JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

بروتوكولات مفصلة لكلا أسيليشن في المختبر وفي خلايا انتقائية 2-هيدروكسيل تحليلها بواسطة التمهيدي ملحق (الشكل) تجارب لتحديد هيكل تسلسل قبل مرناً لمصلحة حضور جزيء صغير استهداف الجيش الملكي النيبالي الثانوية المعروضة في هذه المقالة.

Abstract

عملية تطوير العقاقير للجزيئات الصغيرة التي تستهدف الجيش الملكي النيبالي، توضيح التغييرات الهيكلية على تفاعلها مع تسلسل الحمض النووي الريبي الهدف هو المطلوب. نحن نقدم هذه الوثيقة التفصيل في المختبر وانتقائية في الخلية 2-هيدروكسيل أسيلاتيون تحليلها من قبل تمديد التمهيدي البروتوكول (الشكل) لدراسة التغير الهيكلي حضور دواء تجريبي لضمور العضلات الشوكي (SMA)، البقاء على قيد الحياة من الجيش الملكي النيبالي الخلايا العصبية الحركية (العليا)-C2, وفي إكسون 7 من قبل-مرناً الجينات SMN2. في الشكل في المختبر، وهو تسلسل الحمض النووي الريبي من 140 النيوكليوتيدات التي تحتوي على SMN2 إكسون 7 نسخها من قبل بوليميريز الحمض النووي الريبي T7 ومطوية بحضور الجالي-C2 وتعديله فيما بعد بكاشف أسيليشن خفيف 2 '--أوه، إيميدازوليدي حمض 2-ميثيلنيكوتينيك (ناي). هذا adduct 2 '--يا ناي هو كذلك سبر طريق 32تمديد التمهيدي المسمى ف وحلها بالتفريد جل polyacrylamide (صفحة). على العكس من ذلك، أسيليشن 2 '-OH في الشكل في الخلية يأخذ مكان في الموقع مع الجالي-C2 ملزمة الخلوية الحمض النووي الريبي في الخلايا الحية. ثم اتسع نطاق تسلسل مرناً قبل إكسون 7 في الجينات SMN2، جنبا إلى جنب مع الطفرات المستحثة بالشكل في تمديد التمهيدي، بكر ويخضع لتسلسل الجيل القادم. المقارنة بين المنهجيتين، الشكل في المختبر هو وسيلة أكثر فعالية من حيث تكلفة ولا تتطلب الطاقة الحسابية لتصور النتائج. ومع ذلك، الطراز المستمدة من شكل الجيش الملكي النيبالي في المختبر أحياناً ينحرف عن هيكل الثانوي في سياق خلوية، يرجح أن سبب فقدان جميع التفاعلات مع الحمض النووي الريبي ملزم البروتينات. الشكل في الخلية لا تحتاج إلى مكان مواد مشعة وغلة بنية الحمض النووي الريبي ثانوي أكثر دقة في سياق الخلوية. وعلاوة على ذلك، الشكل في الخلية المطبقة عادة لتسلسل مجموعة من الجيش الملكي النيبالي أكبر (~ 1,000 النيوكليوتيدات) باستخدام تسلسل الجيل القادم، مقارنة في المختبر الشكل (~ 200 النيوكليوتيدات) التي عادة ما تعتمد على تحليل صفحة. في حالة المستمدة من إكسون 7 في SMN2 قبل-مرناً، الشكل في المختبر وفي خلايا الحمض النووي الريبي النماذج مشابهة لبعضها البعض.

Introduction

أسيليشن انتقائية 2-هيدروكسيل تحليلها بواسطة الملحق التمهيدي (الشكل) أسلوب لقياس الحركية من كل النوكليوتيدات في تسلسل الحمض النووي الريبي للفائدة وتوضيح هيكل الثانوية في قرار واحد-النوكليوتيدات1. المنهجيات الشكل، سواء في الظروف المختبرية2،3،4 (تنقية الحمض النووي الريبي في نظام المخزن مؤقت معرفة) وفي خلايا الثدييات الحية5،6، وقد وضعت للتحقيق الثانوي هيكل تسلسل متوسط طول الحمض النووي الريبي (عادة < النيوكليوتيدات 1,000 للشكل في الخلية و < النيوكليوتيدات 200 للشكل الأنبوبي). أنها مفيدة بشكل خاص لتقييم التغيرات الهيكلية في مستقبلات الحمض النووي الريبي عليها ملزمة للتفاعل الحمض النووي الريبي جزيء صغير والايضات2،4،،من78 ودراسة الإجراءات آليا من جزيئات الحمض النووي الريبي استهداف خلال المخدرات التنمية9،10.

اكتشاف المخدرات تستهدف الجيش الملكي النيبالي مؤخرا لفت الانتباه في المختبرات الأكاديمية و الصناعة الصيدلانية11،12 عبر مختلف النهج والاستراتيجيات13،،من1415 ،16. وتشمل الأمثلة الأخيرة الجزيئات الصغيرة التي تستهدف الجيش الملكي النيبالي للاستخدام السريري العقاقير التجريبية هيكلياً متميزة LMI-07017 و RG-791618،19، لضمور العضلات الشوكي (SMA)، الذي أظهر واعدة النتائج في مرحلة التجارب السريرية الثاني20. كل الجزيئات وقد أثبت لبقاء الهدف من الخلايا العصبية الحركية (الجالي) قبل 2-مرناً وتنظيم عملية الربط SMN2 الجينات6،،من1721. أظهرنا سابقا التطبيق في المختبر والشكل في الخلية في دراسة التغيرات الهيكلية المستهدفة الحمض النووي الريبي حضور تمثيلي للنمو الحقيقي-7916 المعروفة باسم C2 الجالي6.

من حيث المبدأ، التدابير شكل معدل أسيليشن 2 '--يا كل نوكليوتيد تسلسل الحمض النووي الريبي حضور المبالغ الزائدة من كاشف أسيليشن التبريد الذاتي بطريقة غير متحيزة. الكاشف أسيلاتيون ليست مستقرة في الماء، وله فترة قصيرة (مثل، T1/2 = 17 s 1-الميثيل-7-نيترويساتويك الخل؛ أو 1 م 7، ~ 20 دقيقة إيميدازوليدي حمض 2-ميثيلنيكوتينيك، أو ناي)22 وعدم الاكتراث بالهوية قواعد23. هذه النتائج في أسيليشن مواتية أكثر المجموعات 2 '--أوه القواعد المرنة، التي يمكن أن تتحول إلى تقييم دقيق لديناميات كل النوكليوتيدات. على وجه التحديد، النوكليوتيدات في قاعدة زوج عادة أقل رد الفعل من أحد مزاوج إلى كاشف تعديل 2 '--أوه، مثل ناي و 1 م 7.

