مقايسة قتل كروي من خلايا تي السيارة

Summary

ويهدف هذا البروتوكول تقييم إيمونوثيرابيوتيك سيتوتوكسيسيتي تي خلية (سيارة تي خلية) المعاد توجيهها ضد الخلايا السرطانية منظم 3D (الماغنيسيوم) في الوقت الحقيقي.

Abstract

وقد أصبح العلاج المناعي مجال يحظى باهتمام متزايد في مجال مكافحة السرطان وإلا غير قابل للعلاج. من بين جميع الطرق إيمونوثيرابيوتيك، توجيه مستقبلات مستضد تشيميريك (السيارات) خلايا تي الحصول على النتائج الأكثر إثارة، ولا سيما مع سرطان الدم الليمفاوي الحاد ب طب الأطفال (ب-الكل). أساليب التحقق من الصحة الكلاسيكية من خلايا "تي السيارة" تعتمد على استخدام خصوصية وفحوصات وظائف الخلايا T سيارات ضد الخلايا المستهدفة في التعليق وفي نماذج xenograft. ولسوء الحظ، الملاحظات المبداة في المختبر هي غالباً ما تنفصل عن النتائج التي تم الحصول عليها في فيفو ويمكن ادخار الكثير من الجهد والحيوانات بإضافة خطوة أخرى: استخدام الثقافة 3D. ويمثل إنتاج الماغنيسيوم خارج الخلايا المستهدفة المحتملة التي تحاكي بنية ثلاثية الأبعاد للخلايا السرطانية عندما كانوا هم انجرافتيد في نموذج الحيوان بديلاً مثاليا. هنا، نحن تقرير أسلوب بأسعار معقولة وموثوق بها وسهلة لإنتاج الماغنيسيوم من خط خلية القولون ترانسدوسيد كأداة التحقق من صحة للعلاج بالخلايا التبني (يتجلى هنا في خلايا تي سيارة CD19). ويقترن هذا الأسلوب مع نظام تصوير حية متقدمة التي يمكن تتبع نمو كروي، المستجيب الخلايا سيتوتوكسيسيتي وورم الخلايا المبرمج.

Introduction

ويمثل نقل الخلية التبني (قانون) علاج السرطان الجيل القادم. أنها تعتمد على حقن خلايا المستجيب (أو ناغورني كاراباخ-الخلايا التائية) إلى مريض. يمكن أن تكون هذه الخلايا المعدلة وراثيا مع مستقبل التي سيتم توجيهها إلى أهدافها، الورم، وتدميره. وأبدى هذا النهج مؤخرا يكون ممكناً عندما قدم مستقبلات مستضد تشيميريك (سيارة) الموجهة ضد علامة الخلية ب CD19 في خلايا المريض تي لقتل صفحته/صفحتها السرطان¹. في حالة السيارة، ومستقبلات مصطنعة، يتكون من أجزاء جسم معين، على التصميم مستضد ملزمة المجال ينحصر كيان معين واحد في سلسلة جزء متغير (سكفف)، مرتبطة بالمجالات مما يشير إلى خلايا T. على الرغم من أن هناك العديد من التصاميم، الإصدارات الأكثر استخداماً المشار إليها كالجيل الثاني من سيارة التصاميم، وتتألف من CD3z للإشارات تكر والمجال كوستيمولاتوري واحد (CD28، 4-1BB، OX40، إلخ.) ^{1 , 2}-مجال العلاج المناعي الموجه أكثر من اهتمامها بهذا الشكل الجديد من القانون عندما تعامل الخلايا CD19 سيارة تي فعالية العديد من المرضى مع الخلية بالاورام الخبيثة^3،4. بعد هذا النجاح، حاول الباحثون لاستغلال تصاميم مماثلة باستهداف الأخرى [ابيتوبس] للأورام الصلبة نجاحا محدودا. ولسوء الحظ، ندرة الورم المستضدات محددة وميكرونفيرونمينتس الورم أقسى المقدمة "سيارة تي" الخلايا أقل فعالية تجاه الأورام الصلبة⁵.

حاليا، تعتمد استراتيجيات التحقق من الصحة الأكثر استخداماً في المختبر على نظم ثنائية الأبعاد (2D) تلبي سوى جزء من التحديات التي سبق ذكره الأورام الصلبة. كلاسيكي، 2D في المختبر نظم تشمل مزيجاً من الخلايا T سيارات وخطوط خلايا السرطان المستهدفة مونولاييرس لتقييم الأداء الوظيفي وخصوصية هذه الخلايا المستجيب. على الرغم من أن هذه الاستراتيجيات أجزاء هامة وحيوية من الدراسات، أنها لا تأخذ في الاعتبار مورفولوجيا المعقدة وثلاثي الأبعاد (3D) هيكل من خلايا السرطان⁶. الخلايا السرطانية المستزرعة في نظم 3D، المشار إليها الماغنيسيوم، اكتساب الصفات المظهرية الجديدة من خلال أحداث تغييرات في الجينات التعبير الشخصية⁷، التي قد تؤثر على الاعتراف بواسطة خلايا المستجيب المعاد توجيهها. بيرجيرسدوتير وزملاؤه أظهرت أن خط خلية سرطان الغدد الليمفاوية (HL) هودجكن عندما تزرع فقط في نموذج ثلاثي الأبعاد ثقافة يكتسب ملف تعريف تعبير جينات مشابهة ل عينات الورم الرئيسي⁸. ولذلك، الماغنيسيوم أو 3D مماثلة الثقافة عرض المنهجيات ذات الصلة أكثر في نماذج المختبر بدلاً من نظم 2D القياسية. هذه النظم أيضا مشابهة للدراسات المجراة في التي ينظر إليها كخطوة أخيرة في عملية التحقق من الصحة لسيارة معينة. وبالنظر إلى أن تفشل الأنظمة 2D لمحاكاة مورفولوجية مجموعات السرطان، الماغنيسيوم تقدم تشكيلات مماثلة لتقييم الأداء الوظيفي للخلايا T السيارة قبل في النماذج الحية. في دراسة واحدة، بيكل et al. حددت أن نموذج كروي من مستقبلات عامل نمو البشرة البشرية (HER2) أوفيريكسبريسينج الخلايا السرطانية أظهرت الملامح إشارات مماثلة في النماذج الحية⁹. وهذا يدعم كذلك أن الماغنيسيوم تقديم تقييم فيفو تكون أكثر ذات الصلة وانتهاء-إلى-في الخلايا T السيارة. بالإضافة إلى ذلك، قد يساعد التحقق من السيارة تي-خلية ضد الماغنيسيوم تقييم فعاليتها أكثر حاسمة ومنع بعض التصاميم من الانتقال إلى الدراسات المجراة في قبل الأوان¹⁰؛ وبالتالي، المساهمة في البحوث المعنية أخلاقيا بالتضحية بعدد أقل من الحيوانات. وعلاوة على ذلك، بروتوكولات استخدام الماغنيسيوم ليست أغلى من نظم 2D الكلاسيكية وأسرع بكثير بالمقارنة مع الدراسات الكلاسيكية في فيفو . أخذت معا، أحد يستطيع أن يتنبأ أن إدراج دراسات كروي سيصبح قريبا الممارسة القياسية الربط بين الدراسات في المختبر والمجراه.

نقدم هنا، إعداد الماغنيسيوم من خط خلية سرطان القولون 116 كليات التقنية العليا. تم تعديل هذا الخط خلية للتعبير عن الجزيء CD19 البشرية لجعلها حساسة للخلايا T السيارة CD19 وتوفير تقييم واضح لقتل بنية سيارة سريرياً تم التحقق من صحتها باستخدام.

Protocol

1-جيل الماغنيسيوم من خط خلية سرطان القولون والمستقيم

1. مونولاييرس خلية يغسل HCT 116 (ستابلي ترانسدوسيد للتعبير عن الكتلة 19 التمايز (CD19) والبروتينات الفلورية الخضراء (بروتينات فلورية خضراء)) مع الفوسفات مخزنة المالحة (برنامج تلفزيوني؛ 5 مل 25 سم² أو 10 مل لقارورة² 75 سم). إضافة التربسين (0.5 مل 25 سم² أو 1 مل لقارورة² 75 سم)، واحتضان خلايا في 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
2. التحقق من مفرزة الخلية تحت مجهر، وإبطال مفعول إنزيم تفكك الخلية بالكامل روزويل بارك التذكاري معهد 160 المتوسطة (RPMI 1640) (RPMI 1640 + 10% FCS + مع الجنتامايسين؛ 10 مل 25 سم² أو 20 مل لقارورة² 75 سم).
3. إزالة طافية باستخدام ماصة تعليق خلية أجهزة الطرد المركزي في 500 x ز 5 كحد أدنى وريسوسبيند من بيبيتينج صعودا وهبوطاً عدة مرات مع 5 مل من إكمال RPM1 1640 المتوسطة.
4. عد الخلايا باستخدام الاستبعاد تريبان الأزرق في عداد خلية متوافقة.
5. إزالة طافية باستخدام ماصة تعليق خلية أجهزة الطرد المركزي في 500 x ز 5 كحد أدنى وريسوسبيند في المتوسط ربمي للحصول على 5 × 10³ خلايا/مل.
6. نقل تعليق خلية إلى خزان عقيمة والاستغناء عن 200 ميليلتر/بئر إلى 96-فضلا عن جولة أسفل لوحات استخدام ماصة متعددة القنوات.
7. نقل اللوحة إلى جهاز التصوير الآلي داخل حاضنة (37 درجة مئوية، 5% CO₂، 95% رطوبة).
8. تسجيل الدخول إلى برنامج اقتناء، وتحديد الجدول الزمني لاكتساب | إضافة إطلاق السفينة | المسح الضوئي في الجدول | إنشاء السفينة: جديدة.
9. حدد نوع المسح الضوئي: كروي. تحديد القنوات للفائدة: المرحلة + برايتفيلد (متابعة النمو الماغنيسيوم)، الأخضر (اتباع الإشارات الورم، وقت اقتناء 300 مللي) والأحمر (لمتابعة المبرمج، اكتساب الوقت 400 مللي ثانية).
   1. حدد التكبير المطلوب: 10 x.
   2. اختيار نموذج لوحة وموقفها في الدرج. حدد موضع الآبار الصورة. أدخل وصفاً للتجربة: الاسم، ونوع من الخلايا، وعدد الخلايا.
10. لتحليل الإعداد، حدد أرجاء التحليل حتى وقت لاحق. انقر على الحق في الجدول الزمني وتحديد خيار تعيين تحديد مسح الفاصل الزمني للمجموعة وتعيين إضافة مسح كل ح 4 و عن إجمالي إلى حاء 24 تعيين وقت البدء المطلوب (على الأقل 1 ح بعد حضانة في جهاز التصوير الآلي).
11. تحقق من كل يومين لنمو الماغنيسيوم قبل تسجيل الدخول إلى برامج التصوير.
    1. اختر خيار عرض مؤخرا بمسح وانقر نقراً مزدوجاً فوق التجربة المرجوة. حدد برايتفيلد في لوحة القنوات الصورة وثم استخدم أداة ملامح صورة التدبير لقياس القطر الماغنيسيوم. يستغرق 6 أيام كروي للوصول إلى الحجم المطلوب: 0.5 مم للقطر. إضافة 50 ميليلتر الكامل ربمي المتوسطة الواحدة وكذلك في اليوم الرابع للحد من تأثير التبخر متوسطة.

