كشف الذيفان في تركيبات النانو باستخدام فحوصات ليستي (ال) أموبوسيتي ليمولوس

Summary

الكشف عن اندوتوكسينس في المواد النانوية المهندسة يمثل أحد التحديات الكبرى في مجال لطب النانوي. نقدم هنا، دراسة حالة يصف إطار يتألف من ثلاثة أشكال لل مختلفة لتقدير احتمال تلوث الذيفان في جسيمات نانوية.

Abstract

عندما تكون موجودة في المنتجات الصيدلانية، الذيفان مكون جدار الخلية البكتيريا سلبية الغرام (يسمى غالباً أيضا lipopolysaccharide) يمكن أن يسبب التهاب وحمى وقصور-أو ارتفاع ضغط الدم، وفي الحالات القصوى، يمكن أن يؤدي إلى تلف الجهاز والأنسجة التي قد تصبح قاتلة. ولذلك، كميات الذيفان في المنتجات الصيدلانية، دقة تخضع. بين الطرق المتاحة لكشف الذيفان والتقدير الكمي، ويشيع استخدام الإنزيم ليمولوس أموبوسيتي ليستي (ال) في جميع أنحاء العالم. بينما أي منتج الأدوية يمكن أن تتداخل مع المقايسة لل، نانو-تركيبات تمثل تحديا خاصا بسبب تعقيدها. والغرض من هذه الورقة تقديم دليل عملي للباحثين عديمي الخبرة في تقدير اندوتوكسينس في هندسة المواد النانوية وصاغت نانوحبيبات المخدرات. وتناقش هذه الوثيقة، توصيات عملية لأداء ثلاث صيغ لل بما في ذلك التكدر، اللونية وفحوصات تجلط هلام. يمكن استخدام هذه الاختبارات لتحديد التلوث الذيفان في المنتجات المستندة إلى تقنية النانو العقاقير واللقاحات والمواد المساعدة.

Introduction

الذيفان لبنة من جدار الخلية البكتيريا سلبية الغرام^1،2. يمكن تنشيط الخلايا المناعية في جداً منخفضة (حلول) تركيزات^1،2. الوسطاء proinflammatory (السيتوكينات، اليوكوترين، ايكوسانويدس، إلخ) التي تنتجها الخلايا في الاستجابة إلى الذيفان المسؤولة عن الحمى وانخفاض ضغط الدم، وارتفاع ضغط الدم، وأشد المشاكل الصحية بما في ذلك فشل الجهاز متعددة ^{1 , 2 , 3}-شدة المناعي بوساطة الآثار الجانبية الناجمة عن الذيفان يعتمد على فاعلية ما يحدده تكوين الذيفان وهيكل ويقاس في الذيفان الدولية وحدات (IUs أو أوروبا)³. عدد هذه الوحدات للكيلوغرام الواحد من وزن الجسم يستخدم لتعيين عتبة ﻻنبعاثات جرعة الذيفان. هذه الجرعة من الاتحاد الأوروبي 5/كغ للمنتجات الدوائية التي تديرها عبر جميع الطرق لكن الطريق إينتراثيكال. الأدوية مداوي كل متر مربع من سطح الجسم والسوائل اللاصقة والمواد المشعة والمنتجات التي تدار عن طريق توجيه intrathecal لها جرعة •انبوب عتبة مختلفة، وهو 100 الاتحاد الأوروبي/م²، 0.2 مليلتر الاتحاد الأوروبي، الاتحاد الأوروبي 175/V (حيث الخامس حجم المنتج المقصود للإدارة)، والاتحاد الأوروبي 0.2/كغ على التوالي⁴. مزيد من التفاصيل حول الجرعة ﻻنبعاثات عتبة لمختلف المنتجات الدوائية والأجهزة ومناقشتها في مكان آخر^4،،من⁵⁶.