النظر في مصدر القالب الجيش الملكي النيبالي، والتي يجري فيها أسيليشن 2 '--يا، ويمكن عموما تصنيف الشكل في الشكل في المختبر وفي الخلية. في استخدامات الأنابيب الشكل T7 المنقي نسخها الجيش الملكي النيبالي ويفتقر إلى سياق خلوية في تصاميم تجريبية. في الشكل في الخلية، وتحدث كل من الجيش الملكي النيبالي قالب النسخ وأسيليشن 2 '--يا داخل الخلايا الحية؛ ولذلك، يمكن أن الخص النتائج النموذج الهيكلي الجيش الملكي النيبالي في سياق خلوية. قد أحيلت إلى الشكل في الخلية كما هو الحال في فيفو الشكل للشكل في الخلايا الحية في الأدب24. حيث لم يتم تنفيذ هذه التجربة في حيوان، نحن وصف هذه التجربة على الشكل في الخلية للتأكد من دقتها.

كما تختلف أيضا استراتيجيات لمرحلة التمديد التمهيدي للشكل في المختبر وفي الخلية. في الشكل في المختبر، وتوقف النسخ العكسي في موقف أسيليشن 2 '--يا حضور Mg2 +. ولذلك يظهر ملحق التمهيدي 32فالمسمي كعصابة في جل polyacrylamide التفريد (صفحة) وكثافة الفرقة يكون متناسباً مع معدل أسيليشن1. في الشكل في الخلية، وينشئ النسخ العكسي الطفرات العشوائية في 2 '--أوه adduct موقف حضور Mn2 +. معدل كل النوكليوتيدات حيث يمكن التقاطها بواسطة في عمق الجيل التالي التسلسل، ويمكن ثم حساب مفاعليه الشكل في قرار واحد-النوكليوتيدات.

مشكلة محتملة للشكل في الخلية هو نسبة الإشارة إلى الضوضاء منخفضة (أي أغلبية المجموعات 2 '--يا معدلة، بينما تسلسل غير معدلة تحتل أكثر من القراءة في تسلسل الجيل القادم). في الآونة الأخيرة، طريقة لإثراء 2 '--أوه تعديل الحمض النووي الريبي، المشار إليها كما هو الحال في فيفو انقر فوق الشكل (إيكشابي)، وضعه مختبر تشانغ25. قد يكون هذا الأسلوب الإثراء مفيدة في دراسة الجزيئات الصغيرة ضعيفة مثل التفاعلات الحمض النووي الريبي، خاصة في استجواب على نطاق الترنسكربيتوم.

Protocol

1-في المختبر الشكل

ملاحظة: يتم تعديل البروتوكول من البروتوكول المنشورة1.

