الإغراء وتقييم نموذج مورين لقصر النظر التجريبية

Summary

في هذا البروتوكول، يصف لنا كامل عملية قصر النظر التجريبية الإغراء في الفئران باستخدام المصممة حديثا النظارات وتكنيك اللازمة لتحقيق نتائج مستقرة واستنساخه في القياسات المعلمة العين.

Abstract

نموذج مورين من قصر النظر يمكن أداة قوية لبحوث قصر النظر بسبب التلاعب الجيني سهلة نسبيا. طريقة واحدة للحث على قصر النظر في الحيوانات وضع واضح ناقص العدسات أمام عينية لمدة أسابيع (المستحثة بعدسة قصر النظر، ليم). ومع ذلك، البروتوكولات القائمة للاغراء والتقييم تختلف من مختبر إلى مختبر. وهنا وصفت لنا طريقة عملية للغاية واستنساخه للحث على نظارات ليم في الفئران باستخدام المصممة حديثا. أسلوب التصحيحات العدسة ستابلي أمام العين الماوس بينما يسمح للعدسة لتكون أقلعت للتنظيف أو موضعي المخدرات الإدارة. النمط الظاهري قوية وفعالة، والفرق الصغيرة. يمكن تطبيق الطريقة الموضحة هنا للفئران الحق بعد الفطام التي تمتد مدة ممكنة للتجارب. أعطينا أيضا المشورة التقنية لتحقيق النتائج استنساخه في قياسات طول محوري والانكسار. ونأمل البروتوكول خطوة بخطوة الموصوفة هنا والمقالة مفصلة يمكن أن تساعد الباحثين القيام بتجارب قصر النظر مع قصر النظر بشكل أكثر سلاسة وجعل البيانات القابلة للمقارنة عبر المختبرات.

Introduction

معدل انتشار قصر النظر زاد بشكل كبير مؤخرا، بينما إليه ظهور وتطور إلى حد كبير لا يزال غير معروف¹. النمط الظاهري الأكثر تميزا من قصر النظر هو استطالة طول محوري (القاعدة)، مما يزيد من خطر الإصابة بمضاعفات الشبكية أو حتى عمي². لتحسين فهم الآلية المرضية لقصر النظر وتطوير علاجات فعالة، نماذج حيوانية قصر نظر قوية ومستقرة النمط الظاهري التقييم ضرورية.

باختصار، توجد طريقتين لحفز الدول قصر النظر في الحيوانات: نموذج-الحرمان قصر النظر (FDM) وقصر النظر المستحثة بعدسة (ليم)³. السابق يضع الناشرون أمام العين أو سوتوريس الجفن إلى طمس الصورة، والتي تؤثر على التطور الطبيعي لمقلة العين، مما يؤدي النمط الظاهري قصر نظر إلى. الأماكن الأخيرة ناقص العدسات أمام العين لنقل الجهة خلف الشبكية. الشبكية بالكشف عن تحول التركيز ومقلة العين لإعادة الشبكية والوصل الغضروفي. ل FDM، بعد إغلاق الجفن أو تم إصلاح الناشر أمام العين، وتكاد لا توجد صيانة المزيد مطلوب. ليم، العدسة تحتاج إلى اتخاذ للتنظيف من أجل الحفاظ على شفافية. وهكذا، FDM من السهل نسبيا أن يتسبب من الناحية الفنية. بيد أن آليات FDM ويم مختلفة، والأسلوب الذي يحاكي قصر النظر في الإنسان أفضل ما زال قيد المناقشة³. واحدة من نقاط القوة في ليم هو النمط الظاهري أقوى بالمقارنة مع FDM، على الأقل في حالة الفئران⁴.