الحيوانات تختلف على نطاق واسع في حساسيتها لردود الفعل بوساطة الذيفان. البشر والرئيسيات غير البشرية والأرانب من بين الأنواع الأكثر بالغة الحساسية إلى اندوتوكسينس³. لتجنب الآثار الجانبية بوساطة الذيفان في المرضى ومنع استنتاجات غير دقيقة للسمية الإكلينيكية والدراسات فعالية، من الضروري لدقة كشف وتحديد endotoxins في صياغات الصف السريرية وقبل السريرية على حد سواء. العديد من الأساليب المتاحة حاليا ويمكن تحقيق هذه المهمة. واحد منهم هو الإنزيم ليمولوس أموبوسيتي ليستي (ال)، الذي يستخدم عادة في جميع أنحاء العالم للمنتجات الطبية الحيوية الشاشة للتلوث الذيفان المحتملة، فضلا عن الكشف عن الإصابات البكتيرية^7،،من⁸⁹. مستعدة من أموبوسيتيس، والخلايا الموجودة في دم سرطان حدوة الحصان ليمولوس بوليفيموس يقيمون في الساحل الشرقي لقارة أمريكا الشمالية⁷. من المثير للاهتمام، وهناك عدد قليل من أنواع مختلفة من سرطان حدوة الحصان (تاتشيبليوس gigas و تريدينتاتوس تاتشيبليوس) في آسيا¹⁰. ليستي أموبوسيتي تاتشيبليوس (تل) يستخدم في العديد من البلدان الآسيوية للكشف عن الذيفان مماثلة لكيفية استخدام ال في أخرى [كونتريس¹⁰. ليساتيس (لل وتل) تحتوي على مجموعة من البروتينات التي تمنح النشاط حوزتي عند التنشيط. يتم تنشيط واحدة من هذه البروتينات، وعامل ما يسمى ج عند الاتصال مع الذيفان. تنشيط "عامل ج" كليفس "عامل ب"، الذي بدوره أيضا يصبح حوزتي وكليفس إنزيم تخثر الموالية لإنتاج إنزيم تخثر. ونتيجة لهذا السلسلة من ردود الفعل هو تكوين هلام، زيادة في تعكر عينة، وحضور الركازة اللونية، مظهر المنتج الملونة، التي تكون بمثابة أساس لجل-كلوت والتعكر وفحوصات اللونية، على التوالي. بينما لا يوجد أي شكل لل إلزامية، يشرح "لنا الغذاء" والدواء (FDA) في التوجيه بشأن الوثيقة الصناعة، أنه في حالة الاختلاف في نتائج الاختبار بين صيغ مختلفة لل، هو اتخاذ القرار استناداً إلى المقايسة هلام-كلوت⁵ .

كثير يشيع استخدام المواد الكيميائية المختبرية (على سبيل المثال-، يدتا) وفحوصات المخدرات المعروفة المنتجات (مثل البنسلين) تتداخل مع ال¹¹. عادة ما يتم تعريفه التدخل بتقييم انتعاش الذيفان الموحدة ارتفعت بتركيز معلوم في محلول يحتوي على مادة الاختبار. إذا كان الانتعاش سبايك أقل من 50% أو أكثر من 200%، ثم نتيجة لل الاعتداء لمواد الاختبار المعطى غير صحيح بسبب تثبيط أو تعزيزها، على التوالي⁴. صيغ على أساس تكنولوجيا النانو غالباً ما تكون معقدة وتتداخل مع ال من خلال مجموعة متنوعة من الآليات^12،،من¹³¹⁴. وقد وصف العديد من النهج للتغلب على التدخل: إعادة تشكيل عينة في مخازن محددة والتوتر السطحي، المنظمة البروتين بالتدفئة، تدمير القاعدة الدهنية المواد جوفاء بالتدفئة والمكمل للعينة مع فائض الكاتيونات ديفالينت^{5،12،13،،}من¹⁴¹⁵. كما وقد وصف أساليب بديلة لحالات عندما لا يمكن التغلب على التدخل لل: أليسا, خط خلية مراسل HEK TLR4 المقايسة، والطيف الكتلي^16،،من^{1718، 19}.

هنا، يتم وصف الإجراءات التجريبية لإجراء هلام-كلوت والتعكر واللونية لل فحوصات. هذه الاختبارات متاحة أيضا على موقع مختبر توصيف تكنولوجيا النانو (نكل)²⁰ في البروتوكولات STE1.2 (التعكر لل)، STE1.3 (لل جل-كلوت) و STE1.4 (لل اللونية). من المستحسن القيام بشكلين مختلفين على الأقل لوصف نفس النانو-الصيغة. عندما اختلف نتائج التعكر وال اللونية، تعتبر النتائج تجلط جل⁵. عندما اختلف نتائج صيغتين لل، أجرى إضافية النتائج التي توصلت إليها الدراسات باستخدام اختبار التنشيط الوحيدات (حصيرة) أو اختبار مولد أرنب (RPT) للتحقق من ال²¹. من المهم أن نلاحظ أن كل أسلوب يستخدم للكشف عن الذيفان وتقييم بيروجينيسيتي له مزايا وقيود^21،22،،من²³²⁴. إذ تسلم بالقيود المفروضة على الإجراءات المستخدمة لوصف صيغة معينة تقنية النانو ضروري للحصول على مبرر علمي للاستخدام الإجراء الأمثل لذلك النانو-الصياغة.

في هذه الدراسة، استخدمت ميتوتريكسات الاسمافرون سي كصيغة نانوحبيبات نموذجي. هذه الصيغة تم وافق "لنا إدارة الأغذية والعقاقير" في عام 1995 وتستخدم لعلاج مرضى السرطان في جميع أنحاء العالم²⁵.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1-إعداد العينات نانوحبيبات

1. إعداد عينة الدراسة في ال المياه الصف.
2. إذا كان الرقم الهيدروجيني عينة خارج نطاق 6-8، ضبط الرقم الهيدروجيني باستخدام هيدروكسيد الصوديوم خالية من مولد أو حمض الهيدروكلوريك.
3. استخدام ال الصف المياه يعد تخفيف العديد من عينة الدراسة. تأكد من أن إضعاف أعلى لا تتجاوز الحد الأقصى تمييع صالحة (MVD). الرجوع إلى قسم النقاش لمزيد من التفاصيل حول تقدير MVD.

2-إعداد الكواشف المشتركة بين صيغ ال

1. الأسهم مخفف من هيدروكسيد الصوديوم تركيز استخدام خالية من مولد ال كاشف المياه لإعداد حل عامل بتركيز 0.1 n.
2. تمييع الأسهم حمض الهيدروكلوريك تركيز استخدام خالية من مولد ال كاشف المياه وتعد حلاً عامل نهائي بتركيز 0.1 n.
3. إعداد الذيفان التحكم القياسية (CSE)
   1. إعادة تشكيل CSE وفقا لشهادة التحليل تم توفيره بواسطة الشركة المصنعة.
      ملاحظة: تشير إلى قسم مناقشة الملاحظات الهامة فيما يتعلق بالمعلومات الواردة في الشهادة. الرجوع إلى الجدول للمواد للحصول على التفاصيل المتعلقة بعدد النشرة المصورة وتطبيق صيغة CSE المعطى في تنسيقات مختلفة لل.
4. إعداد الكاشف لل
   1. إعادة تشكيل الكاشف لل وفقا لشهادة التحليل التي توفرها الشركة المصنعة.
      ملاحظة: راجع قسم مناقشة تفاصيل هامة تتعلق بإعداد كاشف لل. الرجوع إلى الجدول للمواد للحصول على التفاصيل المتعلقة بعدد النشرة المصورة وتطبيق صيغة ال كاشف معين في تنسيق مختلف لل.

3-التعكر المقايسة لل

1. إعداد معايير المعايرة
   1. استخدام ميليلتر 900 لل الصف المياه و 100 ميليلتر من CSE، إعداد العديد من تخفيف المتوسطة حسب الحاجة لتمكين إعداد معايرة قياسية بتركيز يتراوح من 0.001 إلى الاتحاد الأوروبي 1/مل.
   2. أولاً تسمية أنابيب وإضافة 900 ميكروليتر من المياه الصالحة لل في كل أنبوب. قم بإضافة 100 ميكروليتر من سولوتيون الاتحاد الأوروبي/مل 10 إعداد المعايرة القياسية مع تركيز 1EU/mL.
   3. كرر تمييع الوقت المسلسل كما هو موضح أعلاه لإعداد ثلاثة معايير المعايرة أقل. تحقق من أن أربعة معايير معايرة تتراوح بين 0.001 إلى الاتحاد الأوروبي 1/mL قد أعدت.
2. إعداد عناصر تحكم الجودة
   1. إعداد عنصر تحكم جودة الاتحاد الأوروبي/mL 0.05 بالجمع بين 50 ميليلتر من الحل CSE الاتحاد الأوروبي/ملليلتر 1 ميليلتر 950 من المياه الصالحة لل.
      ملاحظة: تشير إلى قسم النقاش لمزيد من التفاصيل بشأن إعداد عنصر التحكم.
3. إعداد الضوابط تثبيط/تعزيز (IEC)
   1. تعد اللجنة الانتخابية المستقلة مع تركيز 0.05 الاتحاد الأوروبي/mL بضم 25 ميليلتر من الحل CSE الاتحاد الأوروبي/ملليلتر 1 و 475 ميليلتر من نانوماتيريال الاختبار في إضعاف معين.
      ملاحظة: راجع قسم المناقشة للحصول على تفاصيل إضافية.
4. الإجراء التجريبي
   1. تسمح أداة الاحماء بتحويلها على ما يقرب من 30 دقيقة في وقت مبكر. الإعداد الكشف عن الطول الموجي إلى 660 نيوتن متر كهذا المناسب التعكر لل.
   2. تسجيل الدخول بكتابة اسم المستخدم وكلمة المرور.
   3. افتح البرنامج (جدول المواد) بواسطة النقر فوق الرمز المطابق على شاشة كمبيوتر.
   4. حدد تجميع البيانات في شاشة البرنامج الرئيسية. أدخل معلومات مجموعة اختبار البيانات ومعرف في المساحة المقابلة في علامة التبويب عام على الشاشة الرئيسية.
   5. انقر فوق علامة التبويب الأجهزة اختيار نوع الصك من قائمة منسدلة.
   6. الإعداد الكشف عن الطول الموجي إلى 660 شمال البحر الأبيض المتوسط حيث أن هذا مناسب التعكر لل التي تنحاز الأسلوب التعكر لل.
   7. تحقق من أن الرقم التسلسلي ومعرف النظام ومعلومات المنفذ التسلسلي تظهر على الشاشة. انقر فوق "موافق". انقر فوق موافق مرة أخرى للتأكيد.
   8. أدخل معرف العينة بنفس الترتيب التي يتم اختبار العينة. استخدم الأزرار الافتراضية لإدخال المراقبة السلبية، القياسية منحنى واختبار العينات.
   9. إعداد أنابيب المكررة لكل عينة وإضافة 200 ميليلتر (اختبار نسبة 4:1) أو 100 ميليلتر (اختبار نسبة 1:1) لمراقبة سلبية (المياه)، معايير المعايرة، مراقبة الجودة، وجسيمات نانوية اللجنة الانتخابية المستقلة، واختبار في أنابيب زجاجية المسمى مسبقاً.
   10. إضافة 50 ميليلتر (اختبار نسبة 4:1) أو 100 ميليلتر (اختبار نسبة 1:1) من ال كاشف لأول اختبار قنينة، دوامة أنه بإيجاز، وإدراج في اختبار فتحه في دائري الصك. إذا تم استخدام نسبة 1:1، هو حجم الكاشف لل 100 ميليلتر.
   11. كرر الإجراء الموضح أعلاه لعينات أخرى. عملية عينات في وقت واحد.
       ملاحظة: تشير إلى قسم النقاش لمزيد من التفاصيل.

4-اللونية لل

1. إعداد معايير المعايرة
   1. استخدام ميليلتر 900 لل الصف المياه و 100 ميليلتر من CSE، إعداد العديد من تخفيف المتوسطة حسب الحاجة لتمكين إعداد معايرة قياسية مع تركيز الاتحاد الأوروبي 1/مل.
   2. استخدام المياه الصالحة لل ميليلتر 900 و 100 ميليلتر لمعايرة الاتحاد الأوروبي/ملليلتر 1 القياسية، يعد معياراً معايرة ثانية بتركيز 0.1 الاتحاد الأوروبي/مليلتر.
   3. كرر تمييع الوقت المسلسل كما هو موضح أعلاه لإعداد معايير المعايرة أقل اثنين. تحقق من أن أربعة معايير معايرة تتراوح بين 0.001 إلى الاتحاد الأوروبي 1/mL قد أعدت.
2. إعداد ضوابط الجودة.
   1. إعداد عنصر تحكم جودة الاتحاد الأوروبي/mL 0.05 بالجمع بين 50 ميليلتر من الحل CSE الاتحاد الأوروبي/ملليلتر 1 ميليلتر 950 من المياه الصالحة لل.
      ملاحظة: تشير إلى قسم النقاش لمزيد من التفاصيل بشأن إعداد عنصر التحكم.
3. إعداد الضوابط تثبيط/تعزيز (IEC)
   1. يعد الاتحاد الأوروبي مليلتر 0.05 بالجمع بين 25 ميكروليتر من الحل CSE الاتحاد الأوروبي/ملليلتر 1 ميكروليتر 475 من اختبار نانوماتيريال.
      ملاحظة: راجع قسم المناقشة للحصول على تفاصيل إضافية.
4. الإجراء التجريبي
   1. تسمح أداة الاحماء بتحويلها على ما يقرب من 30 دقيقة في وقت مبكر. الإعداد الكشف عن الطول الموجي إلى 405 نانومتر كهذا المناسب التعكر لل.
   2. افتح البرنامج بالنقر على أيقونة المقابلة على شاشة كمبيوتر. تسجيل الدخول بكتابة اسم المستخدم وكلمة المرور.
   3. حدد تجميع البيانات في شاشة البرنامج الرئيسية. أدخل معلومات المجموعة معرف وبيانات الاختبار إلى الفضاء المقابلة في علامة التبويب عام على الشاشة الرئيسية.
   4. انقر فوق علامة التبويب الأجهزة اختيار نوع الصك من قائمة منسدلة. اختيار الصك.
   5. تحقق من أن الرقم التسلسلي ومعرف النظام ومعلومات المنفذ التسلسلي تظهر على الشاشة. انقر فوق "موافق". انقر فوق موافق مرة أخرى للتأكيد.
   6. أدخل معرف العينة بنفس الترتيب التي يتم اختبار العينة. استخدم الأزرار الافتراضية لإدخال المراقبة السلبية، القياسية منحنى واختبار العينات.
   7. إعداد أنابيب المكررة لكل عينة وإضافة 200 ميليلتر (اختبار نسبة 4:1) أو 100 ميليلتر (اختبار نسبة 1:1) لمراقبة سلبية (المياه)، معايير المعايرة، مراقبة الجودة، وجسيمات نانوية اللجنة الانتخابية المستقلة، واختبار في أنابيب زجاجية المسمى مسبقاً.
   8. إضافة 50 ميليلتر (اختبار نسبة 4:1) أو 100 ميليلتر (اختبار نسبة 1:1) من ال كاشف لأول اختبار قنينة، دوامة أنه بإيجاز، وإدراج في اختبار فتحه في دائري الصك. إذا تم استخدام نسبة 1:1، هو حجم الكاشف لل 100 ميليلتر.
   9. كرر الإجراء الموضح أعلاه لعينات أخرى. عملية عينات في وقت واحد.

5-جل-كلوت لل

ملاحظة: يحدد هذا الفحص وجود endotoxins في العينة على أساس الملاحظة البصرية والكشف عن تجلط في أنبوب رد فعل. فيما يلي الخطوات التجريبية. استخدام ورقة البدلاء لتسجيل النتائج. هذه الورقة مقاعد البدلاء ليس إلزامياً، وطرق أخرى لتسجيل نتائج الفحص مقبولة أيضا. ويرد مثال على ورقة البدلاء في المواد التكميلية لراحة القارئ. لامدا (l) حساسية المقايسة جل جلطة وهو 0.03 الاتحاد الأوروبي/مل.

1. قم بتسمية العديد من رد فعل الأنابيب اللازمة لاستيعاب عدد عينات الاختبار تم تحليلها. الرجوع إلى ورقة البدلاء للحصول على تفاصيل حول عدد replicates المستخدمة في الخطوة 1 والخطوة 2 والخطوة 3 للمقايسة.
2. الكوة 100 ميكروليتر من عينة المياه أو عناصر التحكم أو اختبار كل أنبوب.
3. يعد محرك البحث أن تركيز نهائي يساوي 4λ.
4. الجمع بين 100 ميكروليتر من المعايير المذكورة أعلاه مع 100 ميكروليتر من عينة المياه أو اختبار لتحقيق التركيز النهائي لمحرك البحث 2λ. كرر ثلاث مرات أكثر لتحقيق أمداً ونصف-أمداً وربع لامدا.
5. تأكد من أن درجة الحرارة في حوض ماء 37 درجة مئوية.
6. إضافة 100 ميكروليتر من في أنبوبة الاختبار، دوامة بإيجاز ووضع على الرف مع جميع الأنابيب في حمام الماء ح 1.
7. عكس الأنبوب مع حركة ناعمة.
8. نتائج السجل يدوياً باستخدام "+" (شركة جلطة) أو "–" (لا جلطة أو جلطة فضفاضة) على ورقة مقاعد البدلاء.
9. المضي قدما في التحليل وفقا لجامعة جنوب المحيط الهادئ الرهان 85⁴؛ واستخدام ورقة البدلاء كمواد الدعم

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

على سبيل المثال البيانات التي تم إنشاؤها بعد اختبار هذه الصيغة في فحوصات ال يرد في الجدول 1. وتدخلت ميتوتريكسات الاسمافرون سي ال اللونية في تمييع 5. ومع ذلك، تم التغلب على هذا التدخل بتخفيف أكبر. كان الانتعاش ارتفاع يتراوح بين 50 و 200 في المائة عندما تم اختبار هذه ال...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

المعلومات الواردة في هذا البروتوكول قد وصفت قبل^15،26 وتعتمد على العديد من الوثائق التنظيمية التي نشرتها لنا الغذاء والدواء (إدارة الأغذية والعقاقير الأمريكية أو إدارة الأغذية والعقاقير) ودستور الأدوية الأمريكية (USP)^{4 , 5 ,}

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Turbidity LAL Assay
Sodium Hydroxide	Sigma	S2770	When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8
Hydrochloric acid	Sigma	H9892	When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8
LAL Reagent	Associates of Cape Cod	T0051	This reagent can be used with turbidity assay only
Control Endotoxin Standard	Associates of Cape Cod	E0005	This reagent can be used with turbidity and gel-clot assays
LAL grade water	Associates of Cape Cod	WP0501	This reagent can be used with any LAL format
Glucashield Buffer	Associates of Cape Cod	GB051-25	Used to prevent false-positive response from beta-glucans
Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mm	Associates of Cape Cod	TB240	These tubes can be used with all three assays
Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 8 x 75 mm	Associates of Cape Cod	TK100	These tubes can be used with turbidity and chromogenic assays
Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1.0 mL	RAININ	PPT25, PPT10	Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed
Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mL	Eppendorf	22600044	Other equivalent supplies can be used
Pyrogen-fee combitips, 5mL	Eppendorf	30089669	Other equivalent supplies can be used
Repeat pipettor	Eppendorf	4982000020	Other equivalent supplies can be used
Microcetrifuge	any brand		Any brand can be used
Refrigerator, 2-8 C	any brand		Any brand can be used
Vortex	any brand		Any brand can be used
Freezer, -20 C	any brand		Any brand can be used
Pyros Kinetix or Pyros Kinetix Flex reader	Associates of Cape Cod	PKF96	Other instruments can be used. However, LAL reagents and endotoxin standards used in this assay may require optimization. When other instrumentation is used, please refer to the instrument and LAL kit manufacturers for instructions
Chromogenic LAL Assay
Pyrochrome LAL Reagent	Associates of Cape Cod	CG1500-5	This reagent is specific to the Chromogenic Assay
Control Endotoxin Standard	Associates of Cape Cod	EC010	This standard is different than that used for turbidity and gel-clot LALs; it is optimized for optimal performance in the chromogenic assay
Sodium Hydroxide	Sigma	S2770	When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8
Hydrochloric acid	Sigma	H9892	When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8
LAL grade water	Associates of Cape Cod	WP0501	This reagent can be used with any LAL format
Glucashield Buffer	Associates of Cape Cod	GB051-25	Used to prevent false-positive response from beta-glucans
Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mm	Associates of Cape Cod	TB240	These tubes can be used with all three assays
Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 8 x 75 mm	Associates of Cape Cod	TK100	These tubes can be used with turbidity and chromogenic assays
Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1.0 ml	RAININ	PPT25, PPT10	Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed
Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mL	Eppendorf	22600044	Other equivalent supplies can be used
Pyrogen-fee combitips, 5mL	Eppendorf	30089669	Other equivalent supplies can be used
Repeat pipettor	Eppendorf	4982000020	Other equivalent supplies can be used
Microcetrifuge	any brand		Any brand can be used
Refrigerator, 2-8 C	any brand		Any brand can be used
Vortex	any brand		Any brand can be used
Freezer, -20 C	any brand		Any brand can be used
Pyros Kinetix or Pyros Kinetix Flex reader	Associates of Cape Cod	PKF96	Other instruments can be used. However, LAL reagents and endotoxin standards used in this assay may require optimization. When other instrumentation is used, please refer to the instrument and LAL kit manufacturers for instructions
Gel-Clot LAL Assay
LAL Reagent	Associates of Cape Cod	G5003	This reagent is specific to the gel-clot assay
Control Endotoxin Standard	Associates of Cape Cod	E0005	This reagent can be used with turbidity and gel-clot assays
Sodium Hydroxide	Sigma	S2770	When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8
Hydrochloric acid	Sigma	H9892	When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8
LAL grade water	Associates of Cape Cod	WP0501	This reagent can be used with any LAL format
Glucashield Buffer	Associates of Cape Cod	GB051-25	Used to prevent false-positive response from beta-glucans
Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mm	Associates of Cape Cod	TB240	These tubes can be used with all three assays
Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 10 x 75 mm	Associates of Cape Cod	TS050	These tubes are for use with the gel-clot assay
Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1 mL	RAININ	PPT25, PPT10	Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed
Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mL	Eppendorf	22600044	Other equivalent supplies can be used
Pyrogen-fee combitips, 5mL	Eppendorf	30089669	Other equivalent supplies can be used
Repeat pipettor	Eppendorf	4982000020	Other equivalent supplies can be used
Microcetrifuge	any brand		Any brand can be used
Refrigerator, 2-8 C	any brand		Any brand can be used
Vortex	any brand		Any brand can be used
Freezer, -20 C	any brand		Any brand can be used
Water bath, 37 C	any brand		Any brand can be used, however, it is important either to switch off water circulation or use non-circualting water bath because water flow will affect clot formation and lead to false-negative results