  1. إعداد قالب الحمض النووي الريبي
    ملاحظة: وأمرت القالب للنسخ T7 اصطناعية مزدوج-الذين تقطعت بهم السبل الحمض النووي (dsDNA) وتضخيمه بالإدراج أما إلى متجه كولاي التي يحمل زوج فريدة من مواقع endonuclease تقييد اكوري/بامهي، مثل pET28a، أو بواسطة PCR. ويتضح في البروتوكول للتضخيم PCR أدناه.
    1. خلط المواد التالية: 50 ميكروليتر من سيد بكر مزيج (انظر الجدول للمواد)، 2 ميكروليتر لكل التمهيدي في 10 ميكرومترات (انظر الجدول 1 لتسلسل)، 200 نانوغرام قالب دسدنا في ميكروليتر 2 و 3 ميكروليتر من ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس])، وميكروليتر 41 ح2قاسمة سين إلى بكر اثنين أنابيب (كل أنبوبة تحتوي على 50 ميكروليتر من خليط رد الفعل).
    2. إعداد cycler الحرارية كما يلي: المرحلة 1) 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية؛ المرحلة 2) 95 ° ج ل 20 ق؛ المرحلة 3) 56 درجة مئوية 20 s; المرحلة 4) 72 درجة مئوية 20 s; حلقة المرحلة 5) العودة إلى المرحلة 2 لدورات 30؛ المرحلة 6) 72 درجة مئوية لمدة 3 دقائق؛ والمرحلة 7) لا حصر لها عقد في 4 درجات مئوية حتى الخطوة التالية.
    3. تنقية أمبليكون بكر باستخراج الشرائح هلام (انظر الجدول للمواد واستخدام البروتوكول الخاص بالشركة المصنعة). الوت المنتج الحمض النووي مع 35 ميكروليتر من المخزن المؤقت تريس يدتا (TE)، التي تحتوي على 10 ملم تريس (pH 8.0) و 1 مم يدتا، تؤتي من 0.1 – 0.5 ميكروغرام/ميكروليتر القالب. تطبيع القالب الحمض النووي المنقي إلى 0.10 ميكروغرام/ميكروليتر.
      ملاحظة: بشكل اختياري، قد حلل نوعية القالب على 1.8% [اغروس] هلام التفريد مع 0.10 ميكروغرام من الحمض النووي. ومن المتوقع عصابة واحدة من الحمض النووي القالب المطلوب في الهلام.
    4. إعداد النسخ T7 رد فعل (الحجم الإجمالي 40 ميكروليتر) بإضافة المواد التالية في أنبوب PCR: ميكروليتر 4 من 10 س رد فعل المخزن المؤقت، 4 ميكروليتر من ATP، 4 ميكروليتر من الأداء النظري المركب، 4 ميكروليتر من غتب، ميكروليتر 4 من UTP، ميكروليتر 4 إنزيم T7 (انظر الجدول للمواد) ، 4 ميكروليتر من amplicon بكر المنقي من الخطوة 1.1.3 (0.4 ميكروغرام)، و 12 ميكروليتر من ثنائي إثيل بيروكاربوناتي (ديبك)-المياه المعالجة. مزيج من بيبيتينج صعودا وهبوطاً 4 x. احتضان في 37 درجة مئوية ح 4 – 16 في cycler حرارية أو حاضنة 37 درجة مئوية.
      ملاحظة: ابدأ في إعداد الخطوة 1.1.6 بينما رد الفعل في خطوة 1.1.4 الجارية.
    5. إضافة 2 ميكروليتر من الدناز، ومزيج من بيبيتينج صعودا وهبوطاً 4 x، واحتضان في 37 درجة مئوية ل 15 دقيقة المزيج بتساوي حجم 2 × تريس-بورات-يدتا (TBE)-اليوريا عينة المخزن المؤقت (انظر الجدول للمواد). الحرارة عند 70 درجة مئوية لمدة 3 دقائق لإلغاء تنشيط.
    6. يختلط زجاجة خالية رناسي، 75 مل محلول الاكريلاميد/بيساكريلاميدي 40% (فيها، انظر الجدول للمواد)، 180.2 ز يوريا، و 50 مل من 10 x TBE العازلة (رناسي خالية، انظر الجدول للمواد). وضع الزجاجة على شاكر مداري (250 لفة في الدقيقة) حتى يتم حل جميع بلورات اليوريا (قد يستغرق مدة تصل إلى 2 حاء). ضبط حجم الصوت إلى 500 مل مع المياه المعالجة ديبك. تصفية الحل مع غشاء 0.2 ميكرومتر (انظر الجدول للمواد).
      ملاحظة: في هذه العملية، وتجنب استخدام براق وآثاره-بار للحيلولة دون تلوث رناسي. ويمكن تخزين الحل عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى سنة واحدة.
    7. تنظيف ألواح الزجاج التفريد اثنين بحجم مناسب (16.5 سم x 24 سم) مع المياه و 70% EtOH استخدام قطعة من مسح ورقة. محاذاة اللوحات مع زوج من الفواصل 2.0 مم (اللوحة مع سطح siliconized تواجه إلى الداخل) وختم على حافة اللوحات مع الشريط. زاوية اللوحة لمنع تسرب الشريط مزدوجة.
    8. في كوب، مزيج 200 مل من محلول اكريلاميد من الخطوة 1.1.6 و 2.0 مل من محلول فوق كبريتات الأمونيوم 10% 100 ميكروليتر من تيتراميثيليثيلينيدياميني (تيميد) مع تلميح ماصة رناسي خالية بالتحريك السريع للميل س. 30 لوحات على قطعة من غطاء benchtop وصب الحل من فجوة اللوحات. اضغط على اللوحة رفع أي فقاعات وإرساء اللوحة مسطحة على الغطاء benchtop. فورا إدراج المشط والسماح للهلام بلمرة ح 1 على الأقل.
      ملاحظة: إذا كان الجل لاستخدامها في اليوم التالي، تغطي الجزء العلوي من الجل مع قطعة من منشفة ورقية رطبة والتفاف مع أكبر قطعة من البلاستيك. ضع الكذب شقة في 4 درجات مئوية.
    9. قم بإزالة الشريط والمشبك اللوحة في موقف التفريد. إزالة المشط وإضافة كافية من المخزن المؤقت x TBE 1 في أعلى وأسفل الخزان. قبل تشغيل للهلام لمدة 30 دقيقة في 20 دبليو
      ملاحظة: اختيارياً، إذا كان المحتوى من الجيش الملكي النيبالي المطلوب ~ 90 في المائة أو أكثر، يمكن استخدام هلام المصغر في الاستعاضة عن جل محضرة.
    10. يغسل كل من الآبار التحميل من بيبيتينج صعودا وهبوطاً مرتين مع السائل في الخزان. إضافة الحمض النووي الريبي الخام من الخطوة 1.1.5 إلى الآبار. تشغيل الهلام في 20 ث حتى الصبغ زايلين FF زيلين نفط (أزرق فاتح) يمر حوالي ثلثي طول للهلام (~ 60 دقيقة).
      ملاحظة: التأكد من تحميل أي أكثر من ثلث ارتفاع البئر (استخدام الآبار متعددة إذا لزم الأمر).
    11. تزج الهلام في المخزن المؤقت x TBE 1 مع المضيفين تمييع الآمنة صبغ (انظر الجدول للمواد) في حاوية كبيرة بما يكفي للجل. وضع الحاوية على شاكر مدارية لمدة 5 دقائق في 80 لفة في الدقيقة.
    12. تحت الأشعة فوق البنفسجية، تحديد الفرقة الجيش الملكي النيبالي المطلوب وخفض سرعة عصابة رقيقة من الجل باستخدام شفرة حلاقة نظيفة. وضع شرائح جل 1 – 2 في أنبوب 1.7 مل.
