A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Method Article
ويهدف هذا البروتوكول تقييم إيمونوثيرابيوتيك سيتوتوكسيسيتي تي خلية (سيارة تي خلية) المعاد توجيهها ضد الخلايا السرطانية منظم 3D (الماغنيسيوم) في الوقت الحقيقي.
وقد أصبح العلاج المناعي مجال يحظى باهتمام متزايد في مجال مكافحة السرطان وإلا غير قابل للعلاج. من بين جميع الطرق إيمونوثيرابيوتيك، توجيه مستقبلات مستضد تشيميريك (السيارات) خلايا تي الحصول على النتائج الأكثر إثارة، ولا سيما مع سرطان الدم الليمفاوي الحاد ب طب الأطفال (ب-الكل). أساليب التحقق من الصحة الكلاسيكية من خلايا "تي السيارة" تعتمد على استخدام خصوصية وفحوصات وظائف الخلايا T سيارات ضد الخلايا المستهدفة في التعليق وفي نماذج xenograft. ولسوء الحظ، الملاحظات المبداة في المختبر هي غالباً ما تنفصل عن النتائج التي تم الحصول عليها في فيفو ويمكن ادخار الكثير من الجهد والحيوانات بإضافة خطوة أخرى: استخدام الثقافة 3D. ويمثل إنتاج الماغنيسيوم خارج الخلايا المستهدفة المحتملة التي تحاكي بنية ثلاثية الأبعاد للخلايا السرطانية عندما كانوا هم انجرافتيد في نموذج الحيوان بديلاً مثاليا. هنا، نحن تقرير أسلوب بأسعار معقولة وموثوق بها وسهلة لإنتاج الماغنيسيوم من خط خلية القولون ترانسدوسيد كأداة التحقق من صحة للعلاج بالخلايا التبني (يتجلى هنا في خلايا تي سيارة CD19). ويقترن هذا الأسلوب مع نظام تصوير حية متقدمة التي يمكن تتبع نمو كروي، المستجيب الخلايا سيتوتوكسيسيتي وورم الخلايا المبرمج.
ويمثل نقل الخلية التبني (قانون) علاج السرطان الجيل القادم. أنها تعتمد على حقن خلايا المستجيب (أو ناغورني كاراباخ-الخلايا التائية) إلى مريض. يمكن أن تكون هذه الخلايا المعدلة وراثيا مع مستقبل التي سيتم توجيهها إلى أهدافها، الورم، وتدميره. وأبدى هذا النهج مؤخرا يكون ممكناً عندما قدم مستقبلات مستضد تشيميريك (سيارة) الموجهة ضد علامة الخلية ب CD19 في خلايا المريض تي لقتل صفحته/صفحتها السرطان1. في حالة السيارة، ومستقبلات مصطنعة، يتكون من أجزاء جسم معين، على التصميم مستضد ملزمة المجال ينحصر كيان معين واحد في سلسلة جزء متغير (سكفف)، مرتبطة بالمجالات مما يشير إلى خلايا T. على الرغم من أن هناك العديد من التصاميم، الإصدارات الأكثر استخداماً المشار إليها كالجيل الثاني من سيارة التصاميم، وتتألف من CD3z للإشارات تكر والمجال كوستيمولاتوري واحد (CD28، 4-1BB، OX40، إلخ.) 1 , 2-مجال العلاج المناعي الموجه أكثر من اهتمامها بهذا الشكل الجديد من القانون عندما تعامل الخلايا CD19 سيارة تي فعالية العديد من المرضى مع الخلية بالاورام الخبيثة3،4. بعد هذا النجاح، حاول الباحثون لاستغلال تصاميم مماثلة باستهداف الأخرى [ابيتوبس] للأورام الصلبة نجاحا محدودا. ولسوء الحظ، ندرة الورم المستضدات محددة وميكرونفيرونمينتس الورم أقسى المقدمة "سيارة تي" الخلايا أقل فعالية تجاه الأورام الصلبة5.
حاليا، تعتمد استراتيجيات التحقق من الصحة الأكثر استخداماً في المختبر على نظم ثنائية الأبعاد (2D) تلبي سوى جزء من التحديات التي سبق ذكره الأورام الصلبة. كلاسيكي، 2D في المختبر نظم تشمل مزيجاً من الخلايا T سيارات وخطوط خلايا السرطان المستهدفة مونولاييرس لتقييم الأداء الوظيفي وخصوصية هذه الخلايا المستجيب. على الرغم من أن هذه الاستراتيجيات أجزاء هامة وحيوية من الدراسات، أنها لا تأخذ في الاعتبار مورفولوجيا المعقدة وثلاثي الأبعاد (3D) هيكل من خلايا السرطان6. الخلايا السرطانية المستزرعة في نظم 3D، المشار إليها الماغنيسيوم، اكتساب الصفات المظهرية الجديدة من خلال أحداث تغييرات في الجينات التعبير الشخصية7، التي قد تؤثر على الاعتراف بواسطة خلايا المستجيب المعاد توجيهها. بيرجيرسدوتير وزملاؤه أظهرت أن خط خلية سرطان الغدد الليمفاوية (HL) هودجكن عندما تزرع فقط في نموذج ثلاثي الأبعاد ثقافة يكتسب ملف تعريف تعبير جينات مشابهة ل عينات الورم الرئيسي8. ولذلك، الماغنيسيوم أو 3D مماثلة الثقافة عرض المنهجيات ذات الصلة أكثر في نماذج المختبر بدلاً من نظم 2D القياسية. هذه النظم أيضا مشابهة للدراسات المجراة في التي ينظر إليها كخطوة أخيرة في عملية التحقق من الصحة لسيارة معينة. وبالنظر إلى أن تفشل الأنظمة 2D لمحاكاة مورفولوجية مجموعات السرطان، الماغنيسيوم تقدم تشكيلات مماثلة لتقييم الأداء الوظيفي للخلايا T السيارة قبل في النماذج الحية. في دراسة واحدة، بيكل et al. حددت أن نموذج كروي من مستقبلات عامل نمو البشرة البشرية (HER2) أوفيريكسبريسينج الخلايا السرطانية أظهرت الملامح إشارات مماثلة في النماذج الحية9. وهذا يدعم كذلك أن الماغنيسيوم تقديم تقييم فيفو تكون أكثر ذات الصلة وانتهاء-إلى-في الخلايا T السيارة. بالإضافة إلى ذلك، قد يساعد التحقق من السيارة تي-خلية ضد الماغنيسيوم تقييم فعاليتها أكثر حاسمة ومنع بعض التصاميم من الانتقال إلى الدراسات المجراة في قبل الأوان10؛ وبالتالي، المساهمة في البحوث المعنية أخلاقيا بالتضحية بعدد أقل من الحيوانات. وعلاوة على ذلك، بروتوكولات استخدام الماغنيسيوم ليست أغلى من نظم 2D الكلاسيكية وأسرع بكثير بالمقارنة مع الدراسات الكلاسيكية في فيفو . أخذت معا، أحد يستطيع أن يتنبأ أن إدراج دراسات كروي سيصبح قريبا الممارسة القياسية الربط بين الدراسات في المختبر والمجراه.
نقدم هنا، إعداد الماغنيسيوم من خط خلية سرطان القولون 116 كليات التقنية العليا. تم تعديل هذا الخط خلية للتعبير عن الجزيء CD19 البشرية لجعلها حساسة للخلايا T السيارة CD19 وتوفير تقييم واضح لقتل بنية سيارة سريرياً تم التحقق من صحتها باستخدام.
1-جيل الماغنيسيوم من خط خلية سرطان القولون والمستقيم
2-توليد خلايا تي سيارة CD19
3-3D ورم كروي قتل الإنزيم
4-تحليل الصورة الآلي
وكما يتبين في الشكل 1، من الأهمية بمكان للتحقق من التدفق الخلوي مستوى التعبير عن السيارة CD19 على خلايا تي (الشكل 1A) ومستوى CD19 في خطوط الخلايا السرطانية HCT116 (الشكل 1B). الشكل 2 تجسد نتائج تجربة نموذجية كروي. جهاز ...
وقد أصبح استخدام الماغنيسيوم كأداة مبتكرة للتحقق من صحة علاج السرطان مستقبلا مجال يحظى باهتمام متزايد في السنوات الأخيرة. الماغنيسيوم تمثل خطوة وسيطة بين الكلاسيكية 2D تحليل في المختبر والمجراه في التقييم. الأسلوب كذلك يحمل الكثير من الأمل فيما يتعلق بقوتها من ناحية الورم الصغير-بيئة محا...
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
هذا العمل كان يدعمها "مجلس البحوث النرويجي" إطار المنح #244388، #254817 و #284983؛ جمعية السرطان النرويجية (#6829007)؛ المنطقة الصحية النرويجية جنوب شرق تحت منحة #17/00264-6 و #2016006.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | SIGMA-ALDRICH | D8537-500ML | Lot Number: RNBG7037 |
75 cm² growth area flasks | VWR | 430639 | Lot Number: 2218002 |
75 cm² growth area flasks | VWR | 734-2705 | Lot Number: 3718006 |
Trypsin-EDTA | SIGM-ALDRICH | T3924-100ml | Lot Number: SLBTO777 |
RPMI 1640 med L-glutamin, 10 x 500 mL | Life Technology (Gibco) | 21875-091 | Lot Number: 1926384 |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 10500064 | Lot Number: 08Q3066K |
Gentamicin | Thermo Fischer | 15750060 | Lot Number: 1904924A |
Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fischer | 15250061 | Lot Number: 1886513 |
96 well plate, round bottom | VWR | 734-1797 | Lot Number: 33117036 |
Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 | Thermo Fischer | 11132D | - |
X-VIVO 15 with Gentamicin L-Gln, Phenol Red, 1 L | BioNordika | BE02-060Q | Lot Number: 8MB036 |
CTS Immune Cell Serum Replacement | Thermo Fischer | A2596102 | Lot Number: 1939319 |
IL-2 Proleukin | Novartis | Lot Number: 505938M | |
IncuCyte Annexin V Red Reagent | Essen Bioscience | 4641 | Lot Number: 17A1025-122117 |
Reagent Reservoir | VWR | 89094-672 | Lot Number: 89094-672 |
15 mL tubes | VWR | 734-1867 | Lot Number: 19317044 |
anti-human CD19-PE | BD Biosciences | 555413 | Lot Number: 4016990 RRID: AB_395813 |
Biotin-SP (long spacer) AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-066-072 | Lot Number: 129474: RRID: AB_2338583 |
Streptavidin-PE | BD Biosciences | 554061 | Lot Number: 5191579: RRID: AB_10053328 |
HCT 116 Colorectal Carcinoma Line | ATCC | CCL-247 | - |
Incucyte S3 | Essen Bioscience |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved