JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

وهنا، نقدم بروتوكول لإعداد الخلايا المفردة من الغدة الصعترية مورين، البنكرياس تصب العقدة الليمفاوية والطحال إلى مواصلة دراسة هذه الخلايا باستخدام التدفق الخلوي. وبالإضافة إلى ذلك، تم استخدام هذا البروتوكول لتحديد مجموعات فرعية الخلايا التائية التنظيمية باستخدام التدفق الخلوي.

Abstract

لدينا الجهاز المناعي يتكون من عدد ومتنوعة من الخلايا المناعية بما في ذلك الخلايا خلايا (تريغ) T التنظيمية. ويمكن تقسيم الخلايا تريغ مجموعات فرعية اثنين والغدة الصعترية المشتقة من الخلايا تريغ (تريج) والمستحثه محيطيا تريغ (بتريج) الخلايا. وهي موجودة في مختلف أجهزة الجسم ويمكن تمييزها بعلامات معينة، مثل هيليوس ونيوروبيلين 1. وأفيد أن خلايا تريج وظيفيا القمعية أكثر من الخلايا بتريج. ولذلك، من المهم تحديد نسبة خلايا تريج وبتريج عند التحقيق في الخلية غير المتجانسة السكان. وهنا، جمعنا الغدة الصعترية الغدد الليمفاوية تجفيف البنكرياس والطحال من الفئران السكري غير السمنة نورموجليسيميك لتمييز خلايا تريج من الخلايا بتريج استخدام التدفق الخلوي. قمنا بإعداد تعليق خلية واحدة فقط من هذه الأجهزة يدوياً. Fluorochrome مترافق السطحية CD4، CD8، CD25، واستخدمت الأجسام المضادة نيوروبيلين 1 وصمة عار الخلايا. وضعوا في الثلاجة بين عشية وضحاها. في اليوم التالي، كانت ملطخة الخلايا fluorochrome مترافق أضداد Foxp3 وهيليوس داخل الخلايا. واستخدمت هذه العلامات لوصف المجموعات اثنين من الخلايا تريغ. هذا البروتوكول يوضح طريقة بسيطة ولكنها عملية لإعداد الخلايا المفردة من الغدة الصعترية مورين، البنكرياس تصب العقدة الليمفاوية والطحال واستخدامها لأغراض تحليل سيتوميتريك تدفق اللاحقة.

Introduction

خلايا تي (تريغ) التنظيمية حاسمة بالنسبة للتوازن للجهاز المناعي. تعرف الخلايا تريغ التعبير عن المستضدات السطحية CD4 و CD25، والنسخ عامل فورخيد مربع P3 (Foxp3)1،،من23. وأظهرت ساكاجوتشى et al. أولاً أعرب CD25 هو مؤثرا في تي القامع الخلايا في الفئران4، الذي ينص مراقبة رائدة للتعرف على الخلايا البشرية تريغ. تريغ خلايا تلعب دوراً مركزياً في منأى عن التسامح بما تمارسه من قدرة قمعية عبر مجموعة متنوعة من الآليات، بما في ذلك سيتوليسيس عن طريق إفراز جرانزيميس للحث على المبرمج واستهلاك سيتوكين وتثبيط من خلال التعبير عن السامة للخلايا اللمفاويات التائية مستضد 45. بالإضافة إلى ذلك، أنها يمكن أن تفرز السيتوكينات المثبطة مثل تحويل عامل النمو بيتا (TGF-β)، انترلوكين-10 (إيل-10)، وايل-355. يمكن بطبيعة الحال أن يستمد تريغ خلايا من الغدة الصعترية، في هذه الحالة يتم تعيينهم الغدة الصعترية المشتقة من الخلايا تريغ (تريج)، أو أنهم يمكن أن يتسبب في الأجهزة الطرفية في هذا الحالة تسمى محيطيا المستحث تريغ (بتريج) الخلايا.