    13. استرداد الجيش الملكي النيبالي من شريحة هلام شطف السلبي. إضافة المزيج الملائم شطف/هطول الأمطار (مل ~0.3 كل شريحة) لكل أنبوبة: 0.3 متر نواك (pH 5.2)، 2.5 م ليكل، يدتا 1 مم، 0.1% دوديسيل كبريتات الصوديوم (الحزب الديمقراطي الصربي) في المياه المعالجة ديبك. قم بتدوير الأنبوب الذي يحتوي على splice(s) هلام في 4 درجات مئوية عن ح 16.
      ملاحظة: هو معدل استرداد نموذجية ~ 75% في هذه الخطوة. لزيادة الغلة، وجمع في الوينت إزالة وإضافة نفس حجم المخزن المؤقت شطف، ثم كرر هذه الخطوة.
    14. الجمع بين الوينت في أنبوب 1.7 مل جديدة. إضافة 2.5 × EtOH المثلج وعكس الأنابيب ست مرات لخلط السائل، ووضع الأنابيب في-80 درجة مئوية على الأقل 1 ح.
    15. أجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة 10 آلاف س ز و 4 درجة مئوية. بعناية إزالة المادة طافية بيبيتينج. أغسل بيليه الجيش الملكي النيبالي بإضافة 80% EtOH (1 مل كل أنبوب)، دوامة 15 ثانية، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة 10 آلاف س ز و 4 درجة مئوية.
    16. إزالة المادة طافية وأيردري بيليه الحمض النووي الريبي للحد الأدنى 5 إضافة 50 ميكروليتر من المياه خالية من رناسي ومزيج من بيبيتينج صعودا وهبوطاً 10 مرات. تطبيع تركيز الحمض النووي الريبي إلى 0.10 ميكروغرام/ميكروليتر. مخزن تنقية الجيش الملكي النيبالي في-80 درجة مئوية.
      ملاحظة: عدم الإفراط الجاف بيليه الجيش الملكي النيبالي.
    17. بشكل اختياري، لتحليل النوعية من الجيش الملكي النيبالي، تمييع 1 ميكروليتر (100 نانوغرام) من الحمض النووي الريبي من الخطوة 1.1.16 في 5 ميكروليتر من الماء وتخلط مع 5 ميكروليتر من اليوريا TBE x 2 عينة المخزن المؤقت. ثم، من الحرارة عند 70 درجة مئوية 3 دقيقة والتحميل على 6% يوريا TBE هلام المصغر.
      1. تشغيل الهلام 180 الخامس حاء 1 إجراء في تلطيخ كما فعلت في الخطوة 1.1.11. تصور الهلام مع الأشعة فوق البنفسجية في نظام تصوير. ومن المتوقع عصابة واحدة في الطول المطلوب.
  2. إعداد ال 32التمهيدي المسمى ف
    1. قم بإعداد رد فعل بخلط المواد التالية: 10 ميكروليتر من γ-32ف-ATP (وزارة التجارة والصناعة ~1.5، ~ 25 ميكرومتر، انظر الجدول للمواد)، 2 ميكروليتر من النسخ العكسي (RT) التمهيدي (100 ميكرومتر، لتسلسل، انظر الجدول 1)، 2 ميكروليتر من 10 x T4 بولينوكليوتيدي كيناز (بنك) رد فعل المخزن المؤقت، 1 ميكروليتر من بنك T4 (انظر الجدول للمواد)، و 5 ميكروليتر من المياه خالية من رناسي. احتضان في 37 درجة مئوية ح 1.
      تنبيه: الحماية المناسبة هو الحاجة إلى اتخاذ خطوات 1.2-1.5 في أماكن العمل المأذون به للمواد المشعة.
    2. إلغاء تنشيط الحرارة لمدة 20 دقيقة عند 65 درجة مئوية. إضافة العينات على عمود الملحي، وأجهزة الطرد المركزي في غ س 1,000 لمزيج 1 كحد أدنى في الوينت مع 25 ميكروليتر من 2 x اليوريا TBE العازلة عينة. .
      ملاحظة: تخزين النفط الخام المنتج المسمى في-20 درجة مئوية إذا كان ليس أن تكون تنقية فورا.
    3. تشغيل هلام اكريلاميد 10% في 20 ث عن ح 1.
      تنبيه: تحميل ال 32التمهيدي المسمى ف من الخطوة 1.2.1 على الجل وتجنب نزيف النشاط الإشعاعي في الخزان العلوي. لا تقم بتحميل أكثر من ثلث ارتفاع البئر لضمان عصابة رقيقة على الهلام (استخدام الآبار متعددة إذا لزم الأمر). يمكن أن يكون السائل في الخزان السفلي عالية الإشعاع.
    4. إزالة ألواح الزجاج للكاسيت جل ووضع الجل على قطعة من البلاستيك. طي الأغطية البلاستيكية لتغطية الجزء العلوي من جل جعل ساندويتش الغلق. ضع ساندويتش جل على شاشة فوسفور تنغستات كالسيوم وفضح مع أداة تصوير. صورة الجل مرة أخرى مع الضوء العادية لمعرفة أين حواف الهلام.
    5. استخدم برامج معالجة صور لتراكب الصورتين. قم بمحاذاة الجل إلى الصورة المطبوعة. استخدام شفرة حلاقة جديدة لقص الأشرطة المطلوب من الجل. وضع شرائح جل 1 إلى 2 في أنبوب 1.7 مل.
      ملاحظة: تأكد من أن الصورة المطبوعة بنفس حجم هلام الفعلية. مضاعفة التحقق من المحاذاة بالتصوير الجل بقايا مرة أخرى بعد الاستغناء عن الشريحة جل.
    6. استرداد التمهيدي 32ف المسمى باتباع الخطوات 1-1-13 إلى 1.1.16. تأخذ ميكروليتر 1.0 للحل في أنبوب 0.4 مل وتمييع التمهيدي مع المخزن المؤقت للشركة المصرية للاتصالات 1 x للحصول على النشاط الإشعاعي ميكروليتر 1.0 في ظهور ~ 100,000. تخزين المنقي 32التمهيدي المسمى ف في-80 درجة مئوية وحتى الجيش الملكي النيبالي 2 '--أوه تعديل رد فعل ولكن لمدة لا تزيد على 4 أسابيع.
  3. ربط جزيء صغير والتعديل 2 '--يا رنا
    1. لإعداد العينات الأربع، إضافة 8 pmol الجيش الملكي النيبالي في ميكروليتر 32 x 0.5 TE المخزن المؤقت إلى أنبوب 1.7 مل، الحرارة عند 80 درجة مئوية 2 دقيقة، وبارد الأداة الإضافية على الجليد لمدة 1 دقيقة على الأقل.
      ملاحظة: تستخدم المعادلة التالية لحساب تقريبي الوزن الجزيئي للحمض النووي الريبي: MW = (# القواعد) x 340 دا.
    2. إضافة 8 ميكروليتر من 5 × طي مزيج يحتوي على 500 مم حبيس (pH 8.0)، 20 مجكل2، و 500 ملم كلوريد الصوديوم. الكوة ميكروليتر 9 من خليط الحمض النووي الريبي في كل من بكر أربعة أنابيب وتسميتها #1--#4. أضف 1 ميكروليتر من 10% [دمس] في الأنبوب #1، 1 ميكروليتر من جزيء صغير يتركز الحل (10% [دمس]) في #2، 1 ميكروليتر من حل جزيء صغير المخفف (10% [دمس]) إلى #3، وميكروليتر 1 من المياه إلى #4.
    3. احتضان أنابيب PCR عند 37 درجة مئوية في cycler حرارية لمدة 30 دقيقة.