2-توليد خلايا تي سيارة CD19

1. توسيع نطاق خلايا تي سيارة CD19
   ملاحظة: تعبير مستقر من خلايا تي سيارة CD19 اشترتها توصيل معظم الفيروسات التراجعية من الجهة المانحة صحية ببمكس كما هو موضح سابقا¹⁶. الترميز بناء النسخ العكسي لسيارة CD19 سيارة الجيل الثاني ويتكون من سلسلة سكفف fmc63 والمفصلي CD8 والمجال transmembrane، مجال 4-1BB كوستيمولاتوري، وأخيراً مجال CD3ζ.
   1. لتوسيع, الخلايا الثقافة تي ترانسدوسيد حضور الخرز المغناطيسية المضادة-CD3/28 مع خلية بنسبة 1:1 حبة لأيام 10 – 11. خلال التوسع، خلايا في المتوسط كاملة (15 س-فيفو، 5% استبدال المصل، و 100 يو/مليلتر الماشوب البشري إيل-2).
      ملاحظة: كثافة مثالية لزيادة كفاءة 1 إلى 2 × 10⁶ خلايا/مل. اعتماداً على العدد الأولى، يمكن توسيع الخلايا في قوارير (25 سم² قوارير إلى 20 مل، وقوارير 75 سم² إلى 40 مل حجم الإجمالي) في حاضنة ثقافة خلية (37 درجة مئوية، 5% CO₂، 95% رطوبة).
   2. كمجموعة مراقبة سلبية لفحوصات التالية، وتشمل غير ترانسدوسيد ببمكس (سوف يشار موك) إلى البروتوكول توسع مواز للخلايا T السيارة CD19.
   3. في يوم 3 وإضافة متوسطة جديدة كل يوم فصاعدا، وتقسيم الخلايا إلى قوارير الثقافة أكثر إذا لزم الأمر.
   4. في يوم 10 – 11، خلايا أجهزة الطرد المركزي في 500 x غ 5 كحد أدنى لإزالة المادة طافية ودمج كافة الخلايا في أنبوب 50 مل واحد وريسوسبيند الخلايا في ~ 30 مل من وسائل الإعلام كاملة جديدة.
   5. ضع أنبوب 50 مل تحتوي على خلايا ريسوسبينديد على الوقوف مغناطيسي لفصل الخرز المغناطيسي من المتوسط الثقافة.
   6. انتظر لمدة 2-3 دقيقة الخرز جمع إلى جانب الأنبوب.
   7. إزالة المتوسطة الثقافة مع ماصة ونقل إلى أنبوب جديد دون لمس مناطق جمع حبة المغناطيسية.
   8. كرر الخطوات المتعلقة باستئصال حبة (2.1.5–2.1.7) مرة أخرى الحد من عدد الخرز المتوسط الثقافة النهائية.
   9. ريسوسبيند وحساب الخلايا، وضبط الكثافة إلى 1 إلى 2 × 10⁶ خلايا/مل في المتوسط كاملة.
   10. بقية الخلايا لمالا يقل عن 4 ح حتى بين عشية وضحاها. ثم مباشرة تجميدها لأسفل في-80 درجة مئوية، ونقل في القنينات لخزان النتروجين سائل اليوم التالي للتخزين على المدى الطويل. وبدلاً من ذلك، واحد يمكن أن تطيل بقية تصل إلى بين عشية وضحاها للاستخدام الفوري.
2. سيارة CD19 التعبير التحكم في خلايا تي الأولية
   1. حساب عدد الخلايا T الموسع كالأرقام قد تختلف بشكل طفيف بعد الثقافة بين عشية وضحاها أو معتدلاً بعد تجميد/ذوبان الجليد.
   2. نقل الخلايا⁵ من كل سيارة CD19 5 × 10 وخلايا تي الابتدائي صورية لفصل أنابيب التدفق الخلوي.
   3. تغسل الخلايا مع 200 ميكروليتر من "تدفق المخزن المؤقت" (2% FBS في برنامج تلفزيوني) وأجهزة الطرد المركزي هذه الأنابيب في 500 x ز للحد الأدنى 5 كرر الخطوات الغسيل للتخلص من أي العناصر الملموسة الناجمة عن المتوسط الثقافة.
   4. إعداد جسم الأولية (البيوتين الماعز الماوس المضادة "مفتش"، ₂ F(ab') بلغة محددة) عن طريق إجراء تخفيف 1: 200 في "تدفق المخزن المؤقت".
   5. ريسوسبيند الخلايا في 100 ميكروليتر من مزيج الأجسام المضادة كل أنبوب واحتضان على الجليد ل 15 دقيقة كرر الخطوة الغسيل السابقة مرتين لإزالة الأجسام المضادة الزائدة.
   6. إعداد جسم الثانوي (ستريبتافيدين-PE) تمييع 1: 400 في "تدفق المخزن المؤقت".
   7. ريسوسبيند الخلايا في 100 ميكروليتر من مزيج الأجسام المضادة كل أنبوب واحتضان على الجليد ل 15 دقيقة كرر الخطوة السابقة الغسيل مرتين للتخلص من الأجسام المضادة الزائدة.
   8. ريسوسبيند الخلايا في 200 ميكروليتر من "المخزن المؤقت لتدفق" كل أنبوب ونحللها في سيتوميتير تدفق.
   9. استخدام خلايا "تي وهمية" لإقامة بوابة السلبية والإيجابية وتحليل CD19 سيارة ترانسدوسيد خلايا تي تبعاً لذلك.