هيليوس، عضو الأسرة عامل النسخ إيكاروس، أفيد بأن علامة للتمييز بين خلايا تريج والخلايا بتريج6. في وقت لاحق، أفادت مجموعتين أخريين أن مستقبل الثالث سيمافورين، نيوروبيلين 1 (Nrp1)، يمكن أن تخدم كعلامة سطحية لخلايا تريج تحت بعض الظروف7،8. ومع ذلك، أظهرت سينغ et al. أن Helios علامة أفضل في هذا السياق بالسذاجة الفئران9.

مجموعات فرعية الخلايا تريغ تلعب دوراً محوريا في الحفاظ على التوازن في الجهاز المناعي، وفي الحماية من العدوى والمناعة الذاتية. ولذلك، من المهم تحديد أرقام ونسب هؤلاء السكان في الأنسجة اللمفاوية وغير اللمفاوية على حد سواء. ولتحقيق ذلك، يتعين على المرء أن إعداد تعليق خلية واحدة فقط من هذه الأجهزة. تم وصف عدد من البروتوكولات أو المستخدمة في الدراسات السابقة. أساسا، ديسوسياتورس التلقائي قد استخدمت في التقارير المنشورة سابقا10،11. ديسوسياتورس التلقائي باستخدام مناسب وتوفير الوقت، وإنما إجراء مكلفة. ولذلك، استخدمنا أسلوب يدوي لإعداد تعليق خلية مفردة من مورين الغدة الصعترية الغدد الليمفاوية تجفيف البنكرياس (بدلنس) والطحال من الفئران (الإيماءة) السكري غير السمنة نورموجليسيميك، وعزل الخلايا المفردة من هذه الأجهزة. وقد استخدم هذا الأسلوب في دراساتنا السابقة ووجدنا أن الطريقة اليدوية لإعداد تعليق خلية مفردة بكفاءة ديسوسياتور التلقائي الأسلوب9،12،،من1314. وعلاوة على ذلك، استخدمنا التدفق الخلوي لتحديد نسب CD4+CD8–CD25+Foxp3+ تريغ خلايا ومجموعات فرعية من تريغ الخلايا خلايا تريج وبتريج. تم تمييز خلايا تريج وبتريج استخدام هيليوس و Nrp1 كعلامات لخلايا تريج. وهكذا، تشير النتائج التي توصلنا إليها أن الطريقة اليدوية لإعداد الخلايا المفردة العمل بكفاءة، ويمكن استخدام تعليق خلية واحدة مستعدة كذلك لدراسات استخدام التدفق الخلوي.

Protocol

وافقت لجنة الأخلاقيات الحيوانات المحلية في جامعة أوبسالا في التجارب على الحيوانات.

1-جمع الأجهزة من الحيوانات

  1. التضحية الفئران بخلع عنق الرحم.
  2. مكان الغدد الغدة الصعترية والطحال في قنينات التﻷلؤ 20 مل أو 15 مل أنابيب مخروطية الشكل مليئة 5 مل Hanks´ متوازن الحل الملح (حبس). مكان بدلنس في أنابيب صغيرة 1.5 مل مليئة 1 مل من 1640 ربمي. استخدام الغدة الصعترية كله والطحال، وجميع بدلنس.
    ملاحظة: ينبغي إبقاء الأجهزة على الجليد طوال فترة الإجراءات، والمحقق أن تحاول أن تكون سريعة أثناء إعداد تعليق خلية مفردة، لا سيما عند التعامل مع أنسجة الغدة الصعترية نظراً للخلايا المناعية الغدة الصعترية يمكن أن يتحلل بسرعة في درجات حرارة عالية.

2-وحيد الخلية في معزل عن الغدة الصعترية والطحال

  1. دقة الضغط على الغدة الصعترية والطحال مع زوج من ملاقط للإفراج عن الخلايا المناعية. تجاهل الكبسولة الغدة الصعترية والطحال المتبقية.
  2. نقل تعليق خلية الأنبوبة المخروطية 15 مل وأجهزة الطرد المركزي في 433 x ز لمدة 5 دقائق عند 4 درجة مئوية لتشكيل بيليه. تجاهل المادة طافية.
  3. خلايا الدم الحمراء، ريسوسبيند تعليق خلية في 5 مل من 0.2 M NH4Cl واحتضان في درجة حرارة الغرفة للحد الأدنى 10 عكس الأنابيب بلطف رأسا على عقب كل دقيقة 2 مل 5 إضافة لحبس في نهاية الحضانة لوقف تحلل.
  4. الطرد المركزي هذه الأنابيب في 433 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. تجاهل المادة طافية.
  5. ريسوسبيند بيليه الخلية في حوالي 5 مل حبس. ملء الأنابيب مع هبس.
  6. الطرد المركزي هذه الأنابيب في 433 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. تجاهل المادة طافية.
  7. ريسوسبيند بيليه الخلية في حوالي 5 مل هبس. ملء الأنابيب مع حبس.
  8. الطرد المركزي هذه الأنابيب في 433 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. تجاهل المادة طافية.
  9. ريسوسبيند بيليه الخلية في 5 مل حبس للغدة الصعترية و 10 مل للطحال.
  10. نقل 1 مل تعليق خلية الغدة الصعترية و 500 ميليلتر من تعليق خلية الطحال إلى 5 مل الجولة أنابيب أسفل مع قبعات مصفاة الخلية. تطبيق تعليق خلية إلى خلية قبعات مصفاة.
    ملاحظة: نايلون 35 ميكرون أدمجت في عملية النداء الموحد. وجمعت ما يقرب من 5 مليون خلايا في كل أنبوبة.

3-وحيد الخلية في معزل عن بدلن

  1. ضع 250 ميكرون معدنية عقيمة على أنبوب مخروطي 15 مل في رف. شطف الشبكة مع 1 مل ربمي.
  2. نقل الليمفاوية إلى شبكة معدنية وطحن لهم من خلال شبكة باستخدام زوج من ملاقط. تطبيق 1 مل ربمي في شبكة معدنية لمسح الخلايا في الأنبوب. كرر 3 مرات أكثر وإزالة الشبكة.
  3. الطرد المركزي هذه الأنابيب في 433 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. تجاهل المادة طافية.
  4. ريسوسبيند بيليه الخلية في حوالي 5 مل ربمي. ملء الأنابيب مع ربمي.
  5. الطرد المركزي هذه الأنابيب في 433 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. تجاهل المادة طافية.
  6. ريسوسبيند بيليه الخلية في حوالي 5 مل ربمي. ملء الأنابيب مع ربمي.
  7. الطرد المركزي هذه الأنابيب في 433 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. تجاهل المادة طافية.
  8. ريسوسبيند بيليه الخلية في 2 مل ربمي. نقل 2 مل تعليق خلية إلى 5 مل الجولة أنابيب أسفل مع قبعات مصفاة الخلية. تطبيق تعليق خلية إلى خلية قبعات مصفاة.