    4. الحق قبل رد فعل التعديل 2 '--أوه، تمييع 1 ميكروليتر من حل الأسهم ناي (2 م) مع 3 ميكروليتر من المياه المعالجة ديبك أن تسفر عن حل عامل 0.5 متر. دون تأخير، إضافة ميكروليتر 1 ناي يعمل الحل في أنابيب #1 و #2 و #3، و 1 ميكروليتر من 25% [دمس] في #4. احتضان عند 37 درجة مئوية في cycler حرارية لمدة 15 دقيقة.
    5. إضافة 100 ميكروليتر من شطف/هطول الأمطار مزيج (راجع الخطوة 1-1-13 للوصفة)، 2 ميكروليتر من الجليكوجين (15 ملغ/مل)، ونقل جميع السائل في كل أنبوبة PCR في أنبوب 1.7 مل. إضافة مل 0.34 من المثلج واقية من 200 EtOH (المجلد 3 x) في كل أنبوب. مزيج من فورتيكسينج 5 ق ومكان هذه الأنابيب في ثلاجة-80 درجة مئوية على الأقل ح 1.
      ملاحظة: وخلال هذه الفترة، البدء في إقامة جل التسلسل لاستخدامها في الخطوة 1.5.1.
    6. أجهزة الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة في 14,000 س ز و 4 درجة مئوية. إزالة المادة طافية دون إزعاج بيليه الجيش الملكي النيبالي. أغسل بيليه الجيش الملكي النيبالي بإضافة 80% EtOH (0.5 مل في الأنبوب)، دوامة 15 ثانية، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة 000 20 شخص × ز و 4 درجة مئوية. إزالة المادة طافية مرة أخرى.
      ملاحظة: يمكنك بشكل اختياري استخدام عداد غايغر لضمان بيليه المشعة الاحتفاظ في الأنبوب.
    7. أيردري بيليه الحمض النووي الريبي ميكروليتر 9 إضافة 5 كحد أدنى من المياه خالية من رناسي ومزيج من بيبيتينج صعودا وهبوطاً 10 مرات.
      ملاحظة: عدم الإفراط الجاف بيليه الجيش الملكي النيبالي. ومن المتوقع هطول الأمطار جميع تحل في نهاية هذه الخطوة.
  4. علامة التمديد إعداد والتمهيدي
    1. نقل الجيش الملكي النيبالي معدلة إلى 4 أنابيب PCR جديدة وتسميتها #1--#4 كالسابق. إضافة 2 pmol تحكم الجيش الملكي النيبالي في ميكروليتر 7 من المياه المعالجة ديبك إلى 4 أنابيب PCR إضافية وتسميتها #5-#8. إضافة 2 ميكروليتر من التمهيدي راديولابيليد (الخطوة 1.2.6) في جميع الأنابيب ثمانية. الحرارة يصلب عند 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، ثم تبرد مباشرة وصولاً إلى 4 درجات مئوية في cycler الحرارية.
    2. إضافة ميكروليتر 4 من 5 × RT المخزن المؤقت (انظر الجدول للمواد)، 1 ميكروليتر من ديثيوثريتول (DTT، 0.1 M)، و 1 ميكروليتر من مزيج دنتب (10 ملم في كل) لكل واحد من ثمانية أنابيب PCR.
    3. إضافة 2 ميكروليتر من تعامل ديبك ح2س إلى أنابيب #1--#4. إضافة 4 ميكروليتر من داتب (5 مم) وميكروليتر 4 من دتتب (5 ملم) 4 ميكروليتر من دكتب (5 مم) في أنابيب #5-#7، على التوالي. إضافة 1 ميكروليتر من دجتب (5 مم) وميكروليتر 3 من المياه المعالجة ديبك إلى أنبوب #8. ماصة أربع مرات لخلط.
    4. الحرارة في 52 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة في cycler الحرارية. أضف 1 ميكروليتر من المنتسخة العكسية (انظر الجدول للمواد)، ثم مزيج من بيبيتينج صعودا وهبوطاً أربع مرات. تبني رد فعل على 52 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
    5. إضافة 1 ميكروليتر من 5 م هيدروكسيد الصوديوم في كل من هذه الأنابيب يتحلل الجيش الملكي النيبالي. حرارة الأنابيب عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
    6. إضافة 5 ميكروليتر من 1 M HCl وتكرار هطول الأمطار الإيثانول (الخطوات 1.3.5 و 1.3.6)، باستثناء حذف الجليكوجين ونقل السوائل.
      ملاحظة: إهمال نتائج الخطوة 1.4.6 في منطقة التشويه الناتج عن عنصر في منتصف هلام المعروفة باسم "الجبهة ملح".
    7. أيردري بيليه الحمض النووي للحد الأدنى 5 إضافة 10 ميكروليتر من ح2س و 10 ميكروليتر من 2 x عينة من اليوريا TBE تحميل المخزن المؤقت وماصة صعودا وهبوطاً 10 مرات ريديسولفي. الحرارة عند 70 درجة مئوية للحد الأدنى 5 وضع الأنابيب على الجليد قبل تحميلها على الهلام.
  5. تحليل صفحة
    1. لإعداد جل تسلسل polyacrylamide 8%، اتبع الخطوات 1.1.6 ل 1.1.10 مع إدخال التعديلات التالية: استخدام 100 مل محلول الاكريلاميد/بيساكريلاميدي 40% (فيها) لتحضير حلاً اكريلاميد 8%، واستخدام التسلسل هلام (مثلاً، 46 ألواح الزجاج × 57 سم) مع فاصل 0.4 مم.
    2. تحميل 10 ميكروليتر من العينة من الخطوة 1.4.7. تشغيل الهلام على 65 ث لح 2 أو حتى صبغ أسفل يصل إلى 3/4 الجل.
      ملاحظة: تخزين بقية العينات في-80 درجة مئوية لتكرار إذا لزم الأمر.
    3. إزالة لوحة زجاج سيليكونيزيد العلوي بإزالة فاصل وإدراج بلطف ملعقة. ضع قطعة من الورق تصفية كبيرة لتغطية الهلام، واضغط برفق للسماح هلام التمسك بالورقة عامل التصفية. ابتداء من نهاية الجزء السفلي، رفع الورقة عامل التصفية وإزالة الجل من لوحة زجاج معا.
    4. ضع الجل جنبا إلى جنب مع أوراق الترشيح على قطعة من البلاستيك التي كبيرة بما يكفي لتغطية جل كله (ورق الترشيح مواجهة). نقل ساندويتش التفاف أوراق الترشيح/جل/البلاستيك إلى هلام أكثر جفافاً مع الجانب ورق الترشيح إلى الأسفل.
      تنبيه: لتجنب التلوث بالمواد المشعة، استخدام 3 إلى 4 أكثر من قطعة من ورق تصفية كبيرة بين ساندويتش جل وهلام أكثر جفافاً.
    5. الجاف للجل عند 70 درجة مئوية ح 1 مع وجود فراغ. نقل ساندويتش جل على كاسيت شاشة تخزين فوسفور أبيض صور. الكشف عن النشاط إشعاعي الجل للشاشة من أجل ح 4 – 16.
    6. مكان تخزين الفوسفور الشاشة على جهاز التصوير والمسح الضوئي مع القرار المتوسطة (~ 30 دقيقة).
      ملاحظة: إذا قطعة أثرية شبيهة بابتسامة غير موجود في صورة هلام، استخدام برامج تصحيح (مثلاً، الصفا) لمعالجة الصورة إلى نوعية النشر. ضع في اعتبارك أن لين علامة قياسية 1 نوكليوتيد أطول من الممرات التعديل 2 '--يا.