3-3D ورم كروي قتل الإنزيم

1. بعد 6 أيام أو الماغنيسيوم مرة واحدة تصل إلى الحجم المطلوب، وإزالة اللوحة من الحاضنة. استخدام ماصة متعددة القنوات، بلطف بإزالة 100 ميليلتر/البئر متوسطة 1640 رمبي كاملة من لوحات كروي.
   1. لهذه الخطوة، زاوية النصائح نحو الداخل الجدار للوحة 96-الآبار، وتجنب الاتصال مع الجزء السفلي من البئر للتقليل من اضطراب الماغنيسيوم. تبقى وحدة التخزين يجب أن تكون حوالي 100 ميليلتر.
2. تحضير حل 1: 200 أنيكسين الخامس أحمر بخلط 50 ميليلتر Annexin الخامس أحمر مع مل 9.95 في المتوسط RPMI 1640 كاملة.
3. إضافة من 1: 200 الحل الخامس Annexin أحمر 100 ميليلتر/جيدا.
4. نقل اللوحة إلى حاضنة (37 درجة مئوية، 5% CO₂، 95% رطوبة) لمدة 15 دقيقة.
5. حصاد الخلايا T CD19 سيارة ترانسدوسيد في الأنبوبة 15 مل والطرد المركزي لهم في 500 x ز للحد الأدنى 5 إزالة المادة طافية باستخدام ماصة وريسوسبيند من بيبيتينج صعودا وهبوطاً عدة مرات مع 2 مل من إكمال RPM1 1640 المتوسطة.
6. عد الخلايا باستخدام الاستبعاد تريبان الأزرق في عداد خلية متوافقة.
7. إزالة طافية باستخدام ماصة تعليق خلية أجهزة الطرد المركزي في 500 x ز 5 كحد أدنى وريسوسبيند في المتوسط ربمي للحصول على 2 × 10⁵ خلايا/مل.
8. نقل تعليق خلية إلى خزان عقيمة والاستغناء عن 100 ميليلتر/بئر إلى 96-فضلا عن جولة أسفل لوحة كروي استخدام ماصة متعددة القنوات.
9. نقل اللوحة مرة أخرى إلى جهاز التصوير الآلي داخل حاضنة (37 درجة مئوية، 5% CO₂، 95% رطوبة).
10. تسجيل الدخول إلى برنامج اقتناء، حدد "الجدول الزمني للحصول على".
    1. زر الماوس الأيمن فوق المخطط الزمني المسح الضوئي، وحدد تحرير الجدول الزمني. انقر بالزر الأيمن على مجموعة المسح الضوئي وحذفه. انقر بالزر الأيمن على جدول زمني، وحدد خيار تعيين تحديد مسح الفاصل الزمني للمجموعة وتعيين إضافة مسح كل ح 1.5 و ما مجموعة 24 ساعة.
    2. تعيين وقت البدء المطلوب (على الأقل 1 ح بعد حضانة في جهاز التصوير الآلي). حدد حفظ جدولة عمليات التفحص.

4-تحليل الصورة الآلي

1. تسجيل الدخول إلى اقتناء واختيار خيار عرض مؤخرا بمسح وحدد الخيار بدء تحليل . حدد إنشاء تعريف جديد لتحليل | نوع التحليل: كروي. ضع علامة على قنوات الصورة لتحليل (المرحلة + برايتفيلد والأخضر والأحمر).
2. حدد الصور التمثيلية على الأقل 10: 1 بشكل عام، كل حالة وعلى الأقل 3 نقاط الوقت (بداية والأوسط ونهاية لاقتناء).
3. تحليل معاينة الافتراضي الداخلي على المكدس الصورة بأكملها.
4. قم بتعديل المعلمات لقناع برايتفيلد. معلمات نموذجية: حساسية 10، فتحه ملء 1,000 ميكرومتر²، دقيقة بمنطقة 1,000 ميكرومتر². معاينة على المكدس الصورة بأكملها، والتحقق من أن المعلمات المحدد كشف الماغنيسيوم دقة.
5. قم بتعديل المعلمات للقناع الأخضر (التجارة والنقل). معلمات نموذجية: تجزئة قبعة مع دائرة نصف قطرها 200 ميكرومتر وعتبة 3 جامعة جلاسجو كالدونيان، حافة انشقت، وملء الحفرة 5,000 ميكرومتر²، ضبط الحجم-2 بكسل، منطقة دقيقة 3,000 ميكرومتر². معاينة على المكدس الصورة بأكملها، والتحقق من أن المعلمات المحدد كشف الماغنيسيوم دقة.
6. قم بتعديل المعلمات للقناع الأحمر (أنيكسين V). معلمات نموذجية: تجزئة قبعة مع دائرة نصف قطرها 150 ميكرومتر وعتبة 2 جامعة جلاسجو كالدونيان، حافة انشقت، وملء الحفرة 5,000 ميكرومتر²، وضبط حجم 0 بكسل، منطقة دقيقة 1,000 ميكرومتر². معاينة على المكدس الصورة بأكملها، والتحقق من أن المعلمات المحدد كشف الماغنيسيوم دقة.
7. بدء تشغيل المحلل.
   1. بمجرد القيام بالتحليل، استخراج قياس الفائدة. حدد الملف تم تحليلها ومن ثم خيار مقاييس الرسم البياني . تحديد المقاييس للفائدة، والمسح الضوئي والبئر. عادة، يعطي كثافة الأحمر والأخضر مجموع حدود برايتفيلد قياسات أكثر دقة بتقييد الإشارة الواردة من الأسفار إلى حدود الماغنيسيوم يحدده القناع برايتفيلد (الشكل 3). استخراج المقاييس المحددة في عدة تنسيق الملف عن طريق النقر على "تصدير البيانات".
8. المضي قدما لاستخراج الصور والأفلام عن طريق تحديد الملف تم تحليلها ومن ثم حدد خيار تصدير الصور والأفلام . يتوفر خياران، أما ك "عرض" لاسترداد الصور والأفلام كما ينظر في برامج التصوير (الصور المركبة عادة)، أما "كتخزين" لاسترداد البيانات الخام للتحليل الخارجي من خلال برامج الجزء الثالث.