4-التدفق الخلوي

  1. الطرد المركزي من تعليق خلية من الغدة الصعترية وبدلن والطحال في 433 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. تجاهل المادة طافية.
  2. وصمة عار في الخلايا التي تحتوي على الأجسام المضادة السطحية التالية في 100 ميليلتر من التدفق الخلوي تلطيخ المخزن المؤقت (المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية): 0.75 ميكروغرام/100 ميليلتر CD4 مترافق FITC جسم، 0.60 100 ميكروغرام/ميليلتر CD8 APC-H7-مترافق جسم، جسم 0.30 100 ميكروغرام/ميليلتر CD25 مترافق PE، 5 ميليلتر (01:20) آسيا والمحيط الهادئ مترافق جسم Nrp1. احتضان هذه الأنابيب على الجليد لمدة 40 دقيقة.
  3. إضافة 200 ميليلتر من المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية لكل أنبوبة. الطرد المركزي هذه الأنابيب في 433 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. تجاهل المادة طافية. كرر مرة أخرى.
  4. إصلاح وبيرميبيليزي الخلايا التي ريسوسبيندينج بيليه الخلية في 500 ميليلتر من المخزن المؤقت لتثبيت بيرميبيليزيشن (بفب).
    ملاحظة: بفب مستعدة بخلط 1 جزء من التثبيت/بيرميبيليزيشن "التركيز" مع 3 أجزاء من "مادة" التثبيت/بيرميبيليزيشن.
  5. تبقى هذه الأنابيب في الثلاجة عند 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
    ملاحظة: ويعمل أيضا حضانة ح 1.
  6. الطرد المركزي هذه الأنابيب في 433 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. تجاهل المادة طافية.
  7. ريسوسبيند بيليه الخلية في 500 ميليلتر من المخزن المؤقت للغسيل بيرميبيليزيشن (PWB). الطرد المركزي هذه الأنابيب في 433 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. تجاهل المادة طافية.
    ملاحظة: PWB بتمييع Permeabilization إعداد المخزن المؤقت (10 x) إلى 01:10 في الماء المقطر.
  8. وصمة عار في الخلايا التي تحتوي على الأجسام المضادة داخل الخلية التالية في 100 ميليلتر من PWB: 0.30 100 ميكروغرام/ميليلتر Foxp3 PE-Cy7-مترافق جسم، جسم هيليوس مترافق باسيفيكبلوي 4 ميليلتر (01:25). احتضان هذه الأنابيب على الجليد ح 1.
  9. إضافة 500 ميليلتر من PWB لكل أنبوبة. الطرد المركزي هذه الأنابيب في 433 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. تجاهل المادة طافية.
  10. ريسوسبيند بيليه الخلية في 500 ميليلتر من PWB. الطرد المركزي هذه الأنابيب في 433 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. تجاهل المادة طافية.
  11. ريسوسبيند بيليه الخلية في 300 ميليلتر من المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية.
  12. تحليل الخلايا على سيتوميتير تدفق.
  13. بوابة وحيدة الخلايا استناداً إلى الجانب مبعثر-المنطقة، والطول والعرض، ومبعثر ناحية الأمام، الارتفاع والعرض. تشغيل الأحداث 1 مليون للتحليل.
  14. تصدير ملفات FCS للتجارب وتحليلها باستخدام برمجيات محلل تدفق الخلوي.

النتائج

للتحقيق في التعبير عن Nrp1 وهيليوس في خلايا تريج وبتريج، إعداد الخلايا المفردة من الغدد الغدة الصعترية، بدلنس والطحال نورموجليسيميك إيماءة الفئران والملون منها مع علامات خلية تريغ CD4، CD25، Foxp3، هيليوس، و Nrp1 لتدفق سيتوميتريك تحليل. تم تحليل النتائج كما هو موضح في الممثل الن?...

Discussion

في هذه الدراسة، ونحن عزل الخلايا المفردة من الغدد الغدة الصعترية، بدلنس والطحال من الفئران إيماءة، والتحقيق في التعبير عن هيليوس و Nrp1 في خلايا CD4+CD8–CD25+Foxp3+ تريغ الخلايا باستخدام التدفق الخلوي. واستخدمت في هذه الدراسة، الفئران إيماءة، الذي هو نموذج مورين من داء الس?...