وتشمل الحيوانات التي استخدمت لحمل قصر نظر الفراخ⁵والقرود⁶، الزبابة شجرة⁷، خنازير غينيا⁸والفئران⁴. النظر في إمكانية التلاعب بالجينات وأجسام الوفيرة المتاحة، والتكلفة المنخفضة لتربية، الفئران قد يكون الخيار الأول كنموذج الحيوان من قصر النظر. بالمقارنة مع غيرها من الحيوانات الكبيرة، تحديد العدسات أو الناشرون أمام العين الماوس غير صعبة نسبيا خاصة بالنسبة للفئران الصغار مثل حق بعد الفطام. للتجارب التي تحتاج إلى إدارة المخدرات الموضعية أو متعددة القياسات العين مؤقتاً، من الضروري أيضا للإطار أن يكون قابل للإزالة. تحد آخر وهو تغيير الماوس مقلة العين، الذي يحتاج إلى تقنيات متطورة وأجهزة لتقييم الخصائص المورفولوجية الصغيرة. وحتى الآن، حمل مختلفة وقياس البروتوكولات المستخدمة في فرق بحثية مختلفة تجعل من الصعب مقارنة وتكرار النتائج عبر المختبرات. هناك حاجة إلى بروتوكول قياسي مع التفاصيل.

ووصف الأعمال السابقة أساليب متعددة لإصلاح العدسات أو الناشرون أمام العين الماوس، مثل الالتصاق⁹، خياطة¹⁰ وحملق محمولة على رأس الإطار^11،12. نحن مجتمعة توجد تقنيات^12،11،حملق محمولة على رأس¹³ مع إطار عملنا المصممة حديثا لوضع بروتوكول يحسن لتحريض قصر تجريبية قوية وفعالة في الفئران. يمكن تطبيق البروتوكول للفئران الصغار بعد الفطام عند الولادة يوم 21 (p21). نحن أيضا الأمثل في عمليات التقييم مستقرة ودقيقة لتعمل بما في ذلك الانكسار وال. نأمل أن يكون هذا البروتوكول الموحد يمكن أن تساعد على جعل الفئران قصر نموذج أكثر سهولة للبحوث قصر النظر.

Protocol

وافق جميع الإجراءات "لجنة الأخلاقيات" في "بحوث الحيوان" كلية الطب بجامعة كيو التقيد "البيان آرفو" "استخدام الحيوانات" في أوفثالميك والبحوث الرؤية والمبادئ التوجيهية المؤسسية في "التجارب الحيوانية" في كيو جامعة، والبحوث الحيوانية: المبادئ التوجيهية لتقديم التقارير في فيفو تجارب (سيصلون) لاستخدام الحيوانات في البحوث.

1-تجميع النظارات للفئران

1. إعداد قطع الغيار اللازمة لتجميع النظارات الطبية (الشكل 1a). لكل الماوس، وإعداد جميع ما يلي: عصا النايلون مثبتة على رئيس واحد وواحدة أعلى والتيتانيوم أقل واحد الإطار، اثنين من العدسات مع القوى السليم وفقا للغرض من التجربة، الجوز واحد ل M1.4 حجم المسمار عادي واحد، M1.4 واحد حجم المسمار بطول 10 ملم غسالة ل M1.4 حجم المسمار مع سمك 0.3 مم، ونصائح الأظافر الاصطناعية اثنين (جدول المواد).
   ملاحظة: يوجد نوعين من إطارات مع ارتفاعات مختلفة. للماوس واحد، تستخدم إطار أعلى واحد وإطار واحد أقل كمجموعة. وينبغي وضع إطارات أعلى أعلاه أقل منها بغية جعل الحقول الرؤية متناظرة. الإطارات والعدسات المصممة خصيصا والمصنعة من قبل مجموعة أبحاث المؤلفين. هذه متاحة عن طريق الاتصال بالمؤلفين المناظرة من هذه المادة. يمكن العثور على أجزاء أخرى في محلات البيع بالتجزئة أداة.
2. تجميع الإطار للعين اليمنى واليسرى بشكل منفصل.
   1. ترتيب نصيحة ظفر لمواجهة الاتجاه الخارجي لتحقيق أفضل تأثير وقائي. ضبط زاوية بين طرف ظفر والإطار يكون حوالي 130° لتجنب إخفاء حقل الرؤية الماوس (الشكل 1b). تلتزم نصائح الأظافر الاصطناعية للإطار باستخدام مادة لاصقة cyanoacrylate.
      ملاحظة: يمكن أن تساعد الأظافر نصائح لحماية العدسة من التعرض الخدوش بالماوس. يجب أن يكون اتجاه نصائح ظفر المعاكس بسبب استخدام الإطار الأعلى والإطار السفلي للعين اليمنى والعين اليسرى، على التوالي.
   2. انتظر على الأقل 12 ح السماح لاصق جاف تماما، ثم استخدام ماكينة أظافر ضبط شكل الظفر نصائح لتكون عن 1 سم × 1 سم عن طريق القص والتشذيب.
   3. تنضم للإطار باستخدام مادة لاصقة cyanoacrylate العدسة. وضع العدسة على الإطار من جهة وتعقد الإطار أفقياً. حقن لاصقة cyanoacrylate من حافة العدسة، والسماح انتشار لاصقة بالتوتر السطحي.
      ملاحظة: اللاصقة سوف تآكل العدسة وتؤثر على شفافيته، لذا تأكد من اللاصق إلا يمس الجزء المحيطي للعدسة. استخدام عدسة بلانو الديوبتر 0 (د) كعنصر تحكم وناقص العدسة للحث على قصر النظر. تأثير القوى المختلفة من ناقص العدسات (–10 D إلى –50 D) وقد تم وصف⁴في أماكن أخرى. إلى أقصى حد الإغراء قصر النظر، ينصح بعدسة د –30 لتحريض قصر النظر. يمكن أيضا التي يسببها FDM مع نفس الجهاز ببساطة عن طريق تغيير العدسة إلى الحد الأقصى من 1.5 مل microtube الناشر.
3. تشديد المسمار إلى العصا النايلون جنبا إلى جنب مع الغسالة من الجانب المسطح من العصا. إعداد نظارات والعصي قبل التجربة على التوالي والأسهم لزيادة الاستخدام (الشكل 1 ج).
   ملاحظة: يمكن أن يكون مؤقتاً البروتوكول هنا.

