JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يصف هذا البروتوكول عمليه الخزعات شفط المستقيم المناعي لكالريتينين ، S100 البروتين ، والبروتين المنتج الجينات 9.5. هذه الطريقة التشخيصية المساعد الرواية لمرض هيرشسبرونغ لديها حساسية المفضلة ومعدلات الخصوصية.

Abstract

مرض هيرشسبرونغ (HD) هو مرض معوي خلقي يتجلى سريريا كعدم قدره علي اجتياز المينيوم عند الرضع أو كامساك طويل الأجل عند الأطفال. خزعة شفط المستقيم (RSB) لتحديد عدم وجود خلايا العقدة وتضخم العصبية هو الاختبار الأكثر دقه لتشخيص HD في الوقت الحاضر. تلطيخ الهييوكسيلين التقليدية-ايوسين يفتقر إلى الحساسية والخصوصية. لا يمكن استخدامها علي نطاق واسع لتلطيخ استيل بسبب عمليه معقده. لدينا بروتوكول رواية من المناعي لكالريتينين ، S100 البروتين ، والبروتين الجينات المنتج 9.5 (PGP 9.5) ، والتي أجريناها علي RSBs ، معارض عاليه الحساسية ومعدلات الخصوصية من 96.49 ٪ (95 ٪ فاصل الثقة ، 0.88-0.99) و 100 ٪ (95 ٪ الثقة الفاصل الزمني ، 0.97-1.00) ، علي التوالي. الشرائح HD المتضررة غالبا ما تكون موجودة كغياب للتعبير عن كالريتينين, S100 البروتين, و PGP 9.5, وهي علامات لتضخم العصبية في الانسجه تحت المخاطية. يصف هذا البروتوكول عمليه التشغيل التفصيلية لطريقه التشخيص الجديدة هذه.

Introduction

مرض هيرشسبرونغ (HD) هو اضطراب الأمعاء المعوية الخلقية الشائعة التي تتميز بعدم وجود خلايا العقدة في أجزاء مختلفه من الأمعاء البعيدة1. يتم تشكيل الجهاز العصبي المعوي البشري عندما يتم الانتهاء من غزو الخلايا العصبية الجنينية. إذا كان هناك اضطراب في العملية وفشل الغزو لإكمال ، والأمعاء البعيدة من الوليد يصبح عقد2. وتسمي هذه الحالة المميتة المحتملة بمرض هيرشسبرونغ. ان الانتشار والحركية ونمو الأمعاء هي المكونات الثلاثة الرئيسية للاستعمار الناجح.

التقليدية الهيسوكسيلين و ايوسين (H & E) تلطيخ من خزعة تحت المخاطية محدوده لا يمكن ان تصل إلى مرضيه من نتيجة كما H & E تلطيخ من نسيج كامل السماكة التي تم الحصول عليها من الجراحة. بالاضافه إلى ذلك ، استيل (وجع) تلطيخ انسجه شفط المستقيم من الصعب نظريا نظرا لحساسيته غير كافيه ، وهو 91 ٪ ، ومعالجه معقده من الأقسام المجمدة3،4. عده علامات مناعي أخرى من الخلايا العقديه وألياف العصبية التي يمكن ان تكون ملطخه في formalin-الثابتة والعينات المضمنة البارافين تصبح تدريجيا التشخيص هد السائد. كالريتينين هو بروتين ملزم بفيتامين د يعتمد علي الكالسيوم ولا يتم التعبير عنه في الضفيرة المعوية وشبه المخاطية للأجزاء المصابة بالدقة العالية5. يتم التعبير عن البروتين S100 في الخلايا المستمدة من القمه العصبية ، مثل ألياف العصبية والخلايا الدليج ، والتي غالبا ما تقدم تضخم العصبية في الانسجه تحت المخاطية من الشرائح HD المتضررة6. بروتين الجينات المنتج 9.5 (PGP 9.5) البقع بشكل موثوق ألياف العصبية والخلايا العقديه. PGP 9.5 تلطيخ بمثابه تكمله لتلطيخ كالريتينين ، وخصوصا في حالات معزولة هيبوجانجيوسيس. تلطيخ مزدوجة مع S100 و PGP 9.5 يمكن ان تقلل من معدل كاذبه سالبه وزيادة الحساسية. وكشرط أساسي ، تهدف الدراسة الحالية إلى ضمان الخصوصية الكافية والحساسية العالية لهذه الطريقة التشخيصية الجديدة. استخدم بروتوكولنا الجديد جميع العلامات الثلاثة للتمييز بين الأمعاء الغليظة وألياف العصبية المفرطة. وقد اجري مختبرنا دراسة مرتقبه ل318 طفلا ونشرت سابقا بدون بروتوكول مفصل7. يتم مناقشه البروتوكول المفصل والاحتياطات في هذه المقالة. اي الولدان الذين يعانون من مشكله التغوط الشديد منذ الولادة أو الأطفال المصابين بالإمساك المزمن باستثناء الامراض الشائعة الأخرى هي المرشحين المحتملين لخزعة شفط المستقيم (RSB). لدينا بروتوكول رواية مناسبه لتلطيخ ليس فقط RSBs ولكن أيضا كامل سمك الخزعات أو العينات الجراحية لاجراء التشخيص النهائي.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