النتائج

وكما يتبين في الشكل 1، من الأهمية بمكان للتحقق من التدفق الخلوي مستوى التعبير عن السيارة CD19 على خلايا تي (الشكل 1A) ومستوى CD19 في خطوط الخلايا السرطانية HCT116 (الشكل 1B). الشكل 2 تجسد نتائج تجربة نموذجية كروي. جهاز ...

Discussion

وقد أصبح استخدام الماغنيسيوم كأداة مبتكرة للتحقق من صحة علاج السرطان مستقبلا مجال يحظى باهتمام متزايد في السنوات الأخيرة. الماغنيسيوم تمثل خطوة وسيطة بين الكلاسيكية 2D تحليل في المختبر والمجراه في التقييم. الأسلوب كذلك يحمل الكثير من الأمل فيما يتعلق بقوتها من ناحية الورم الصغير-بيئة محا...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline	SIGMA-ALDRICH	D8537-500ML	Lot Number: RNBG7037
75 cm² growth area flasks	VWR	430639	Lot Number: 2218002
75 cm² growth area flasks	VWR	734-2705	Lot Number: 3718006
Trypsin-EDTA	SIGM-ALDRICH	T3924-100ml	Lot Number: SLBTO777
RPMI 1640 med L-glutamin, 10 x 500 mL	Life Technology (Gibco)	21875-091	Lot Number: 1926384
Fetal Bovine Serum	Gibco	10500064	Lot Number: 08Q3066K
Gentamicin	Thermo Fischer	15750060	Lot Number: 1904924A
Trypan Blue Solution, 0.4%	Thermo Fischer	15250061	Lot Number: 1886513
96 well plate, round bottom	VWR	734-1797	Lot Number: 33117036
Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28	Thermo Fischer	11132D	-
X-VIVO 15 with Gentamicin L-Gln, Phenol Red, 1 L	BioNordika	BE02-060Q	Lot Number: 8MB036
CTS Immune Cell Serum Replacement	Thermo Fischer	A2596102	Lot Number: 1939319
IL-2 Proleukin	Novartis		Lot Number: 505938M
IncuCyte Annexin V Red Reagent	Essen Bioscience	4641	Lot Number: 17A1025-122117
Reagent Reservoir	VWR	89094-672	Lot Number: 89094-672
15 mL tubes	VWR	734-1867	Lot Number: 19317044
anti-human CD19-PE	BD Biosciences	555413	Lot Number: 4016990 RRID: AB_395813
Biotin-SP (long spacer) AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG	Jackson ImmunoResearch	115-066-072	Lot Number: 129474: RRID: AB_2338583
Streptavidin-PE	BD Biosciences	554061	Lot Number: 5191579: RRID: AB_10053328
HCT 116 Colorectal Carcinoma Line	ATCC	CCL-247	-
Incucyte S3	Essen Bioscience