2-القياسات الانكسار وال خط الأساس.

1. تطبيق قطره واحدة من عامل ميدرياتيك التي تحتوي على تروبيكاميدي 5 ملغ/مل و 5 ملغ/مل هيدروكلوريد فينيليفريني على كل جانب من مقلة العين تمدد التلميذ. انتظر لمدة 5 دقائق على الأقل قبل التخدير العام.
   ملاحظة: تمدد التلميذ تحت العامة التخدير سوف يسبب الساد المعكوس الذي يؤثر على قياس بعد ذلك. دائماً تمدد التلميذ قبل التخدير العام والانتظار لمدة 5 دقائق على الأقل. قطره واحدة (حوالي 0.05 مل) عامل ميدرياتيك ما يكفي معلقاً التلميذ العين الماوس، بينما عامل أكثر سوف لا تضر بالخطوات التالية.
2. ضع الماوس تحت التخدير العام. فهم الجلد الخلفي للماوس بهدوء لإبقاء الفأرة من الاهتزاز في العين حتى أنه هو فظاعتها تماما. القاضي عمق التخدير العام يكون كافياً إذا لم يتحرك الماوس عند وضعه على الطاولة بحرية.
   ملاحظة: يتم استخدام مزيج من الميدازولام (40 ميكروغرام/100 ميكروليتر)، ميديتوميديني (7.5 ميكروغرام/100 ميكروليتر) وطرطرات بوتورفانول (50 ميكروغرام/100 ميكروليتر) هنا للتخدير العام للفئران بحجم الحقن داخل 0.01 مل/غ. عموما، هناك حاجة أقل من 5 دقائق للفئران النوم. منذ وقت طويل من التخدير العام يسبب بطء ضربات القلب ودرجة حرارة الجسم منخفضة. يوصي بتجنب التأثير المحتمل للتخدير العام للقياس، الانتهاء من جميع القياسات في غضون 10 دقيقة بعد حقن المخدر. بوتورفانول المقدمة في كوكتيل مخدر توفير ما يقرب من 4 ساعات تسكين. وصفه مناسبة للتخدير العام قد مختلف المؤسسات.
3. قياس إنكسار العين الماوس باستخدام^9،4،فوتوريفراكتور الأشعة تحت حمراء¹⁴. ضبط اتجاه إحدى العينين الماوس للحفاظ على صورة بوركنجي الأولى في مركز للتلميذ وقياس الانكسار على طول المحور البصري. بعد القياس، قياس العين المقابلة مع نفس الإجراءات (الشكل 2a).
   ملاحظة: قيمة قياس الانكسار يتأثر تأثرا شديدا بموقف العين الماوس على طول المحور البصري. تأكد من محاذاة الصورة بوركنجي الأولى ضمن درجات ±3 من المركز للتلميذ. ويمكن استخدام منضدة لنظام التصوير المقطعي (SD--أكتوبر) التماسك الضوئية المجال الطيفي لضبط الاتجاه للتلميذ في مقاييس الانكسار⁴.
4. قياس العال العين الماوس باستخدام SD--أكتوبر نظام^4،،من¹⁵¹⁶. تعريف شركة كالمسافة من الذروة القرنية إلى حدود ألمع قرب العصب البصري (الشكل 2).
   ملاحظة: مماثلة مع قياس الانكسار، الجامعة تتأثر بقوة باتجاه العين الماوس. يمكن تأكيد الذروة القرنية بانعكاس مثل نقطة على السطح القرنية. وستكون حدود الجانب الشبكية ضبابي جداً عند نقطة العصب البصري. ضبط الاتجاه قليلاً للسماح للحدود أن يكون واضحا ما فيه الكفاية لقياس ولكن ليس بعيداً جداً من العصب البصري.

3-تثبيت الإطار على الجمجمة الماوس.

1. تطبيق قطره واحدة من 0.1% المنقي الصوديوم hyaluronate قطره العين لمنع جفاف في كل عين.
   ملاحظة: سوف تؤثر قطره العين على سطح العين قيم الانكسار وقياسات طول محوري. لا تستخدم قطره العين بعد التخدير حتى يتم الانتهاء من جميع القياسات.
2. وضع الذقن الماوس أنيسثيتيزيد على منحدر من الطين أو أي شيء يمكن استخدامها كوسادة لتجعل الطائرة مقدما للجمجمة تكون أفقية.
3. تعقيم الشعر وفروة الرأس بين الأذنين والعيون باستخدام مسحه القطن مع الإيثانول 70%.
4. قطع الجلد بين الأذنين والعينين لفضح الجمجمة لحول 0.8 سم² باستخدام المقص الجراحي وملاقط. استخدم مسحه النقش الأسنان السائل والقطن لإزالة في السمحاق. تعقيم بالمقص الجراحي وملاقط مع الإيثانول 70% قبل الجراحة لكل الماوس.
   ملاحظة: قص الشعر وارتداء قفازات معقمة قد تكون مطلوبة.  تحقق من أحكام اللجنة الرعاية الحيوانية ذات الصلة قبل هذا الإجراء. في معظم الحالات، يمكن الاطلاع على سائل الحفر الأسنان كأحد المرفقات في نظام لاصقة الأسنان علاج ذاتي. إذا لم يتوفر سائل الحفر الأسنان، استخدام الإيثانول 70% بدلاً من ذلك.
5. قم بتجميع مجموعة من الأطر دون عدسة للمساعدة في إصلاح العصا على الموقف الصحيح. وضع الإطارات على رأس الماوس. ضبط موضع الإطارات التأكد من كلتا العينين في منتصف الإطار الفارغ بعناية.
6. استخدام نظام لاصقة أسنان علاج ذاتي لإرفاق العصا على الرأس الماوس. احرص على عدم ترك السائل لتدفق نظام التقيد إلى العين الماوس.
   ملاحظة: يختلف الأسلوب لاستخدام نظام لاصقة الأسنان علاج ذاتي بين المنتجات. الرجوع إلى التعليمات بعناية.
   تنبيه: بعض الكواشف في نظام لاصقة الأسنان قد تكون سامة.
7. انتظر حوالي 5 دقائق وتقلع من الإطار والجوز بعناية دون تغيير موقف العصا (الشكل 3a).
8. حقن 0.75 مغ/كغ أتيباميزولي هيدروكلوريد إينترابيريتونيلي لمساعدة الماوس للتعافي من التخدير بسرعة أكبر. ضع الماوس أقفاص فردية حتى تعافي تماما. لا تترك الماوس غير المراقب حتى قد وعيه كافية للحفاظ على ريكومبينسي القصية. يمكن أن يكون مؤقتاً البروتوكول هنا.