تمت الموافقة علي هذا البروتوكول من قبل مجلس أخلاقيات البحوث في مستشفي الاتحاد بجامعه هوازهونغ للعلوم والتكنولوجيا.

1. خزعة شفط المستقيم

  1. اجراء خزعة شفط المستقيم من قبل جراح الأطفال المدربين تدريبا جيدا ومساعد باستخدام Rbi2 شفط المستقيم خزعة النظام بعد الحصول علي موافقه مستنيرة من الوصي.
    1. تنفيذ RSB علي المرضي الذين لديهم المؤشرات التالية: عدم القدرة علي تمرير المينيوم في الرضع أو النفخ علي المدى الطويل مع أو بدون الإمساك في الأطفال. الأطفال مع الإمساك علي المدى الطويل الذين يحتاجون إلى زيت البارافين لإكمال التغوط. انسداد معوي أو انثقاب معوي مع أسباب غير معروفه لدي الأطفال الذين يخضعون لفغر الأمعاء.
      ملاحظه: موانع لل RSB هي كما يلي: الأطفال الذين يعانون من اعراض شديده ، الذين هم في حاله بدنيه سيئه ، أو الذين لا يستطيعون متسامح RSB ؛ الأطفال المصابين بالتهاب الأمعاء الحاد المرحلة. الأطفال الذين يمرون بالأمعاء المعوية دون شفاء كامل.
  2. تنفيذ حقنه شرجية الاحتفاظ المالحة العادية كما اعداد الأمعاء 36 h قبل الاجراء لتجنب البراز فضفاضة وذمه مفرطة من الغشاء المخاطي. أضافه محلول كبريتات المغنيسيوم إذا كان الطفل يعاني من الإمساك الشديد. أداره فيتامين K (1 مغ/كغ) للمواليد الولدان.
    ملاحظه: لا اجراء اختبارات الدم قبل الجراحة أو أداره المضادات الحيوية ، كما انها غير مطلوبه.
  3. ضع المريض في وضعيه الشق الحجري. معطف سطح الأنبوب مع زيت البارافين. ادخل الأنبوب الغير حاد 4-7 سم في المستقيم مع الفتحة الجانبية التي تواجه الجدران الخلفية أو الجانبية.
  4. تطبيق ضغط لطيف علي أنبوب لتسهيل التصاق كافيه من الحفرة الجانبية إلى جدار المستقيم. اضغط علي الزناد وسحب الاداه علي الفور.
  5. استخدم أداه الخزعة للحصول علي 4 خزعة شفط بقطر 2 مم بطول 3 سم و 6 سم فوق خط الأسنان ، انتييواورلي واللاحقة. استخدام ابره لوضع العينة علي الشاش مبلله بالمحلول الملحي.
  6. مراقبه المريض حتى 2 ح بعد الاجراء لاستبعاد نزيف المستقيم. تجنب المزيد من التلاعب في المستقيم والشرج في ال 24 ساعة الاولي بعد RSB.

2-اعداد الأقسام الخاصة ب RSB

  1. وضع الخزعات شفط المستقيم في 4 ٪ بارافورمالدهيد لمده 6 ساعات لإصلاح الانسجه. استخدم وحده تخزين مثبته 5 مرات أكثر من حجم الانسجه.
  2. ديهيدرات الانسجه باستخدام dehydrator الانسجه المرضية لمده 11 ساعة. تتكون العملية المبرمجة بأكملها من الخطوات الخمس التالية:
    1. وضع الانسجه في الفورمالديهايد وإصلاح لمده 1 ساعة.
    2. وضع الانسجه في الايثانول 75 ٪ لمده 4 ساعات.
    3. وضع الانسجه في الايثانول المطلق (اثنين من التغييرات ، 1 ساعة لكل منهما).
    4. وضع الانسجه في الايثانول المطلق (اثنين من التغييرات ، 30 دقيقه لكل منهما).
    5. وضع الانسجه في اكسيلين (ثلاثه تغييرات ، 1 ساعة لكل منهما).
  3. وضع الانسجه في شمع البارافين (58-60 درجه مئوية) (ثلاثه تغييرات ، 1 ساعة لكل منهما). تضمين الانسجه RSB في كتل البارافين.
  4. تقليم كتل البارافين باستخدام ميكروتومي حتى يتم كشف الانسجه تماما مع طائره القسم كامله.
  5. قطع الكتل في أقسام 0.4 μm مع ميكروتومي.
  6. ضع الأقسام في 45-50 درجه مئوية من الماء لبضع ثوان لكل منها للسماح للأقسام بالانتشار في لوحه مسطحه.
  7. نقل أقسام البارافين علي الشرائح.
  8. اخبز الشرائح في فرن 60 درجه مئوية ل 3-5 h. تجنب الخبز لفتره طويلة جدا ، والتي قد تؤدي إلى فقدان المستضدات.
  9. ضع الشرائح التي سيتم المغادرين اليها في اكسيلين (تغييران ، 15 دقيقه لكل منهما).
  10. هيدرات الشرائح في الايثانول المطلق ، 95 ٪ ، 80 ٪ ، و 75 ٪ الايثانول لمده 5 دقائق لكل منهما. ثم ، شطفها في التناضح العكسي (RO)-تنقيه المياه لمده 5 دقائق أخرى.

3. استرداد Antigen

  1. جعل العمل المخففات لاسترداد كالريتينين عن طريق خلط 4 مل من المخزن المؤقت استعاده مستضد أدتا مع 200 mL من المياه النقية RO. جعل العمل المخففات ل S100 و PGP 9.5 استرداد عن طريق خلط 1 مل من حمض الستريك الصوديوم العازلة سترات (100x) مع 99 مل من المياه النقية RO.
    ملاحظه: كالريتينين يمكن استردادها بالتفضيل من قبل حل استرداد أدتا. ومع ذلك ، حمض الستريك الصوديوم سترات عازله هو أكثر ملاءمة لاستعاده S100 و PGP 9.5.
  2. وضع الشرائح في جره تلوين coplin. أملا الجرة بمحلول الاسترجاع وضعها في حمام الماء المغلي المسخن. بعد الغليان لمده 20 دقيقه ، وأزاله جره من حمام المياه والسماح لها بارده إلى درجه حرارة الغرفة. تستغرق عمليه التبريد حوالي 10 دقائق. قم بازاله الشرائح واشطفها برفق مره واحده مع المحلول الملحي المخزن بالفوسفات (تلفزيوني).
  3. رسم دائره مع قلم علامة حول الانسجه واعداد مربع الرطب للإجراءات التالية.

4. حجب

  1. جعل العمل المخففات عن طريق خلط 3 مل من 30 ٪ H2O2 مع 27 مل من المياه النقية RO.
  2. أضافه اثنين أو ثلاث قطرات من 3% H2O2 الحل درووايز علي الانسجه لمنع البيروكسيلات. أضافه الحل H2O2 فورا للتاكد من ان الحل لن تجاوز من الدائرة. تنفيذ حجب بيروكسيلات في حاضنه 37 درجه مئوية لمده 20 دقيقه.
  3. شطف الشرائح برفق مع تلفزيوني (ثلاثه يغسل ، 5 دقائق لكل منهما).
  4. كتله الشرائح لمده 20 دقيقه في 37 درجه مئوية مع 5 ٪ الزلال المصل البقري (جيش الصرب البوسني ، التي أعدها خلط 1.5 غرام من مسحوق جيش صرب الجمهورية مع 30 مل من المياه النقية RO).
    ملاحظه: الحجب مع 3% H2O2 يمكن منع 95 ٪ من تلطيخ غير محدد وحجب مع 5 ٪ من الجيش الصربي البوسني يمكن ان تمنع 5 ٪ أخرى من تلطيخ غير محدد. الجمع بين طريقتين للحصول علي نتيجة موثوق بها.

5. مستضد-رد فعل الأجسام المضادة

  1. أزاله 5% الجيش الصربي البوسني وأضافه 50 μL من الأجسام المضادة الاساسيه (كالريتينين ، S100 ، أو PGP 9.5) إلى الشريحة. احتضان بين عشيه وضحيها في 4 درجه مئوية.
  2. غسل الشريحة مع تلفزيوني (ثلاث مرات ، 3 دقائق لكل منهما).
  3. أضافه 50 μL من البوليمر محسن (كاشف A ؛ انظر جدول المواد) إلى القسم واحتضانه لمده 20 دقيقه في 37 درجه مئوية حاضنه. ثم ، اغسل الشريحة مع تلفزيوني (ثلاث مرات ، 3 دقائق لكل منهما).
  4. أضافه 50 μL من الأجسام المضادة الثانوية B (الماعز مكافحه الأرنب/الماوس مفتش الأجسام الثانوية) إلى القسم واحتضان لمده 30 دقيقه في 37 درجه مئوية حاضنه. غسل القسم مع تلفزيوني (ثلاث مرات ، 5 دقائق لكل منهما).

6.3 ، 3-ديامينوبينزيديني وتلطيخ الهيلوكسيلين

  1. أضافه 850 μL من المياه النقية RO إلى أنبوب 1.5 mL وأضافه الكواشف تلطيخ (انظر جدول المواد) في الترتيب a ، B ، و c. أضافه 50 μl من كل كاشف للحصول علي ما مجموعه 1 مل من 3 ، 3-ديامينوبينزيديني (داب) حل العمل. إذا كان هناك رواسب ، واستخدام الحل بعد الترشيح.
  2. أضافه قطره من الحل العمل نقاره إلى قسم الانسجه وصمه عار لمده 3-10 دقيقه. احتضان الشرائح في نقاره في درجه حرارة الغرفة حتى يتم الكشف عن تلطيخ البني. راقب بعناية باستخدام مجهر الحقل الساطع. الحفاظ علي الحل العمل نقاره بعيدا عن الضوء. ثم ، اغسل الشريحة مع تلفزيوني لمده 5 دقائق.
  3. أضافه قطره من الهيلوكسيلين لمضاد للبقع النوى لمده دقيقه واحده تقريبا. ثم ، عقد جره coplin ويغسل تحت قطره من الماء لحوالي 30-40 s حتى يتم أزاله الصبغة الزائدة. احرص علي عدم اتلاف أقسام الانسجه.
  4. تزج الشرائح RSB في جره coplin التي تحتوي علي تلفزيوني ل25-30 s. ثم ، التفريق في 1 ٪ حمض الهيدروكلوريك-الايثانول لمده 10 ليالي. اغسل الشرائح مع تلفزيوني لمده دقيقه واحده.
  5. يرطب الشرائح في الترتيب العكسي للترطيب: 75 ٪ ، 80 ٪ ، 95 ٪ ، والايثانول المطلق (5 دقيقه لكل منهما).
  6. فضح الشرائح إلى اكسيلين (2 التغييرات ، 5 دقيقه لكل منهما).
  7. جبل المشبك باستخدام ultraclean المتصاعدة. السماح للشرائح لتجف قبل التصور باستخدام المجهر.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

في المجموع ، 318 المرضي المسجلين في دراستنا. خضع كل من المرضي RSB ، وكانت ملطخه الانسجه لكالريتينين ، S100 ، و PGP 9.5. وكان التشخيص علي أساس بروتوكول روايتنا HD في الحالات 97 ، غير HD في 213 الحالات ، ويشتبه HD في 8 حالات. ومن بين المرضي الجراحيين 132 ، تم تشخيص 99 المرضي مع هد عن طريق تحصين ا...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

هنا وصفنا اجراء باستخدام ثلاثه أجسام مضاده مناعي مختلفه لوصمه عار أقسام RBS لتشخيص هد. وكانت حساسية بروتوكول التشخيص لدينا 96.49 ٪ (95 ٪ CI ، 0.88-0.99) ، وكانت الخصوصية 100 ٪ (95 ٪ CI ، 0.97-1.00).

الخطوات الأكثر اهميه في البروتوكول هي RSB ورد فعل مستضد الأجسام المضادة. يحدد حجم الخزعة دقه التلطيخ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.

Acknowledgements

ويشكر المؤلفون وييبينغ تانغ علي مساعدته الكبيرة في توفير مختبر التصوير. وهذه المادة مدعومة ببحوث الرفاه العام ، ووردت أموال خاصه من الصحة الوطنية وتنظيم الاسره في الصين (المنحة رقم 201402007).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
calretinin antibodyMXB BiotechnologiesMAB-0716 170416405cantibody: primary antibody
S-100 antibodyMXB BiotechnologiesKit-0007antibody: primary antibody
PGP9.5 antibodyShanghai long island antibody Co. LtdR-0457-03antibody: primary antibody
enhancer reagentMXB BiotechnologiesKIT-9902-A 170416405aantibody: secondary antibody A
Goat anti-Rabbit/Mouse IgG Secondary AntibodyMXB BiotechnologiesKIT-9902-Bantibody: secondary antibody B
DAB staining kit (containing reagent A B and C)MXB BiotechnologiesDAB-0031staining kit
Heat incubatorShanghai yiheng instrument Co. LtdDHP-9082instrument
Rbi2 suction rectal biopsy systemAus Systems Pty Ltd, South Australia, AustraliaCP1200 HP1000 SS1000instrument
microtomeLeicaleica RM2016instrument
citric acid sodium citrate buffer(100X)MXB BiotechnologiesMVS-0101antigen retrieval buffer
pathological tissue dehydratorwuhan junjie electronic Co. LtdJT-12Finstrument

References

  1. Tam, P. K. Hirschsprung's disease: A bridge for science and surgery. Journal of Pediatric Surgery. 51 (1), 18-22 (2016).
  2. Heanue, T. A., Pachnis, V. Enteric nervous system development and Hirschsprung's disease: advances in genetic and stem cell studies. Nature Reviews Neuroscience. 8 (6), 466-479 (2007).
  3. Setiadi, J. A., Dwihantoro, A., Iskandar, K., Heriyanto, D. S., Gunadi, The utility of the hematoxylin and eosin staining in patients with suspected Hirschsprung disease. BMC Surgery. 17 (1), 71(2017).
  4. Agrawal, R. K., et al. Acetylcholinesterase histochemistry (AChE) - A helpful technique in the diagnosis and in aiding the operative procedures of Hirschsprung disease. Diagnostic Pathology. 10 (1), 208(2015).
  5. Kacar, A., Arikok, A. T., Azili, M. N., Ekberli Agirbas, G., Tiryaki, T. Calretinin immunohistochemistry in Hirschsprung's disease: An adjunct to formalin-based diagnosis. The Turkish Journal of Gastroenterology. 23 (3), 226-233 (2012).
  6. Bachmann, L., et al. Immunohistochemical panel for the diagnosis of Hirschsprung's disease using antibodies to MAP2, calretinin, GLUT1 and S100. Histopathology. 66 (6), 824-835 (2015).
  7. Jiang, M., et al. S100 and protein gene product 9.5 immunostaining of rectal suction biopsies in the diagnosis of Hirschsprung' disease. American Journal of Translational Research. 8 (7), 3159(2016).
  8. Takawira, C., D'Agostini, S., Shenouda, S., Persad, R., Sergi, C. Laboratory procedures update on Hirschsprung disease. Journal of Pediatric Gastroenterology & Nutrition. 60 (5), 598(2015).
  9. Meier-Ruge, W., et al. Acetylcholinesterase activity in suction biopsies of the rectum in the diagnosis of Hirschsprung's disease. Journal of Pediatric Surgery. 7 (1), 11-17 (1972).
  10. Barshack, I., Fridman, E., Goldberg, I., Chowers, Y., Kopolovic, J. The loss of calretinin expression indicates aganglionosis in Hirschsprung's disease. Journal of Clinical Pathology. 57 (7), 712-716 (2004).
  11. Kapur, R. P. Can We Stop Looking? Immunohistochemistry and the Diagnosis of Hirschsprung Disease. American Journal of Clinical Pathology. 126 (1), 9-12 (2006).
  12. Guinardsamuel, V., et al. Calretinin immunohistochemistry: a simple and efficient tool to diagnose Hirschsprung disease. Modern Pathology. 22 (10), 1379-1384 (2009).
  13. Robey, S. S., Kuhajda, F. P., Yardley, J. H. Immunoperoxidase stains of ganglion cells and abnormal mucosal nerve proliferations in Hirschsprung's disease. Human Pathology. 19 (4), 432-437 (1988).
  14. Monforte-Muñoz, H., Gonzalez-Gomez, I., Rowland, J. M., Landing, B. H. Increased submucosal nerve trunk caliber in aganglionosis: a "positive" and objective finding in suction biopsies and segmental resections in Hirschsprung's disease. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 122 (8), 721-725 (1998).
  15. Bachmann, L., et al. Immunohistochemical panel for the diagnosis of Hirschsprung's disease using antibodies to MAP2, calretinin, GLUT1 and S100. Histopathology. 66 (6), 824-835 (2015).
  16. Sams, V. R., Bobrow, L. G., Happerfield, L., Keeling, J. Evaluation of PGP9.5 in the diagnosis of Hirschsprung's disease. Journal of Pathology. 168 (1), 55(1992).
  17. Huang, Y., Anupama, B., Zheng, S., Xiao, X., Chen, L. The expression of enteric nerve markers and nerve innervation in total colonic aganglionosis. International Journal of Surgical Pathology. 19 (3), 303(2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

146 S100 9 5

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved