق بالخلايا وإعداد أنسجة المخ، والخام شطف تنقية هستون، وهطول الأمطار هيستون مفصلة، والتقدير الكمي، التي تليها التفريد هيستون والكمي PTM هيستون قوية. كمية كبيرة من التفاصيل المقدمة هنا يسمح لجيل قابل للنسخ المتماثل من بيانات عالية الجودة، على الرغم من الحاجة إلى التلاعب مطولة من عينات هيستون.

تتطلب العديد من البروتوكولات المنشورة حاليا الاستخدام [هبلك] لعزل الكسور نقية histones H3 و H4¹⁹. على الرغم من أن [هبلك] تقنية قوية، التعقيد ومنخفضة الإنتاجية ردع معظم علماء البيولوجيا الجزيئية ونونيكسبيرتس من الاستخدام المتكرر. وفي الواقع، [هبلك] لا تتوفر للعديد من مختبرات، ومطلوب من الأفراد ذوي المهارات العالية تشغيل الأجهزة. [هبلك] في كثير من الأحيان مضيعة للوقت ومكلفة، ويحتمل أن تكون خطرة. قدم هنا هو استراتيجية غير مكلفة، ومتوسط الإنتاجية لتحقيق نتائج ذات نوعية مماثلة الذي يتجاوز [هبلك]. الاستراتيجية التي تم الإبلاغ عنها أيضا أكثر عملية ومناسبة للاستخدام في أي مختبر كما أنه يستخدم نهجاً عمود دوران بسيط التي لا تتطلب مهارات عملية صك المتخصصة. بالإضافة إلى ذلك، يتم استخراج هيستون H3/H4 تيترامير كواحد، نقية، وكسر وفيرة، مما يتيح إجراء تقييم كمي موثوق بتمس يتم الحفاظ عليها في كل من البروتينات.

بتمس حساسة للغاية للتغييرات في الأكسدة، والتغيرات في درجة الحموضة^20،21. وهكذا، على النقيض من الأساليب المنشورة سابقا¹⁸، نحن تقرير استراتيجية فعالة الشطف خلايا خالية من المصل وسائل الإعلام لضمان اضطرابات ايضية الحد أدنى من الخلايا وتجنب تدخل بتمس الأصلية مع مكونات المصل. البروتوكول الحالي لا يتجاوز عزلة نويات التقليدية بل أيضا يوفر الأوقات المثلى لتحلل الخلية والإجراء تجانس النسيج الدقيق الذي يسمح للحفاظ على المغلف النووية مع تجنب التراكم النووي. على الرغم من أن يمكن التلاعب بها وقت استخراج استناداً إلى العدد من الخلايا، نوع الخلية المستخدمة، وحجم الأنسجة، إلخ، تحلل الموسعة غير مرغوب فيه كما أنها قد تؤدي إلى تحلل أنوية والإفراج عن الحمض النووي، مما يجعل من الصعب على التعامل مع العينة. الأهم من ذلك، توجد نقاط تفتيش متعددة ضمن البروتوكول للتحقق من الصحة لتنقية هيستون الناجحة (مثلاً، خطوات 2.7 و 3.2.3). وتسهل هذه الاستراتيجية أيضا استكشاف الأخطاء وإصلاحها طوال الإجراءات المطولة.

ميزة أخرى هامة وفريدة من نوعها للبروتوكول المقدم هو توافقه الكامل مع أدوات تحليل لطخة غربية المصب والبعض الآخر إذا رغب في ذلك. ويتم الكشف عنها في ~ 15 كاتشين^13،،من²²²³ البروتينات هستون، وبالمثل لغيرها من البروتينات صغيرة الوزن الجزيئي، وقد أثبتت تحديا للكشف عن طريق التقنيات القياسية immunoblotting. يسمح استخدام نظام نقل ذات الأداء العالي والفائق في تركيبة مع الجل البروتين القرار الأمثل للحفاظ على النشاط في غياب الحزب الديمقراطي الصربي ونقل عالية الكفاءة وتأكيد البروتين الأصلي (في غياب الحزب الديمقراطي الصربي) من البروتينات هستون الوزن الجزيئي المنخفض، وبالتالي ضمان إجراء تقييم كمي PTM هيستون موثوق بها.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microcentrifuge tubes	ThermoFiser Scientific	05-408-129	or equivalent from other sources
Sterile water	Gibco	15-230-204	or equivalent from other sources
70% perchloric acid	Sigma Aldrich	311421	or equivalent from other sources
100% acetone	Sigma Aldrich	270725	or equivalent from other sources
pH-indicator strips, non-bleeding	Milliipore Sigma	1095310001
4x SDS sample buffer	BIO-RAD	161-0747
Benchtop rotor	Cole-Parmer	UX-04397-34	or equivalent from other sources
1.5 mL tube rack	ThermoFiser Scientific	05-541	or equivalent from other sources
Histone purification mini kit	Active Motif	40026	spin columns included in the kit
Protease Inhibitor Cocktail	ThermoFiser Scientific	78430	or equivalent from other sources
Nanodrop instrument	ThermoFiser Scientific	ND-2000
Tissue culture dishes	VWR	10062-880	required for histone extraction from cultured cells
Tissue culute media	varies based on cell line used	varies based on cell line used	required for histone extraction from cultured cells
Low-serum media	ThermoFiser Scientific	51985091	required for histone extraction from cultured cells
Plastic cell scraper	Falcon	353086	required for histone extraction from cultured cells
SDS-PAGE gradient gel	BIO-RAD	456-9035	required for histone extraction from cultured cells
Coomassie Brilliant Blue R-250 Staining Solution	BIO-RAD	1610436	required for histone extraction from cultured cells
Coomassie Brilliant Blue R-250 Destaining Solution	BIO-RAD	1610438	required for histone extraction from cultured cells
Trans-Blot Turbo Mini PVDF Transfer Packs	BIO-RAD	1704156	required for histone extraction from cultured cells
Trans-Blot Turbo Transfer System	RIO-RAD	1704150	required for histone extraction from cultured cells
Ponceau S stain	CellSignalling	59803S	required for histone extraction from cultured cells
Dounce homogenizer (size/cap sc 7mL) with a small size clearance	Kimble Chase	885302-0007	required for histone extraction from tissues
100% bleach	Clorox	68973	required for histone extraction from tissues
H4K12ac antibody	Active Motif	39166	required for PTMs quantification via WB
H3K27ac antibody	Active Motif	39134	required for PTMs quantification via WB