4-بدء التعريفي قصر النظر والصيانة بعد ذلك

1. انتظر 24 ساعة على الأقل بعد عملية جراحية للسماح للماوس التعافي من التخدير تماما. أمسك العصا ووضع الإطارات مع العدسات. الإغراء يبدأ عند هذه النقطة الزمنية (الشكل 3b).
   ملاحظة: لتقليل عدم الراحة أثناء التعافي من التخدير، وإعطاء الوقت الكافي لنظام لاصقة الأسنان يتجمد، ينصح بوضع الإطار بعد الفئران تعافي تماما من التخدير. وسيغطي أسمنت الراتنج نظام لاصقة تماما القطع من فروة الرأس. ولذلك، مطلوب لا معاملة خاصة بعد الجراحة للوقاية من العدوى وتخفيف الألم بعد الجراحة. الحق بعد المرة الأولى من وضع الإطار، سوف تكون أكثر إدراكا منها لوجود العدسة الفئران والصفر كثيرا. السلوك الإجمالي سوف يعود إلى طبيعته بعد بضع ساعات. يمكن الاحتفاظ بالفئران مع عدسات بنفس الكثافة للفئران العادية.
2. إزالة الإطار وتنظيف العدسات ونصائح ظفر مع مسحات القطن على الأقل مرتين في أسبوع للحفاظ على شفافية العدسة.
   ملاحظة: ليس من الضروري وضع الماوس تحت التخدير لإزالة ووضع في الإطار. توفير دعم للفئران الجلوس على، بدلاً من وجود لهم إنهاء أثناء العمل معهم يمكن أن تقلل من الشدة.
   1. إذا كان مقياس مؤقتة اللازمة، وضع الماوس تحت التخدير وقياس الماوس كما تم وصفه سابقا. ويمكن أن تستمر الإغراء بعد الماوس يتعافى من التخدير.
3. قم بتنظيف القفص على الأقل مرتين في أسبوع.
   ملاحظة: هذه التعليمات الحفاظ على وضوح العدسة. كما قد يكون من المفيد وضع شبكة بين الماوس وأسفل القفص filtrate قصاصات الغذاء.
4. مراقبة وزن الجسم والسلوك الإجمالي. قارن لهم نفس السن الفئران لم يمسها أثناء عملية تجريبية كاملة.
   ملاحظة: باستثناء بعض السلوكيات الخدش، هو إيجاد أي تغيير ملموس بما في ذلك وزن الجسم بين فئران التجارب مع الفئران غير المعالجة.

النتائج

أولاً، تحقق في حالة استعداد جميع قطع الغيار اللازمة (الشكل 1a). ويرد مثال على قطعة من النظارات الطبية المجمعة في الشكل 1b. باستثناء الجزء الرئيسي من الإطارات والجوز، جميع أجزاء أخرى المتاح لكل الماوس. مجموعة من النظارات المكتملة يرد في

Discussion

للتأكد من النظارات الطبية لتكون ثابتة ستابلي على رأسه الماوس، عدة خطوات في هذا البروتوكول بحاجة إلى إيلاء اهتمام كبير. يجب إزالة في السمحاق تماما قبل استخدام نظام لاصقة طب الأسنان. الدم في الجمجمة أيضا تحتاج إلى تنظيف بعناية. بينما ضبط القليل مقبول الحق بعد تطبيق اللاصقة، لا تقم بتحريك ال?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
screw	NBK	SNZS-M1.4-10
washer	MonotaRO	42166397
nut	MonotaRO	42214243
stick	DMM Make	none	designed by authers and output by the 3D printer rented from DMM Make.
frame	DMM Make	none	designed by authers and output by the 3D printer rented from DMM Make.
lenses	RAINBOW CONTACT LENS	none	customized for mice use by the company
cyanoacrylate glue	OK MODEL	MP 20g
dental adhesive resin cement	SUN MEDICAL	super bond	contains the etching liquid used for removing the periosteum of the mouse skull
infrared photorefractor	Steinbeis Transfer Center	none	designed and offered by Dr. Frank Schaeffel from university of Tübingen
Spectral domain OCT	Leica	R4310
Tropicamide, Penylephrine Hydrochloride solution	Santen	Mydrin-P
midazolam	Sandoz K.K.	SANDOZ	components for the anesthetic
medetomidine	Orion Corporation	Domitor	components for the anesthetic
butorphanol tartrate	Meiji Seika Pharma	Vetorphale	components for the anesthetic
0.1 % purified sodium hyaluronate	Santen	Hyalein
atipamezole hydrochloride	Zenoaq	antisedan