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

هذه الدراسة دعم مالي من مجلس البحوث السويدية، اكسودياب، ومؤسسة السكري السويدية والصندوق السكري الطفل السويدي، سيب ديابيتيسفوندين و O.E. أوتش ادلا جوهانسونس فيتينسكابليجا ستيفتيلسي. المؤلف يود أيضا بفضل كل علا كارلسون وساندلر ستيلان ليدعم والمناقشات.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
NOD miceIn-house breading
HBSSStatens veterinärmedicinska anstalt991750
RPMI-1640Sigma-AldrichR0883-500ML
NH4ClEMD Millipore1011450500
eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer SetThermoFisher00-5523-00Contains Fixation/Permeabilization Concentrate , Fixation/Permeabilization Diluent and Permeabilization Buffer (10x)
eBioscience Flow Cytometry Staining BufferThermoFisher00-4222-26
CD4 Monoclonal Antibody (RM4-5), FITC, eBioscienceThermoFisher11-0042-85
CD25 Monoclonal Antibody (PC61.5), PE, eBioscienceThermoFisher12-0251-83
BD Pharmingen APC-H7 Rat anti-Mouse CD8aBD Biosciences560182
Mouse Neuropilin-1 APC-conjugated AntibodyR&D SystemsFAB5994A
FOXP3 Monoclonal Antibody (FJK-16s), PE-Cyanine7, eBioscienceThermoFisher25-5773-82
Pacific Blue anti-mouse/human Helios AntibodyBioLegend137220
Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap CapCORNING352235A 35 µm nylon mesh is incorporated into the dual-position snap cap
Tube 15 mL, 120 mm x17 mm, PPSarstedt62.554.002
Micro tube 1.5 mLSarstedt72.690.001
Disposable scintillation vialsWHEATON
Flow cytometryBD
Flow cytometry analysis softwareInivai TechnologiesFlowlogic

References

  1. Fontenot, J. D., Gavin, M. A., Rudensky, A. Y. Foxp3 programs the development and function of CD4+CD25+ regulatory T cells. Nature Immunology. 4 (4), 330-336 (2003).
  2. Khattri, R., Cox, T., Yasayko, S. A., Ramsdell, F. An essential role for Scurfin in CD4+CD25+ T regulatory cells. Nature Immunology. 4 (4), 337-342 (2003).
  3. Hori, S., Nomura, T., Sakaguchi, S. Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3. Science. 299 (5609), 1057-1061 (2003).
  4. Sakaguchi, S., Sakaguchi, N., Asano, M., Itoh, M., Toda, M. Immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alpha-chains (CD25). Breakdown of a single mechanism of self-tolerance causes various autoimmune diseases. The Journal of Immunology. 155 (3), 1151-1164 (1995).
  5. Vignali, D. A., Collison, L. W., Workman, C. J. How regulatory T cells work. Nature Review Immunology. 8 (7), 523-532 (2008).
  6. Thornton, A. M., et al. Expression of Helios, an Ikaros transcription factor family member, differentiates thymic-derived from peripherally induced Foxp3+ T regulatory cells. The Journal of Immunology. 184 (7), 3433-3441 (2010).
  7. Weiss, J. M., et al. Neuropilin 1 is expressed on thymus-derived natural regulatory T cells, but not mucosa-generated induced Foxp3+ T reg cells. Journal of Experimental Medicine. 209 (10), 1723-1742 (2012).
  8. Yadav, M., et al. Neuropilin-1 distinguishes natural and inducible regulatory T cells among regulatory T cell subsets in vivo. Journal of Experimental Medicine. 209 (10), S1711-S1719 (2012).
  9. Singh, K., Hjort, M., Thorvaldson, L., Sandler, S. Concomitant analysis of Helios and Neuropilin-1 as a marker to detect thymic derived regulatory T cells in naive mice. Scientific Reports. 5, 7767 (2015).
  10. Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. Preparation of single-cell suspensions from mouse spleen with the gentleMACS Dissociator. Journal of Visualized Experiments. (22), (2008).
  11. Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. Standardized preparation of single-cell suspensions from mouse lung tissue using the gentleMACS Dissociator. Journal of Visualized Experiments. (29), (2009).
  12. Singh, K., et al. Interleukin-35 administration counteracts established murine type 1 diabetes--possible involvement of regulatory T cells. Scientific Reports. 5, 12633 (2015).
  13. Digre, A., et al. Overexpression of heparanase enhances T lymphocyte activities and intensifies the inflammatory response in a model of murine rheumatoid arthritis. Scientific Reports. 7, 46229 (2017).
  14. Li, X., et al. Pro-tumoral immune cell alterations in wild type and Shb-deficient mice in response to 4T1 breast carcinomas. Oncotarget. 9 (27), 18720-18733 (2018).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

144 T Foxp3 1

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved