والرزن موائع جزيئية "تقييم التصاق الكريات البيض" إلى "خلايا بطانية" المستمدة من "الخلايا الجذعية Pluripotent التي يتسبب فيها الإنسان" (هيبسك-ECs)

Summary

يوفر هذا البروتوكول خطوة بخطوة وصفاً مفصلاً للإعداد التجريبية وتحليل البيانات لتقييم استجابات التحريضية في ECs هيبسك والتحليل لالتصاق الكريات البيض تحت تدفق الفسيولوجية.

Abstract

خلايا بطانية (ECs) ضرورية لتنظيم الردود الملتهبة بالحد أو تسهيل تجنيد الكريات البيض في الأنسجة المتأثرة عن طريق سلسلة جيدا تتسم مستقبلات المؤيدة مادة لاصقة وأوبريجولاتيد على سطح الخلية الكريات البيض على الزناد التحريضية. ردود تحريضية تختلف بين الأفراد في السكان والخلفية الوراثية يمكن أن تسهم هذه الاختلافات. الخلايا الجذعية البشرية المستحثة pluripotent (هيبسكس) أظهرت أن تكون مصدرا موثوقاً ل ECs (هيبسك-ECs)، مما يمثل مصدر غير محدود من الخلايا التي تعكس الهوية الوراثية وأي المتغيرات الجينية أو الطفرات للجهات المانحة. ولذلك يمكن استخدامها هيبسك ECs لنمذجة ردود التهاب في الخلايا الخاصة بالجهات المانحة. يمكن على غرار الردود الملتهبة بتحديد التصاق الكريات البيض إلى هيبسك ECs تحت تدفق الفسيولوجية. يوفر هذا البروتوكول خطوة بخطوة وصفاً مفصلاً للإعداد التجريبية وتحليل البيانات لتقييم استجابات التحريضية في ECs هيبسك والتحليل لالتصاق الكريات البيض تحت تدفق الفسيولوجية.

Introduction

التهاب يلعب دوراً محوريا في العديد من الحالات المرضية، بما في ذلك القلب والأوعية الدموية واضطرابات الأعصاب والإنتان والردود السلبية للمخدرات (تقييمات). خلايا بطانية (ECs) تلعب دوراً أساسيا في تنظيم استجابات التحريضية عبر استحثاث المستقبلات المؤيدة لاصقة، مثل التصاق سيليكتين ه، وبين الخلايا جزيء-1 (ICAM-1) وخلايا الأوعية الدموية التصاق جزيء-1 (VCAM-1) على سطحها ^{1 , 2}-ECs ميكروفاسكولار في أنسجة مختلفة من المعروف أن يحمل عدم التجانس في ردود تحريضية^3،4. وعلاوة على ذلك، قد يؤدي الخلفية الجينية أو بعض الأمراض الوراثية في الفروق في الاستجابات التحريضية بين الأفراد؛ ولذلك من المهم للوصول إلى ECs من مختلف الأفراد. أكثر مؤخرا, البشرية المستحثة pluripotent الخلايا الجذعية (هيبسكس)⁵، التي يمكن أن تستمد من أي فرد، وعرضت لتكون بمثابة مصدر موثوق والمتجددة ECs^6،،من^{78، 9}-ولذلك، تقييم الاستجابات التحريضية وتجنيد الكريات البيض في ECs هيبسك هو قيمة، ليس فقط لوضع نماذج لبعض الاضطرابات الوراثية، بل أيضا لتوفير مؤشرات التباين بين الأفراد واستخدامها كأداة ل شخصية الطب في المستقبل.

فحوصات تدفق توفر أداة مفيدة لدراسة التفاعل غشائي الكريات البيض. التقدم في مجال أجهزة موائع جزيئية تمكين استنساخ ظروف تدفق السوائل الفيزيولوجية مع مراقبة دقيقة لمستويات الإجهاد القص الخاصة بسرير الأوعية الدموية. تصوير الحية يتيح رصد سلسلة الأحداث لالتقاط الكريات البيض، المتداول، والزحف، والالتصاق والتهجير. تم وضع عدة فحوصات تدفق لدراسة التفاعل غشائي الكريات البيض، بيد أنهم جميعا الاستفادة من الابتدائي ECs^10،،^،من^1112،13. هنا، ونحن سوف تصف بالتفصيل التحليل لتقييم التصاق الكريات البيض البشرية إلى ECs هيبسك تحت تدفق الفسيولوجية. في هذا الإجراء، يصف لنا الظروف الأمثل للتحفيز هيبسك-المفوضية الأوروبية مع المحفزات برو التحريضية، مثل عامل نخر الورم ألفا (TNFα)، الانفصال، البذر في رقاقة موائع جزيئية مع ثماني قنوات موازية. وصف بروتوكول خطوة بخطوة التروية ECs هيبسك مع تعليق الكريات البيضاء المسمى فلوريسسينتلي في رقائق موائع جزيئية، نعيش تصوير الخلية والآلي عد الكريات البيضاء ملتصقة.

هذا البروتوكول مفيدة لتقييم استجابات التحريضية في ECs هيبسك في فحص المخدرات والنمذجة المرض ويشخص الطب التجديدي.

Protocol

1-إعداد الحلول والمواد الكاشفة

1. إعداد كاملة المتوسطة البشرية اندوثيليال-الإدارة المستدامة للغابات (EC-الإدارة المستدامة للغابات كامل) عن طريق إضافة المصل المستمدة من البلازما الصفائح الدموية-الفقراء (1%)، وعامل النمو تنتجها الخلايا الليفية الأساسية (بفجف، 20 نانوغرام/مل) وعامل نمو الأوعية الدموية غشائي (VEGF، 50 نانوغرام/مل) للبشرية اندوثيليال-الإدارة المستدامة للغابات (انظر الجدول من المواد). تصفية المتوسطة من خلال عامل تصفية 0.22 ميكرومتر المسامية وتخزينها عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين.
2. إعداد كاملة ربمي المتوسطة عن طريق إضافة المصل البقري الجنين (10%)، 2-mercaptoethanol (0.05 نانومتر)، لام الجلوتامين (1%)، البنسلين والستربتوميسين (25 U/mL) إلى متوسط ربمي (انظر الجدول للمواد). تخزين عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 3 أسابيع.

2-طلاء موائع جزيئية رقائق

1. ضع biochip عقيمة إلى طبق بتري معقم 10 سم.
2. إعداد فيبرونيكتين العامل الحل بإعادة تشكيل الحل الأسهم في مخزنة الفوسفات المالحة (PBS) دون Ca^{2 +}/Mg^{2 +} لتركيز نهائي من 50 ميكروغرام/مل. تقدير ميليلتر 80 من حل العامل الواحد biochip.
3. ضخ 10 ميليلتر فيبرونيكتين العامل الحل في كل قناة بيوتشيب. استخدام ماصة صغيرة 10 نصائح ميليلتر وتأكد من تكوين اتصال ضيق بين مدخل القناة ونصيحة ماصة (الشكل 1، يسار).
4. أغلق غطاء صحن بتري تحتوي على بيوتشيب ووضعه في دائرة هوميديفيد (الشكل 2). تخزين الدائرة في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها. يرطب الدائرة، ضع ورقة نظيفة بالانسجة في الجزء السفلي من الدائرة هوميديفيد وإضافة 5 مل من العقيم ح₂o.
5. وفي اليوم التالي قبل المقايسة، قبل الحارة biochip في 37 درجة مئوية في الحاضنة.

3-إعداد ECs هيبسك

ملاحظة: في البروتوكول هو موضح هنا، ECs هيبسك كانت متباينة وتنقيته، cryopreserved وإذابة كما هو موضح سابقا⁸.

1. ذوبان الجليد ولوحة هيبسك-ECs في المفوضية الأوروبية-الإدارة المستدامة للغابات كاملة "كاملة" في واحد المغلفة بالجيلاتين 0.1% قارورة T75، قبل ثلاثة أو أربعة أيام المقايسة.
2. الليلة قبل الفحص، حفز ECs هيبسك مع TNFα بإضافة "كامل" EC-الإدارة المستدامة للغابات وتستكمل مع 10 نانوغرام/مل TNFα واحتضان بين عشية وضحاها (ح ~ 12) عند 37 درجة مئوية، كما هو موضح سابقا ⁷.

4-هيبسك-ECs الانفصال واستمطار في رقاقة موائع جزيئية

1. في يوم المقايسة، تأخذ قارورة من هيبسك-ECs من الحاضنة وفحص الخلايا تحت المجهر. ضمان هيبسك ECs روافد 80 – 100% وقد مورفولوجيا المفوضية الأوروبية مثل نموذجي.
2. نقل قارورة إلى هود ثقافة الخلية.
3. نضح المتوسطة من قارورة من هيبسك-ECs.
4. باختصار يغسل ثقافة الخلية بإضافة 10 مل من برنامج تلفزيوني دون Ca^{2 +}/Mg^{2 +}. نضح في برنامج تلفزيوني.
5. إضافة 4 مل في قارورة إنزيم تفارق 1 x. احتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT) (الشكل 1B).
6. التوقف عن رد فعل الانفصال بإضافة 8 مل متوسطة البشرية اندوثيليال-الإدارة المستدامة للغابات في قارورة. بلطف فصل وجمع تعليق هيبسك-ECs في أنبوب مخروطي 15 مل باستخدام ماصة 5 مل.
7. حساب إجمالي عدد الخلايا في التعليق.
8. الطرد المركزي الخلايا في 300 x ز لمدة 3 دقائق في الرايت
9. نضح المادة طافية وريسوسبيند بيليه الخلية في "كامل" EC-الإدارة المستدامة للغابات إلى تركيز نهائي 1.5 × 10⁷ خلايا/مل.
10. تأخذ بها طبق بيتري مع biochip من الحاضنة ونقلها إلى هود ثقافة الخلية.
11. نضح الحل فيبرونيكتين من جميع القنوات لرقاقة موائع جزيئية.
12. حقن ميليلتر 6 تعليق خلية في كل قناة باستخدام ماصة مع تلميح صغير 10 ميليلتر (الشكل 1، الأوسط). تأكد من أن تعليق خلية يختلط جيدا قبل الحقن وتجنب خلية هطول الأمطار.
13. دراسة biochip تحت المجهر وضمان انتظام توزيع الخلايا، ومرتفع الكثافة الخلية (الشكل 2).
14. احتضان بيوتشيب لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
15. إضافة 40 ميليلتر الكامل EC-الإدارة المستدامة للغابات في خزانات متوسطة من كلا الجانبين لكل قناة.
16. احتضان biochip ح 1 في 37 درجة مئوية (الشكل 1، حق).
17. إضافة آخر ميليلتر 50 "كامل" EC-الإدارة المستدامة للغابات في الخزانات من كلا الجانبين لكل قناة.

5-إعداد الكريات البيضاء البشرية

ملاحظة: واستخدمت في البروتوكول هو موضح هنا، خط خلية مونوسيتيك متوفرة تجارياً (THP-1). وبدلاً من ذلك، يمكن استخدام خلايا الدم المحيطية وحيدات النوى أو العَدلات. يمكن تنفيذ عزل وحيدات الدم المحيطي والعدلات باستخدام الإجراء القياسي¹¹. تنفيذ كافة الخطوات المذكورة في هذه الفقرة في غطاء ثقافة خلية.

1. جمع في الكريات البيضاء في أنبوب 50 مل مخروطية الشكل.
2. أغسل الكريات البيضاء مع 10 مل من برنامج تلفزيوني دون Ca^{2 +}/Mg^{2 +}. الطرد المركزي الخلايا في 300 x ز لمدة 3 دقائق في الرايت (الشكل 1).
3. نضح المادة طافية وريسوسبيند بيليه الخلية في 1 مل من برنامج تلفزيوني مع صبغة DiOC6 (λ_ت = 485 نانومتر، λ_م = 501 nm) (1:5، 000). احتضان الخلايا في الظلام لمدة 10 دقائق في الرايت
4. أغسل الكريات البيضاء مع 10 مل من برنامج تلفزيوني دون Ca^{2 +}/Mg^{2 +}. الطرد المركزي الخلايا في 300 x ز لمدة 3 دقيقة في الرايت تكرار الخطوة الغسيل مرة أخرى.
5. حساب إجمالي عدد الخلايا في التعليق.
6. نضح المادة طافية وريسوسبيند بيليه خلية في المتوسط ربمي كاملة إلى تركيز نهائي 2.5 × 10⁶ خلايا/مل.

6-إعداد المضخة موائع جزيئية

1. تجميع مضخة موائع جزيئية مع المتشعبة 8 قنوات.
2. قم بتوصيل المضخة جهاز كمبيوتر مع برامج التشغيل المثبتة.
3. بدء تشغيل البرنامج موائع جزيئية وتحميل البروتوكول بواسطة النقر فوق بروتوكول مفتوحة والتنقل على جهاز الكمبيوتر لتحديد البروتوكول موائع جزيئية.
4. الاتصال البرنامج والمضخة بتحديد مجلد الإعداد ثم النقر فوق تشغيل الخطوة المقايسة.
5. تعريف هندسة القنوات لمراقبة معدل التدفق الصحيح: حدد هندسة التحديث في مجلد هندسة الإعداد وانقر فوق تشغيل الخطوة المقايسة.
   ملاحظة: تأكد من تطابق تفاصيل هندسة المحاقن وقنوات لاستخدامها (معرف الهندسة = 1، عدد القنوات = 8، عرض قناة = 800.0 ميكرومتر، عمق القناة = 120.0 ميكرومتر، حجم حقنه = 250 ميليلتر) ولزوجة العينة (اللزوجة السائلة = 1.0).
6. تغسل المضخة عن طريق وضع مدخل الكابل (اللون البرتقالي) في أنبوب 50 مل مخروطية تحتوي على الإيثانول 80%. ضع كابل منفذ (الأخضر) في أنبوب فارغ المخروطية 50 مل (حاوية النفايات).
7. حدد المجلد تبييض تبييض/مضخة ، وانقر فوق تشغيل الخطوة المقايسة (يغسل وحدة التخزين = ميليلتر 2000، خطوة حجم الغسيل = 250 ميليلتر، اتجاه تبييض = الإخراج). كرر الخطوة الغسيل مرة أخرى.
8. كرر المضخة الغسيل الخطوات (خطوات 6.6 – 6.7) مع خلية ثقافة الصف المياه، والمتوسطة الثقافة البشرية اندوثيليال-الإدارة المستدامة للغابات.
9. استمر في الخطوة الغسيل المشعب.
10. يدوياً فتح الصمام بين المحاقن والمتشعبة بوضع محول 3-الطريق إلى الموضع الصحيح (مؤشر قيد إيقاف التشغيل إلى اليسار).
11. حدد الخطوة القناة الحالية مجموعة/فتح في مجلد يغسل تبييض/متعددة ثم انقر فوق تشغيل الخطوة المقايسة لفتح جميع الصمامات المتعددة.
12. أغسل المتشعبة يدوياً عن طريق دفع 5 مل إيثانول 80% من المحاقن، تليها 5 مل من خلية ثقافة الصف المياه.
13. أغسل المتشعبة بدفع 5 مل متوسطة الثقافة البشرية اندوثيليال-الإدارة المستدامة للغابات من المحاقن.
14. قم بإزالة جميع فقاعات الهواء الكبيرة التي محاصرون في المتشعبة. للقيام بذلك، وضع المحول دبوس 8-جيدا في 10 سم من طبق بيتري مع المتوسط وتنفيذ دفع/سحب مع المحاقن حتى ولت جميع فقاعات الهواء الكبيرة (فقاعات صغيرة ليست مشكلة).
15. حدد الخطوة القناة الحالية مجموعة منغلقة في المجلد يغسل تبييض/متعددة ثم انقر فوق تشغيل الخطوة المقايسة لإغلاق جميع الصمامات المتعددة.
16. قم بتوصيل كبل منفذ الخضراء من المضخة للمحول المتشعبة.
17. تبديل صمام ثلاثي مرة أخرى إلى الوضع OFF لإغلاق المحاقن.
18. حدد مجلد تبييض تبييض والكبل وانقر فوق تشغيل الخطوة المقايسة لغسل كل منفذ مع المتوسطة ربمي منفردة، ضمان أن يتم إزالة جميع فقاعات من كل كبل (الاستغناء عن حجم = 100 ميليلتر).
    ملاحظة: كل صمام المشعب فتحت واحداً تلو الآخر، وهو الاستغناء عن 1 إلى 8، و 100 ميكروليتر من المتوسط من خلال كل القنوات الفردية بينما الحفاظ على قنوات أخرى مغلقة. تأكد من أن السائل يعمل من كل طرف. إذا لم يكن هناك لا سائل يخرج، أنها مؤشرا على فقاعة هواء أو تسد.

7-إعداد رقاقة موائع جزيئية للعيش التصوير

1. تأكد من أن الأجهزة موائع جزيئية على استعداد، وقاعة التصوير الحي متوازن مسبقاً إلى 37 درجة مئوية، ويصل مستوى CO₂ إلى 5% (الشكل 3 أ، ب).
2. تتخذ في biochip من الحاضنة ووضعه في حامل شريحة المجهر. جبل صاحب الرقائق في المجهر التصوير المرحلة (الشكل 3).
3. بغية الاتصال biochip المضخة عن طريق المتشعبة، وضع المحول 8-دبوس قريبة من الخزانات منفذاً للرقاقة وتعميق كافة أطراف في الأجل المتوسط (لكن لا تقم بتوصيل تماما).
4. حدد تبييض | الاتصال برقاقة المجلد، وانقر فوق تشغيل الفحص خطوة الاستغناء عن المتوسطة ربمي قبل الاتصال الرقاقة (الاستغناء عن حجم = 30 مل). متى يتم الاستغناء عن المتوسط، إدراج المحول 8-دبوس في مخرج biochip.
   ملاحظة: أثناء هذه الخطوة، يتم تعيين كافة القنوات إلى على (فتح) وهو الاستغناء عن 30 ميليلتر من المتوسط من خلال كل القنوات وبعد ذلك يتم تعيين القنوات إلى Off (مغلقة). وهذا ما يضمن أن لا يوجد هواء فقاعات سيدخل قنوات رقاقة موائع جزيئية.
5. يدوياً نضح المتوسطة من كل مدخل الخزانات من biochip مع ماصة.
6. حدد تبييض | رقاقة تبييض المجلد، وانقر فوق تشغيل الخطوة المقايسة نتخلل 40 مل متوسطة "كامل" EC-الإدارة المستدامة للغابات من خلال كل القنوات واحداً تلو الآخر للتخلص من الخلايا الميت/الحطام من القناة (حجم تبييض = 40 ميكروليتر، القص تبييض الحد الأقصى = دينيس 40/سم²).

8-تدفق التصاق المقايسة والتقاط صور

1. يدوياً نضح المتوسطة من الخزان مدخل القناة للفائدة مع ماصة.
2. إضافة 100 ميليلتر من الكريات البيضاء من 5.6 خطوة إلى الخزان مدخل القناة للفائدة.
   ملاحظة: بلطف مزيج من الخلايا لجعل تعليق خلية واحدة.
3. في مقايسة خلية | وصف الخطوة المجلد، حدد وصف القناة الحالية مجموعة/خطوة ، وفي قائمة القنوات، حدد فقط القناة الحالية للفائدة و على (فتح) تعيين إلى وجميع القنوات السبعة الأخرى إيقاف (مغلقة).
4. حدد فحص الخلية | وصف الخطوة المجلد، وانقر فوق تشغيل الخطوة المقايسة.
   ملاحظة: تأكد من أن متغير تدفق معدل الاستغناء عن تطبيق الضغط السلبي المستمر لسحب تعليق الكريات البيض من مدخل الخزان من خلال القناة لمدة 5 دقائق (القص مجموعة = ثابت، إجهاد القص =-0.50 داين/سم²، المدة = 00:05:00، مسح تأخير = 00:00:00). القيمة السالبة لإجهاد القص تضمن الاتجاه الصحيح للتدفق.
5. نضح الكريات البيضاء المتبقية من مدخل الخزان.
6. إضافة 100 ميليلتر الكامل ربمي المتوسطة إلى مدخل الخزان. حدد مجلد وصف خلية التحليل/الخطوة ثم انقر فوق تشغيل الخطوة المقايسة نتخلل القناة لمدة 5 دقائق مع المتوسطة ربمي أجل تغسل جميع الكريات البيضاء غير ملتصقة (القص مجموعة = ثابت، إجهاد القص =-0.50 داين/سم²، المدة = 00: 05:00، وتأخير تفحص = 00:00:00).
7. الحصول على الصور من مواقع مختلفة على الأقل ثلاثة أو أربعة من قناة لصورة الكريات البيضاء الالتزام بها (للتأكد من أن المساحات التي تم التقاطها).
8. كرر الخطوات من 8.1 – 8.7 التقييم الوظيفي لجميع ما تبقى من القنوات.
   ملاحظة: من الممكن لتشغيل قنوات متعددة في وقت واحد. للقيام بذلك، قم بفتح جميع القنوات للفائدة خلال 8.3 خطوة. وأداء جميع 8.4 الخطوات المذكورة أعلاه –8.7 لقنوات متعددة للفائدة.

9-استكمال الفحص وتنظيف المضخة موائع جزيئية

1. بعد الانتهاء من هذه التجربة، تصدير وحفظ كافة الصور بتنسيق RAW.
2. أثناء حفظ النتائج، قم بتشغيل المضخة موائع جزيئية والمتشعبة التنظيف البروتوكول.
3. للمضخة موائع جزيئية، تشغيل المجلد تبييض تبييض/مضخة أولاً قبل بيرفوسينج 4 مل من خلية ثقافة الصف المياه، تليها 4 مل من 80 ٪ الإيثانول كما هو موضح في الخطوات 6.6 – 6.7 الجاف المضخة عن طريق تشغيل الهواء لعدة دقائق.
4. من أجل تنظيف المتشعبة، تشغيل الخطوة يغسل تبييض/متعددة مع المحاقن. اتبع الخطوات لفتح المحاقن والصمامات المتعددة كما هو موضح في الخطوات 6.10 – 6.11 يغسل أولاً مع الإيثانول 80% والقادم مع خلية ثقافة الصف المياه. الجافة المتعددة عن طريق دفع الهواء عن طريق المحاقن. إغلاق صمام المحاقن والصمامات المتعددة كما هو موضح في الخطوات 6.10 و 6.15.

10-عد الكريات البيضاء ملتصقة

1. تحميل وتثبيت الصورة تجهيز البرمجيات¹⁴ من http://cellprofiler.org.
   ملاحظة: تم إجراء معالجة الصور في هذه الدراسة باستخدام البرمجيات الإصدار 2.1.1. في حالة استخدام إصدار أحدث، قد تتطلب خط أنابيب التكيف طفيفة.
2. تحميل خط الأنابيب Count_leukocytes.cpipe. انقر فوق الملف | الاستيراد | أنبوب من الملف والتنقل على الكمبيوتر لاختيار خط الأنابيب Count_leukocytes.cpipe.
3. السحب والإفلات مجلد مع صور RAW المكتسبة من الكريات البيضاء ملتصقة إلى الإطار قائمة الملف في وحدات الإدخال | صور قسم للتحليل.
4. تحديد حجم نموذجي من الكريات البيضاء عن طريق وحدات التحليل | إيدينتيفيبريماريوبجيكتس. تحديد الحد الأدنى والأقصى قطر الكريات البيضاء ملتصقة بكسل.
5. حدد معايير التصفية عن طريق وحدات التحليل | فيلتيروبجيكتس. تحديد منطقة الحد الأدنى المقبول من الكائنات في بكسل.
6. ابدأ التحليل عن طريق الضغط على زر تحليل الصور .
   ملاحظة: ستتم معالجة جميع الصور الخام، وسيتم حفظ النتائج في مجلد إخراج افتراضي. يحتوي ملف الإخراج Image.txt على عدد الكريات البيضاء ملتصقة في كل صورة المجهزة (كل رقم يناظر صورة واحدة، أي كل المكتسبة من عرض الحقل).

النتائج

كما سبق وصف استجابة ECs هيبسك للتحفيز مع وكيل برو-التهابات ينبغي دراسة TNFα، لأول مرة،⁷. علاج TNFα ح 12 مشغلات upregulation سيليكتين ه مع الذروة في ح 6 بعد بدء العلاج. بالإضافة إلى ذلك، هو المتكاملة-1 أوبريجولاتيد ح 6-12 بعد العلاج. على الرغم من أننا لم يلاحظ upregulation المتوقعة VCAM-1، عادة ما لوحظ في خلايا بطانية الوريد السري البشري الأساسي (هوفيكس). ووجدنا العلاج TNFα (ح 12) بين عشية وضحاها لتكون أكثر ملاءمة للمقايسة التصاق الكريات البيض.

ينبغي أن يؤدي تفكك ECs هيبسك الأمثل في تعليق خلية واحدة خالية من كتل الخلية. ويوضح الشكل 2 الكثافة المثلى هيبسك-المفوضية الأوروبية الحق بعد حقن. بشكل عام، 15 دقيقة بعد الحقن، ECs هيبسك نعلق على الجزء السفلي من القناة وبدء انتشار (الشكل 2D). ح 1 بعد الحقن، هيبسك-ECs تشكل أحادي الطبقة جيدا منتشرة على طول القناة، وستكون مستعدة للشروع في تحليل تدفق (الشكل 2E).

وسم من الكريات البيضاء مع الراسم الفلورسنت مفيد للمرحلة الآلي صور التباين في تقدير حجم الصورة، كما أنه يجعل خطوة تحديد الخلية أسهل، خاصة وأن تلتزم الكريات البيضاء أحادي الطبقة ال ECs وغالباً ما يصعب للبرمجيات للتمييز بين أنواع مختلفة من الخلايا.

برامج معالجة الصور المفتوحة المصدر المجانية مفيد جداً للتحديد الكمي الآلي للكريات البيضاء ملتصقة. خط الأنابيب المبينة في البروتوكول هنا يستند إلى تعريف الكائن الأساسي باستخدام مستوى العتبة التكيفية من صور مضيئة من الكريات البيضاء (الشكل 4 أ). التصفية لتحديد الكائنات التي تستند إلى منطقة الحد أدنى بالإضافة إلى ذلك بتصفية الكائنات المحددة زورا، مثل الحطام خلية أو أوتوفلوريسسينسي أو أي أخرى غير محددة الفلورسنت إشارة (الشكل 4 ج، د).

رقاقة موائع جزيئية واحدة مع ثماني قنوات متوازية يتيح المقارنة بين فريقين مستقلين، على سبيل المثال، يميز ECs من هيبسكس المستقلة، مثل المانحين صحي أو المرضى الذين يعانون من الاضطرابات الوراثية. عناصر تحكم إضافية، مثل ECs غير المعالجة أو المعالجة المسبقة مع جسم حظر المتكاملة-1 يمكن إدراجها ك جيدا^10،11. يمكن معالجة رقائق موائع جزيئية اثنين إلى ثلاثة في وقت واحد. لمتانة الاستنتاجات، يوصي بالحد ني تجارب البيولوجية المستقلة الثلاثة يؤديها الأيام المستقلة.

الشكل 1 : إعداد هيبسك ECs والكريات البيضاء لتحليل تدفق. (أ) المعالجة المسبقة ل ECs هيبسك مع حافز برو التحريضية (TNFα). (ب) التمثيل التخطيطي ECs هيبسك الانزيمية الانفصال، والطرد المركزي، واستثارة. (ج) التمثيل التخطيطي لطلاء من القنوات (ج، اليسار)، الحقن بتعليق هيبسك-الجماعة الأوروبية (ج، الأوسط) وخلية إضافة الثقافة المتوسطة بعد الإلحاق ECs هيبسك في رقاقة موائع جزيئية. (د) التمثيل التخطيطي لخطوة الغسيل الكريات البيض، وسم بصبغة الفلورسنت DiOC6 واستثارة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 2 : رقاقة موائع جزيئية مع ECs هيبسك. رقاقة موائع جزيئية (A) في 10 سم طبق بيتري. (ب) استخدام قاعة هوميديفيد للحضانة. (ج، د، ه) صور الممثل من هيبسك-ECs في موائع جزيئية قناة 0 دقيقة (ج) 15 دقيقة (د)، ح 1 (ﻫ) بعد الحقن. شريط المقياس = 200 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 3 : إعداد تجريبية للمقايسة نضح التصوير والكريات البيض في الخلية الحية- (أ وب) تمثيل الصورة (A) والتخطيطي (ب) للإعداد التجريبية لفحص التصوير وتدفق الخلايا الحية: مضخة موائع جزيئية-مجهر فلوري المقلوب مع المحمل يعيش التصوير الدائرة (5% CO₂, 37 درجة مئوية، هوميديفيد)، (2)-(1)، (3)-8-قناة المتشعبة، (4)-لاكتساب التحكم وصورة المجهر، (5)-جهاز لمراقبة ضخ موائع جزيئية. رقاقة موائع جزيئية (ج) مع الأنبوب المدرج المشعب 8 قنوات ثابتة في حامل لوحة وشنت في المرحلة الميكانيكية من المجهر. (د) التمثيل التخطيطي للخطوات الرئيسية لتحليل تدفق. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 4 : صورة التحليل والكشف الآلي للكريات البيضاء ملتصقة. (أ) الحوار نافذة الصورة تجهيز البرنامج مع الإعدادات المحددة للتعرف على الكريات البيضاء. المعايير (ب) إطار الحوار برامج معالجة الصورة مع التصفية المحددة للكائنات التي تم تحديدها على أساس الحد الأدنى المقبولة المساحة السطحية (SA_دقيقة = 70 px). (ج) مثال لتحديد الهوية الصحيحة من الكريات البيضاء وتصفية الكائنات غير محددة من مساحة صغيرة (SA) (القطر النموذجي في بكسل (دقيقة, ماكس) = (9، 15)؛ تصفية معايير SA_دقيقة = 70 px). يصور الأشياء المقبولة باللون الأخضر ويصور الكائنات المهملة في الأشعة فوق البنفسجية. (د) مثال على تعريف غير صحيح من الكريات البيضاء بسبب النطاق غير صحيحة للقطر النموذجي (القطر النموذجي في بكسل (دقيقة, ماكس) = (3، 15)؛ تصفية معايير SA_دقيقة = 70 px). يصور الأشياء المقبولة باللون الأخضر ويصور الكائنات المهملة في الأشعة فوق البنفسجية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Discussion

ويصف هذا البروتوكول وصف العلاج هيبسك-المفوضية الأوروبية مع المحفزات برو التحريضية، مثل TNFα، تقييم وظيفي لالتصاق الكريات البيض إلى هيبسك-ECs في تحليل تدفق استخدام التصوير الحي والعد الآلي من الكريات البيضاء ملتصقة.

النتائج بين عشية وضحاها حفز ECs هيبسك مع TNFα في مظهر ممدود تشير عادة النمط الظاهري برو تحريضية المنشط في ECs. خلال مرحلة التحسين، ينصح التعبير ينبغي التحقق من مستويات سيليكتين ه، المتكاملة-1، VCAM-1 من نظام مراقبة الأصول الميدانية^7،8, والوريد السري البشرية الأولية ECs (هوفيكس) لإدراجها كعناصر إيجابية.

ينبغي التوصل إلى الانفصال ECs هيبسك الأمثل وبذر الكثافة لتحقيق أحادي الطبقة المتلاقية دون تشكيل كتل الخلايا وقناة قباقيب. من المهم إعادة تعليق حق الكريات البيضاء قبل التروية بغية تجنب ترسيب الخلايا والحفاظ على تركيز ثابت عند المعايرة كل قناة. الكريات البيضاء في الدم المحيطي البشري، مثل وحيدات والعدلات يمكن استخدامها، أو إنشاء خطوط الخلايا مونوسيتيك، مثل THP-1 أو HL-60 يمكن أن تستخدم كبديل.

أثناء الجمعية العامة للإعداد موائع جزيئية وأثناء تحليل التدفق، من المهم للحيلولة دون الوقوع في موائع جزيئية الأنابيب والقنوات كما أنها يمكن أن ينتج المفرزة من ECs هيبسك و/أو الكريات البيضاء ملتصقة فقاعات الهواء. واجهة السائل للسوائل أو إدراج الخطوات الإضافية الغسيل أثناء إعداد الإعداد موائع جزيئية يمكن أن تساعد على منع فقاعات الهواء.

فمن المستحسن أن البروتوكول هو تشغيل اثنين من المشغلين حيث تعد إحدى الخلايا والثاني يعد فحص النظام وتدفق موائع جزيئية. وهذا ما يضمن أن ECs هي مطلي في رقائق موائع جزيئية داخل إطار زمني ثابت قبل تجهيزها، ويحسن من دقة وإمكانية تكرار نتائج نتائج. وبالإضافة إلى ذلك، يسمح ذلك أيضا لإقامة تجارب أعمى لتجنب التحيز في النتائج.

للكشف عن الخلية الناجحة مع الصورة الآلي تجهيز خط الأنابيب، من المهم للحصول على الصور في التركيز مع ارتفاع نسبة إشارة إلى الضجيج وتجنب أوتوفلوريسسينسي كائنات غير محددة، مثل كتل الخلية. من الأهمية بمكان هو مواصفات الصحيح للحدود الدنيا والقصوى لحجم نموذجي من الكريات البيضاء ملتصقة بحاجة إلى تحديد. واحد يمكن تقدير حجم نموذجي من الكريات البيضاء باستخدام أداة قياس خط في إيماجيج. على سبيل المثال، في تحليلنا، قمنا باستخدام المجموعة من 9 – 15 بكسل الذي يتوافق مع حجم الفعلية من 10.3 – 17.1 ميكرومتر (الشكل 4). عند استخدام مجموعة خاطئة، مثلاً، 3 – 15 بكسل (3.4 – 17.1 ميكرومتر)، يتم تعريف من الكريات البيض واحدة ليس كخلية واحدة، ولكن بدلاً من ذلك يتم تحديد المتبقيتان لها ككائنات منفصلة (الشكل 4). هذا يؤدي إلى كاذبة عدد الكائنات تحديدها.

المساحة العديد من الكائنات كثافة منخفضة وأصغر مما قد يكون الكشف عن الكريات البيضاء باستخدام الأسلوب العتبة التكيفية المقدمة. قد يستغرق هذا المكان بسبب أوتوفلوريسسينسي أو أي إشارات مضيئة أخرى غير محددة. ومع ذلك، هذه الكائنات غير محددة، إذا منطقتهم أقل من منطقة نموذجية الكريات البيض واحدة، يمكن تصفية عن طريق تحديد مساحة الحد الأدنى المقبول (الشكل 4).

يسمح تحليل تدفق الموصوفة هنا أنواع التقييم المباشر لالتصاق الكريات البيض إلى أحادي الطبقة المفوضية الأوروبية، توضيح التفاعل بين هذه الخلية اثنين، ولكن لا تأخذ في الاعتبار خلية أخرى أنواع, مثل بيريسيتيس التي موجودة في جدار الأوعية الدموية، وقد يكون أيضا المشاركة في تنظيم الكريات البيض التسرب¹⁵. يمكن تحسين إدماج المكروية ثقافة 3D مع أنواع الخلايا الأخرى أهمية الفسيولوجية للنظام. وعلى الرغم من هذه القيود، يوفر تحليل تدفق لتقييم استجابات التحريضية الموصوفة هنا أداة قيمة لتوصيف الأساسية والمرض تطبيقات النمذجة ECs هيبسك.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Vena8 Endothelial+ biochip	Cellix Ltd	V8EP-800-120-02P10
Mirus Evo Nanopump	Cellix Ltd	MIRUS-EVO-PUMP	1 x syringe pump; 1 x VenaFluxAssay Software; 1 x tubing kit; power supply and cables.
8-channel manifold MultiFlow8	Cellix Ltd	MIRUS-MULTIFLOW8
Humidified box	Cellix Ltd	HUMID-BOX
Fluorescence imaging system Leica AF6000	Leica Microsystems
Electron-multiplying charge-coupled device camera	Hamamatsu	C9100
Biological safety cabinet/laminar flow-hood	Cleanair
CO2 cell-culture incubator	Panasonic	MCO-170AICUV
Centrifuge	Hitachi	himac-CT6EL
Handheld pipetman (P-10 (10 mL), P-200 (200 µL), P-1000 (1,000 µL)	Gilson international	4807 (10µl), 4810 (200µl), 4809 (1000µl)
Sterile plastic pipette	Greiner Bio-One	606180 (5ml), 607180 (10ml)
Petri dish	VWR/ Duran Group	391-0860
Culture flasks (75 cm2)	CELLSTAR	658,170
Centrifuge tube (15 mL)	CELLSTAR	188271
Name	Company	Catalog Number	Comments
Gelatin from porcine skin, type A	Sigma-Aldrich	G1890
Fibronectin (Bovine plasma)	Sigma-Aldrich	F1141
DPBS, no calcium, no magnesium	Life Technologies	14190-169
Human Endothelial-SFM	Life Technologies	11111-044
Human VEGF 165 IS, premium grade	Miltenyi Biotec	130-109-386
Human FGF-2, premium grade	Miltenyi Biotec	130-093-842
Platelet-poor Plasma Derived Serum, bovine	Biomedical Technologies	BT-214
Recombinant Human TNF-α	Tebu-bio	300-01A-A
TrypLE Select	Life Technologies	12563029
DiOC6(3)	Sigma-Aldrich	318426
RPMI 1640 Medium	Life Technologies	21875-034
2-Mercaptoethanol (50 mM)	Life Technologies	31350010
FBS	Life Technologies	10270-106
L-glutamine	Life Technologies	25030-024
Penicillin-Streptomycin (5,000 U/mL)	Life Technologies	15070-063
Distilled water	Life Technologies	15230-089
Ethanol absolute	Merck	1.00983.2500
VCAM-1	R&D systems	FAB5649P
E-Selectin	R&D systems	BBA21
ICAM-1	R&D systems	BBA20
Name	Company	Software version	Comments
Cellrofiler	CellProfiler	2.1.1
VenaFluxAssay Software	Cellix Ltd	2.3.a