2-الشكل في الخلية

  1. التصميم التمهيدي
    ملاحظة: على عكس الشكل الأنبوبي، والشكل في الخلية لا تحتاج إلى تصميم كاسيت تعبير. ومع ذلك، ينبغي أن تستخدم مجموعة التمهيدي أمثل ويجب تقييمها قبل الشكل التجربة.
    1. إنشاء مالا يقل عن ثلاثة أزواج التمهيدي فريدة من نوعها بأداة تصميم التمهيدي المستندة إلى الانفجار (مثلاً، انفجار التمهيدي). لدراسة ما قبل-مرناً في الخلايا البشرية، حدد الجينوم البشري (لا الترنسكربيتوم) كقاعدة بيانات مرجعية في "التمهيدي زوج خصوصية التحقق من المعلمات". اختيار حجم أمبليكون في المجموعة من 200 – 1,000 زوج قاعدي (bp).
    2. استخراج الحمض النووي الجينومي من ~ 106 خلايا للاهتمام بأسلوب يستند إلى عمود دوران مع معاملة رناسي A وحوزتي ك (انظر الجدول للمواد واستخدام البروتوكول الخاص بالشركة المصنعة). تطبيع تنقية الحمض النووي في 0.1 ميكروغرام/ميكروليتر TE العازلة.
    3. إجراء اختبار PCR مع البروتوكول في الخطوات 1.1.1 و 1.1.2.
      ملاحظة: مجموعة التمهيدي المرجوة ينبغي أن تسفر عن عصابة واحدة على 1.8% [اغروس] هلام.
  2. خلية إعداد وتعديل 2 '--أوه
    ملاحظة: زيادة الوفرة من قبل-مرناً للفائدة، هو ترانسفيكتيد مينيجيني مع التسلسل الصحيح تحت المروج الفيروس المضخم للخلايا (CMV) للتعبير التأسيسي في الخلايا المضيفة.
    1. قبل الحارة المتوسطة الثقافة التي تحتوي على 10% مصل بقرى الجنين (FBS) والمضادات الحيوية 1 x المخلوط في تعديل النسر المتوسطة (دميم دولبيكو) عند 37 درجة مئوية. خلايا 293T البذور في 50% كونفلوينسي 24 ساعة قبل تعداء في الثقافة المتوسطة. تغيير في المتوسط إلى 2% FBS في دميم دون ح ~ 1 قبل تعداء المضادات الحيوية.
    2. إضافة 10 ميكروغرام من بلازميد مينيجيني إلى 100 ميكروليتر المصل انخفاض وسائط الإعلام (انظر الجدول للمواد) في 1 جيدا من صفيحة 96-جيدا. "الماصة؛" الحل صعودا وهبوطاً أربع مرات لخلط.
    3. إضافة 40 ميكروليتر من تعداء كاشف (انظر الجدول للمواد) إلى 100 ميكروليتر من المصل انخفاض وسائل الإعلام بشكل جيد آخر اللوحة. "الماصة؛" أعلى وأسفل أربع مرات لخلط. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
    4. إضافة حل بلازميد كامل إلى تعليق الكاشف تعداء. "الماصة؛" أعلى وأسفل أربع مرات لخلط. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
    5. إضافة الحمض النووي الكامل/خليط كاشف تعداء dropwise على سطح المتوسطة في جميع أنحاء الطبق. احتضان في 37 درجة مئوية ح 6 – 12.
    6. نضح المتوسطة وتغسل بلطف مرة واحدة مع 5 مل من المحلول الملحي مخزنة الفوسفات (برنامج تلفزيوني، درجة الحموضة 7.4، دون كاكل2 ومجكل2، انظر الجدول للمواد). تريبسينيزي الخلايا مع 3 مل من محلول التربسين. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
    7. ضرب الطبق برفق فصل الخلايا من الجزء السفلي من الطبق. تحييد التربسين مع 6 مل من الثقافة المتوسطة. الطرد المركزي في 300 x ز لمدة 4 دقائق وإزالة المتوسطة.
    8. ريسوسبيند الخلايا6 ~ 10 لكل عينة في ميكروليتر 199 من رد فعل المتوسطة (1% FBS في دميم) ونقل تعليق خلية في لوحة 96-جيدا. احتضان الخلايا مع 1 ميكروليتر من حل العامل مركب أو ميكروليتر 1 من [دمس] في كافة عناصر التحكم الثلاثة لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
      ملاحظة: ثلاث عينات المراقبة ينبغي أن تشمل: [دمس] التحكم بناي، والجيش الملكي النيبالي التشويه والتحريف مع ناي، وناي السلبية السيطرة.
    9. إضافة 10 ميكروليتر 2 م ناي لكل عينة، باستثناء يشوه التحكم (DC) الجيش الملكي النيبالي وناي السلبية. "الماصة؛" أعلى وأسفل أربع مرات لخلط. احتضان في 37 درجة مئوية لاهتزاز 15 دقيقة بلطف اللوحات تعليق إعادة الخلايا كل 5 دقائق.
    10. نقل الخلايا في أنابيب 1.7 مل وأجهزة الطرد المركزي في 400 x ز لمدة 2 دقيقة دون تأخير. إزالة المادة طافية دون إزعاج بيليه الخلية.
    11. إضافة مل 0.4 من ثيوسيانات جوانيدينيوم (انظر الجدول للمواد). دوامة لمدة 15 ثانية مجانسة. احتضان هذه العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
      ملاحظة: ويمكن تخزين العينات في-20 درجة مئوية حتى الانتقال إلى الخطوة التالية.
  3. استخراج الحمض النووي الريبي
    1. إضافة 0.2 مل كلوروفورم إلى كل من العينات ثيوسيانات تجانس جوانيدينيوم. دوامة إينكوباتي س. 15 في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 دقيقة.
    2. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 12,000 س ز و 4 درجة مئوية. الطبقة العليا مائي عديم اللون يحتوي على الحمض النووي الريبي. نقل ~ 380 ميكروليتر من محلول مائي في أنبوب 1.7 مل جديدة.
      تنبيه: عدم الإزعاج في الطور البيني لتجنب التلوث.
    3. إضافة 1.5 x حجم EtOH (ميكروليتر ~ 570). دوامة لمدة 15 ثانية لمزيج.
    4. نقل 600 ميكروليتر من خليط الحمض النووي الريبي في الجيش الملكي النيبالي عزلة تدور-عمود (انظر الجدول للمواد). الطرد المركزي في 12,000 س ز لتجاهل س. 15 في الوينت. كرر هذه الخطوة تمر عبر جميع السائل في نفس عمود الدوران.
    5. أغسل العمود مع 0.35 مل من RW1 المخزن المؤقت (انظر الجدول للمواد) من الغزل ل 15 ميكروليتر إضافة 80 س. من الحر رناسي الدناز أنا في المخزن المؤقت هي (انظر الجدول للمواد). احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.
      ملاحظة: من الضروري إزالة جميع الحمض النووي التلوث.
    6. تغسل فيما بعد العمود مع 0.35 مل من المخزن المؤقت RW1 و 0.6 مل من المخزن المؤقت x RPE 2 (انظر الجدول للمواد) بالغزل لمدة 15 ثانية في كل خطوة. الجاف للعمود قبل سينتريفوجينج عمود الدوران مع أنبوب مجموعة فارغة في س 12,000 ز لمدة 1 دقيقة.
    7. إضافة ميكروليتر 32 من المياه خالية من رناسي إلى مركز العمود. احتضانها للحد الأدنى 1 أجهزة الطرد المركزي في س 12,000 ز لمدة 30 ثانية للحصول على ميكروليتر ~ 30 لتنقية الحمض النووي الريبي الحل. وضع العينات في-20 درجة مئوية أثناء معالجة العينة التشويه والتحريف.
  4. التشويه والتحريف إعداد التحكم في الجيش الملكي النيبالي
    1. مكان 30 ميليلتر الحمض النووي الريبي عينة ل DC في أنبوب بلاستيكي 1.7 مل على الجليد. إضافة 50 ميكروليتر من ميثلامين و 15 ميكروليتر من المخزن المؤقت DC التي تحتوي على 300 ملم حبيس (pH 8.0) و 25 مم أدتا إلى الأنبوب.
    2. الحرارة تجريدها من الجيش الملكي النيبالي في 95 درجة مئوية للحد الأدنى 1 بسرعة إضافة 5 ميكروليتر ناي حل الأسهم (م 2)، ثم نقر مرتين لخلط ووضع الأنبوب مرة أخرى إلى كتلة التدفئة. احتضان عند 95 درجة مئوية 1 دقيقة إضافية ثم فورا وضع الأنبوب على الجليد.
    3. إضافة مل 0.4 من ثيوسيانات جوانيدينيوم. كرر الخطوات 2.3.1–2.3.4.
    4. أغسل العمود مع 0.6 مل من المخزن المؤقت x RPE 2 (انظر الجدول للمواد) بالغزل لمدة 15 ثانية في كل خطوة. الجاف للعمود قبل سينتريفوجينج عمود الدوران مع أنبوب مجموعة فارغة في س 12,000 ز لمدة 1 دقيقة.
    5. إضافة ميكروليتر 32 من المياه خالية من رناسي إلى مركز العمود. احتضانها للحد الأدنى 1 أجهزة الطرد المركزي في س 12,000 ز لمدة 30 ثانية للحصول على ميكروليتر ~ 30 المستردة إلى حل "الجيش الملكي النيبالي في العاصمة".
  5. تمديد التمهيدي
    1. تطبيع حل الجيش الملكي النيبالي من 2.3.7 و 2.4.5 إلى 0.5 ميكروغرام/ميكروليتر مع المياه خالية من رناسي. إعداد 30 ملم الحل2 الحركة من الحركة2∙4H2O مسحوق طازجة.
    2. نقل 9 ميكروليتر من حل الجيش الملكي النيبالي لكل عينة قطاع بكر. إضافة 1 ميكروليتر من دنتب 10 ملم وميكروليتر 1 من 2 ميكرومتر الخاصة بالجينات التمهيدي (نظام اﻷفضليات المعمم) في كل أنبوبة. "الماصة؛" أعلى وأسفل أربع مرات لخلط. احتضان عند 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق في cycler حرارية ووضع على الجليد > 1 دقيقة.
      ملاحظة: وبدلاً من ذلك، يمكن استخدام 1 ميكروليتر من نونامير عشوائية في الاستعاضة عن نظام اﻷفضليات المعمم.
    3. في كل أنبوبة PCR، إضافة خليط من 2 ميكروليتر من 10 × RT المخزن المؤقت (انظر الجدول للمواد)، 4 ميكروليتر من الحركة 30 مم2، و 2 ميكروليتر من 100 مم DTT. "الماصة؛" صعودا وهبوطاً x 4 للمزيج. احتضان في 42 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة.
    4. أضف 1 ميكروليتر من المنتسخة العكسية (انظر الجدول للمواد). "الماصة؛" صعودا وهبوطاً x 4 للمزيج. احتضان في 42 درجة مئوية في cycler حرارية ح 3.
  6. إعداد مكتبة وتسلسل الجيل المقبل
    1. إعداد رد فعل PCR بإضافة 1 ميكروليتر من بوليميريز الحمض النووي، 5 ميكروليتر من 10 × بوليميراز الدنا المخزن المؤقت (انظر الجدول للمواد)، 2 ميكروليتر من [دمس]، ميكروليتر 1.5 لكل من الإشعال (10 ميكرومترات)، ميكروليتر 34 س ح2، و 5 ميكروليتر من كدنا من الخطوة 2.5.4.
    2. إعداد cycler الحرارية كما يلي: المرحلة 1) 95 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة؛ المرحلة 2) 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية؛ المرحلة 3) 60 درجة مئوية لمدة 30 ثانية؛ المرحلة 4) 68 درجة مئوية لمدة 30 ثانية؛ حلقة المرحلة 5) العودة إلى المرحلة 2 لدورات 30؛ المرحلة 6) 68 درجة مئوية لمدة 3 دقائق؛ والمرحلة 7) لا حصر لها عقد في 4 درجات مئوية حتى الخطوة التالية.
    3. نق أمبليكون باستخدام 1.8% [اغروس] هلام.
      ملاحظة: يجب أن تظهر الفرقة بكر عصابة واحدة في الهلام.
    4. بناء المكتبة باستخدام تجزئة القياسية وأساليب ربط المنشأة في6،الأدب26.
    5. تسلسل على معدات الجيل التالي تسلسل استخدام 1 × 75 واحد في نهاية ما يلي لإنشاء حوالي 10 مليون يقرأ كل عينة.
    6. تحليل النتائج باستخدام شابيمابير وبرامج سوبيرفولد مجموعة حزم وضعتها في الأسابيع26.

النتائج

أظهرنا سابقا أن الجيش الملكي النيبالي الربط المغير، الجالي-C2، يتفاعل مع فكرة أجاج على إكسون 7 من قبل-مرناً مورث SMN2، ويستخدم الشكل لتقييم التغيرات الهيكلية الحمض النووي الريبي حضور C2 الجالي6. موقع الربط الجالي-C2 يختلف عن وافقت عليها إدارة الأغذية والعقاقير ال...

Discussion

في الشكل في المختبر، من الضروري استخدام قالب الحمض النووي الريبي متجانسة ذات جودة عالية. ومع ذلك، غلة T7 النسخ، غالباً ما تسلسل غير متجانسة36. وبخاصة، تسلسل مع النوكليوتيدات ± 1 في 3 '-المحطة مع عائدات لا يستهان بها36 عادة من الصعب إزالتها بتنقية جل polyacrylamide. قالب الحمض...

Disclosures

الكتاب يعلن لا تضارب في المصالح.

Acknowledgements

تسنى هذا العمل بالمنحة R01 المعاهد الوطنية للصحة (NS094721، K.A.J.).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
DNA oligonucleotideIDTgBlock for >200 bp DNA synthesis
Phusion Green Hot Start II High-Fidelity PCR Master MixThermo FisherF566S
NucleoSpin gel and PCR clean-up kitTakara740609.50
MegaScript T7 transcription kitThermo FisherAM1333Contains 10x reaction buffer, T7 enzyme, NTP and Turbo DNase
DEPC-treated waterThermo Fisher750023
2x TBE-urea sample bufferThermo FisherLC6876
40% acrylamide/ bisacrylamide solution (29:1)Bio-Rad1610146
10x TBE bufferThermo Fisher15581044
Nalgene Rapid-Flow™ Filter UnitThermo Fisher166-0045
KimwipeKimberly-Clark34133
TEMEDThermo Fisher17919
SYBR-Safe dyeThermo FisherS33102
6% TBE-urea mini-gelThermo FisherEC6865BOX
ChemiDocBio-Rad
T4 PNKNEBM0201S
γ-32P-ATPPerkin ElmerNEG035C005MC
Hyperscreen™ Intensifying ScreenGE HealthcareRPN1669calcium tungstate phosphor screen
phosphor storage screenMolecular DynamicsBAS-IP MS 3543 E
Amersham TyphoonGE Healthcare
NAI (2M)EMD Millipore03-310
GlycoBlueThermo FisherAM9515
SuperScript IV Reverse TranscriptaseThermo Fisher18090010Contains 5x RT buffer, SuperScript IV
dNTP mix (10 mM)Thermo FisherR0192
ddNTP set (5 mM)SigmaGE27-2045-01
large filter paperWhatman1001-917
Gel dryerHoeferGD 2000
QIAamp DNA Blood Mini KitQiagen51104Also contains RNase A and protease K
SMN2 minigene34Addgene72287
Heat inactivated FBSThermo Fisher10438026
Pen-StrepThermo Fisher15140122
Opti-MEM IThermo Fisher31985062
FuGene HDPromegaE2311
TrpLEThermo Fisher12605010
DPBS without Ca/MgThermo Fisher14190250
TRIzolThermo Fisher15596018
RNeasy mini columnQiagen74104Also contains RW1, RPE buffer
RNase-Free DNase SetQiagen79254Contains DNase I and RDD buffer
Deionized formamideThermo FisherAM9342
MnCl2•4H2OSigma-AldrichM3634
random nonamerSigma-AldrichR7647
SuperScript First-Strand Synthesis SystemThermo Fisher11904-018Contains 10x RT buffer, SuperScript II reverse transcriptase
AccuPrime pfx DNA polymerseThermo Fisher12344024
NextSeq500Illumina
NucAway columnThermo FisherAM10070for desalting purpose

References

  1. Wilkinson, K. A., Merino, E. J., Weeks, K. M. Selective 2'-hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE): Quantitative RNA structure analysis at single nucleotide resolution. Nature Protocols. 1, 1610-1616 (2006).
  2. Trausch, J. J., et al. Structural basis for diversity in the SAM clan of riboswitches. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111, 6624-6629 (2014).
  3. Souliere, M. F., et al. Tuning a riboswitch response through structural extension of a pseudoknot. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110, E3256-E3264. , E3256-E3264 (2013).
  4. Rice, G. M., Busan, S., Karabiber, F., Favorov, O. V., Weeks, K. M. SHAPE Analysis of Small RNAs and Riboswitches. Methods in Enzymology. , 165-187 (2014).
  5. Spitale, R. C., et al. RNA SHAPE analysis in living cells. Nature Chemical Biology. 9, 18-20 (2013).
  6. Wang, J., Schultz, P. G., Johnson, K. A. Mechanistic studies of a small-molecule modulator of SMN2 splicing. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115, E4604-E4612 (2018).
  7. Price, I. R., Gaballa, A., Ding, F., Helmann, J. D., Ke, A. Mn 2+ -Sensing Mechanisms of yybP-ykoY Orphan Riboswitches. Molecular Cell. 57, 1110-1123 (2015).
  8. Hennelly, S. P., Sanbonmatsu, K. Y. Tertiary contacts control switching of the SAM-I riboswitch. Nucleic Acids Research. 39, 2416-2431 (2011).
  9. Abulwerdi, F. A., et al. Development of Small Molecules with a Noncanonical Binding Mode to HIV-1 Trans Activation Response (TAR) RNA. Journal of Medicinal Chemistry. 59, 11148-11160 (2016).
  10. Shortridge, M. D., et al. A Macrocyclic Peptide Ligand Binds the Oncogenic MicroRNA-21 Precursor and Suppresses Dicer Processing. ACS Chemical Biology. 12, 1611-1620 (2017).
  11. Warner, K. D., Hajdin, C. E., Weeks, K. M. Principles for targeting RNA with drug-like small molecules. Nature Reviews Drug Discovery. 17, 547-558 (2018).
  12. Mullard, A. Small molecules against RNA targets attract big backers. Nature Reviews Drug Discovery. 16, 813-815 (2017).
  13. Shortridge, M. D., Varani, G. Structure based approaches for targeting non-coding RNAs with small molecules. Current Opinion in Structural Biology. 30, 79-88 (2015).
  14. Gallego, J., Varani, G. Targeting RNA with Small-Molecule Drugs: Therapeutic Promise and Chemical Challenges. Accounts of Chemical Research. 34, 836-843 (2001).
  15. Rizvi, N. F., Smith, G. F. RNA as a small molecule druggable target. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 27, 5083-5088 (2017).
  16. Connelly, C. M., Moon, M. H., Schneekloth, J. S. The Emerging Role of RNA as a Therapeutic Target for Small Molecules. Cell Chemical Biology. 23, 1077-1090 (2016).
  17. Palacino, J., et al. SMN2 splice modulators enhance U1-pre-mRNA association and rescue SMA mice. Nature Chemical Biology. 11, 511-517 (2015).
  18. Ratni, H., et al. Discovery of Risdiplam, a Selective Survival of Motor Neuron-2 ( SMN2 ) Gene Splicing Modifier for the Treatment of Spinal Muscular Atrophy (SMA). Journal of Medicinal Chemistry. 61, 6501-6517 (2018).
  19. Naryshkin, N., et al. SMN2 splicing modifiers improve motor function and longevity in mice with spinal muscular atrophy. Science. 345, (2014).
  20. Chiriboga, C., et al. Preliminary Evidence for Pharmacodynamics Effects of RG7916 in JEWELFISH, a Study in Patients with Spinal Muscular Atrophy who Previously Participated in a Study with Another SMN2-Splicing Targeting Therapy (S46.003). Neurology. 90, (2018).
  21. Sivaramakrishnan, M., et al. Binding to SMN2 pre-mRNA-protein complex elicits specificity for small molecule splicing modifiers. Nature Communications. 8, (2017).
  22. Lee, B., et al. Comparison of SHAPE reagents for mapping RNA structures inside living cells. RNA. 23, 169-174 (2017).
  23. Weeks, K. M., Mauger, D. M. Exploring RNA Structural Codes with SHAPE Chemistry. Accounts of Chemical Research. 44, 1280-1291 (2011).
  24. Smola, M. J., et al. SHAPE reveals transcript-wide interactions , complex structural domains , and protein interactions across the Xist lncRNA in living cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113, 10322-10327 (2016).
  25. Flynn, R. A., et al. Transcriptome-wide interrogation of RNA secondary structure in living cells with icSHAPE. Nature Protocols. 11, 273-290 (2016).
  26. Smola, M. J., Rice, G. M., Busan, S., Siegfried, N. A., Weeks, K. M. Selective 2 ′ -hydroxyl acylation analyzed by primer extension and mutational profiling (SHAPE-MaP) for direct , versatile and accurate RNA structure analysis. Nature Protocols. 10, 1643-1669 (2015).
  27. Hua, Y., et al. Antisense correction of SMN2 splicing in the CNS rescues necrosis in a type III SMA mouse model. Genes & Development. 24, 1634-1644 (2010).
  28. Hua, Y., et al. Peripheral SMN restoration is essential for long-term rescue of a severe spinal muscular atrophy mouse model. Nature. 478, 123-126 (2011).
  29. Wee, C. D., Havens, M. A., Jodelka, F. M., Hastings, M. L. Targeting SR proteins improves SMN expression in spinal muscular atrophy cells. PloS One. 9, e115205 (2014).
  30. Hammond, J. A., Rambo, R. P., Filbin, M. E., Kieft, J. S. Comparison and functional implications of the 3D architectures of viral tRNA-like structures. RNA. 15, 294-307 (2009).
  31. Singh, N. N., Singh, R. N., Androphy, E. J. Modulating role of RNA structure in alternative splicing of a critical exon in the spinal muscular atrophy genes. Nucleic Acids Research. 35, 371-389 (2007).
  32. Deigan, K. E., Li, T. W., Mathews, D. H., Weeks, K. M. Accurate SHAPE-directed RNA structure determination. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 97-102 (2009).
  33. Qi, H., et al. . Preparation of pyridopyrimidine derivatives and related compounds for treating spinal muscular atrophy. , (2013).
  34. Lorson, C. L., Hahnen, E., Androphy, E. J., Wirth, B. A single nucleotide in the SMN gene regulates splicing and is responsible for spinal muscular atrophy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 6307-6311 (1999).
  35. Siegfried, N. A., Busan, S., Rice, G. M., Nelson, J. A. E., Weeks, K. M. RNA motif discovery by SHAPE and mutational profiling (SHAPE-MaP). Nature Methods. 11, 959 (2014).
  36. Milligan, J. F., Groebe, D. R., Witherell, G. W., Uhlenbeck, O. C. Oligoribonucleotide synthesis using T7 RNA polymerase and synthetic DNA templates. Nucleic Acids Research. 15, 8783-8798 (1987).
  37. Nilsen, T. W. RNase Footprinting to Map Sites of RNA-Protein Interactions. Cold Spring Harbor Protocols. , (2014).
  38. Velagapudi, S. P., et al. Design of a small molecule against an oncogenic noncoding RNA. Proceedings of the National Academy of Sciences. , 5898-5903 (2016).
  39. Barnwal, R. P., Yang, F., Varani, G. Applications of NMR to structure determination of RNAs large and small. Archives of Biochemistry and Biophysics. 628, 42-56 (2017).
  40. Scott, L. G., Hennig, M. RNA structure determination by NMR. Methods in Molecular Biology. 452, 29-61 (2008).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

143 RG 7916

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved