JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

الموصوفة هنا أسلوب لتحليل تعبير الجينات البكتيرية في الأنسجة الحيوانية على مستوى خلوي. هذا الأسلوب يوفر موردا لدراسة التنوع المظهرية التي تحدث داخل سكان بكتيرية في الاستجابة للبيئة الأنسجة أثناء عدوى.

Abstract

وكثيراً ما ينظم الجينات الفوعة الجرثومية على المستوى النسخي العوامل المتعددة التي تستجيب لإشارات بيئية مختلفة. وتعمل بعض العوامل مباشرة على الجينات الفوعة؛ الآخرين السيطرة المرضية عن طريق ضبط التعبير عن المنظمين المصب أو تراكم الإشارات التي تؤثر على نشاط منظم. في حين درست التنظيم على نطاق واسع من خلال النمو في المختبر ، يعرف سوى القليل نسبيا هو حول كيف يتم تعديل التعبير الجيني أثناء الإصابة. هذه المعلومات المهم عند منتج معين جينات مرشح للتدخل العلاجي. مثل النهج النسخي RT-PCR الكمي، في الوقت الحقيقي وتسلسل الحمض النووي الريبي وسائل قوية لدراسة التعبير الجيني على مستوى عالمي، لكنها تعاني من العديد من التحديات التقنية بما في ذلك وفرة منخفضة من الحمض النووي الريبي البكتيرية بالمقارنة مع المضيف الجيش الملكي النيبالي، وعينه تدهور قبل رنسيس. تقييم تنظيم استخدام الصحفيين الفلورسنت سهلة نسبيا، ويمكن أن يكون متعدد مع البروتينات الفلورية مع الخواص الطيفية فريدة من نوعها. الأسلوب يسمح لتحليل التعبير الجيني في الأنسجة التي تظهر التدرجات العمارة والفيزيائية ثلاثية الأبعاد المعقدة التي تؤثر على الشبكات التنظيمية البكتيرية وحيدة الخلية، والزمانية المكانية. هذه المعلومات يتم فقدان عندما يتم حساب متوسط البيانات على معظم السكان. وهنا، يصف لنا طريقة للتحديد الكمي للتعبير الجيني في مسببات الأمراض البكتيرية في الموقع. الأسلوب الذي يستند إلى تجهيز الأنسجة البسيطة والملاحظة المباشرة من الأسفار من البروتينات مراسل. نبدي بفائدة هذا النظام بدراسة التعبير عن المكوّرات العنقودية الذهبية ثيرمونوكليسي (نشاط)، منتج الجين الذي مطلوب للتهرب من الحصانة وضراوة كامل السابقين فيفو والمجراه. ونحن تبين أن نشاط التجارة والنقل هو المعرب عنها بقوة في الخراجات الكلوية وتكشف عن التعبير الجيني غير متجانسة الواجبة في الجزء الظاهر التنظيم المكاني نشاط المروج النشاط في الخراجات منخرطة تماما مع الاستجابة المناعية. يمكن تطبيق الأسلوب لأي جرثومة مع نظام وراثية مانيبولاتابل وأي نموذج العدوى، وتوفير معلومات قيمة للدراسات الإكلينيكية وتطوير العقاقير.

Introduction

البكتيريا تستجيب لتغيير الظروف الفسيولوجية والتغيرات في الحالة التغذوية لبيئتهم بخلطات التعبير عن الجينات اللازمة للتكيف والبقاء على قيد الحياة. على سبيل المثال، استعمار مسببات الأمراض الانتهازية الجسم السطوح في نسبيا منخفضة الكثافة، وغالباً ما تكون غير مؤذية. ومع ذلك، مجرد البكتيريا قد اخترقت الحواجز المادية والكيميائية، يجب أن يتعامل مع المضيف المناعي خلية مكافحة الدفاعات وتقييد توافر المغذيات1. على سبيل مثال، المكوّرات العنقودية الذهبية كولونيزيس حوالي ثلث السكان أعراض ولكن أيضا قضية المدمرة الجلد والتهابات الأنسجة الرخوة والتهاب العظم والنقي والتهاب الشغاف وتجرثم2. ويعزى النجاح في المذهبة س. كمسببات المرض غالباً ما المرونة الأيضية، فضلا عن ترسانة من عوامل الفوعة المرتبطة بالسطح ويفرزها تمكن البكتيريا الهروب مجرى الدم وتكرار في الأنسجة المحيطة 34،،5. لأن المضيف الموت بسبب المرض العنقوديات هو مسدود التطورية ونقل حدود ل المضيفين الجديدة6، يجب أن تسيطر الالتزام بإنتاج عامل الفوعة بعناية.

شبكة تنظيمية معقدة من البروتينات والكشف غير الترميز يستجيب لمجموعة متنوعة من المحفزات البيئية، بما في ذلك الخلية كثافة ومرحلة النمو والعوامل المرتبطة العَدلات، وتوافر المغذيات، لضمان أن يتم التعبير عن الجينات الفوعة في دقة الوقت والمكان داخل المضيف الأنسجة7،8،9،10،11،،من1213. على سبيل المثال، ينظم النظام مركبين ساير/S (TCS) التعبير عن عدة عوامل الفوعة عبر كيناز الاستشعار (سايس) و رد منظم (ساير)14. سايس أوتوفوسفوريلاتيد على بقايا الحامض الأميني مصانة في استجابة للمضيف إشارات (مثل، البشرية العَدلات الببتيدات [هنبس]، كالبروتيكتين)8،،من1516. مجموعة فوسفوريل ثم نقل إلى بقايا اسبارتاتي على ساير، تفعيل ذلك بروتين الحمض النووي ملزم (ساير ~ ف)17. وينظم TCS ساير/S ما يزيد على 20 من الجينات التي تساهم في الآلية المرضية بما في ذلك فيبرونيكتين ملزم البروتينات (فنببس)، ليوكوسيدينس، والمخثره14،18،،من1920. ويمكن تصنيف الأهداف إلى الجينات تقارب عالية ومنخفضة-تقارب الأهداف، التي من المحتمل الناجم عن مستوى ساير ~ ف يرتفع عندما تتعرض لما العظة21. ويسيطر النشاط ساير/S الأخرى المنظمين للتعبير الجيني مثل نظام الاستشعار عن النصاب الزراعية، قامع السموم البروتين (Rot)، وبديلة سيغما عامل ب (سيجب)22،،من2324.

نشاط هو جينات فوعة تعتمد على ش في المكوّرات العنقودية الذهبية وترميز ثيرمونوكليسي (نشاط)، الذي أمر ضروري للهروب من نيوتروفيليك هإكستراسيلولار ربرامج العمل الإقليمية (شبكات) ونشر خلال دورة العدوى،من25إلى26. تعبير عن نشاط القمع أيضا بشدة شكل غير مباشر بواسطة كودي حضور الأحماض الأمينية متفرعة السلسلة وأنشئ27، ومباشرة للقمع بالبروتين منظم التبعي العنقوديات سارة28،29 ، يتأثر نشاطها بالأكسجين (حالة الأكسدة) ودرجة الحموضة30. نظراً لأن يتم تخفيف طفرات ساي و نشاط في نماذج الماوس للعدوى، هناك اهتمام بتطوير التدخلات الكيميائية التي تمنع تلك الأنشطة المقابلة26،31. وبالرغم من ذلك، لا توجد معلومات بشأن تنظيمها أثناء الإصابة.

وقد استخدمت الفلورسنت الصحفيين لرصد وقياس التعبير الجيني على مستوى الخلية الواحدة. وهنا، نقدم طريقة لقياس S. التعبير الجيني في المذهبة أثناء الإصابة، عندما يقترن الترنسكربيتوم في المختبر تحليل وقوية تقنيات التصوير مثل التصوير بالرنين المغناطيسي (التصوير بالرنين المغناطيسي)، والتحليل الطيفي الرنين المغناطيسي (السيدة)، يمكن أن تكشف عن كيف البكتيرية وينظم علم وظائف الأعضاء في فيفو ووفرة نسبية من المواد الغذائية في بعض المنافذ. يمكن تطبيق الأسلوب لأي مسببات الأمراض البكتيرية مع نظام وراثية أصعب.

نظرة عامة على ناقل الجينوم التكاملية.

PRB4 ناقلات التكاملية الجينوم يحتوي على 500 قاعدة أزواج كل من مناطق بسيودوجيني S. aureus USA300 SAUSA300_0087 لتسهيل جزئ مثلى المنبع والمصب. pRB4 مشتق من العمود الفقري ناقل بماد حساسة لدرجة الحرارة التي تتضمن الاريثروميسين المقاومة كاسيت (ارمك) والحرارة بيتا-جالاكتوسيداسي جين بجاب لفحص أبيض وأزرق من ريكومبينانتس32. بناء هندسيا مراسل يحتوي أيضا على علامة مقاومة كلورامفينيكول (لجنة مناهضة التعذيب) للتحديد بعد دمج الجينوم والقضاء بلازميد، فضلا عن مواقع اكوري وسماي فتيل المنطقة التنظيمية التي تهم الأخضر سوبيرفولدير الفلورسنت البروتين (سجفب) (الشكل 1). ومن المعروف أن اختيار موقع الربط الريبوسوم (RBS) يؤثر على نشاط المراسل، وغالباً ما يتطلب التحسين التجريبية33. وهكذا، لم يتم توفير RBS. هنا، يستخدم الموقع ملزم الريبوسوم الأصلية لتوفير لنمط أكثر طبيعية من التعبير الجيني، ولكن يمكن أن تستخدم في مواقع أخرى.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

عليها جميع الأساليب الموصوفة هنا "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك) من جامعة جورج تاون.

1-جيل سلالة مراسل نيون

  1. هضم ناقل pRB4 التكاملية الجينوم تسلسلياً مع إنزيمات التقييد اكوري وسماي. بعد البروتوكول الخاص بالشركة المصنعة، إعداد هضم بين عشية وضحاها مع سماي باستخدام 1 ميكروغرام من pRB4 عند 25 درجة مئوية، وثم المضي قدما في الهضم الثاني ح 1 في 37 درجة مئوية بإضافة اكوري إلى خليط رد فعل. إلغاء تنشيط الإنزيمات التي تفرخ في 65 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
  2. [بكر] تضخيم المنطقة التنظيمية لمصلحة من الحمض النووي (في هذه حالة، زوج قاعدي ~ 350 الحمض النووي جزء يحتوي على منطقة المروج ثيرمونوكليسي [نشاط])، يتضمن موقع تقييد اكوري 5 'وموقع تقييد سماي 3'. يجب أن يكون التسلسل الاعتراف سماي في الإطار مع كودون بداية متعدية الجنسيات. في هذه الدراسة، تم إجراء بكر باستخدام بوليميراز الدنا عالية الدقة وفقا لتوصيات الشركة المصنعة مع التمهيدي إلى الأمام oRB015 (5 '-أتكاتجاتكتككااجتااتاتاجتاتاك-3')، وعكس (oRB016 التمهيدي --ججكاتاكتاكاككتكتتكتتتتاج 5 '-3'). وكانت درجة الحرارة انلينغ 53 درجة مئوية. تنقية الشظايا الناتجة باستخدام مجموعة أدوات تنظيف PCR اتباع إرشادات الشركة المصنعة.
  3. والخلاصة ناتج PCR مع اكوري وسماي كما يؤديها في الخطوة 1، 1 سد جزء الحمض النووي هضمها إلى نفس المواقع من pRB4 باستخدام الحمض النووي T4 ليجاسى حسبما أوصت به الشركة المصنعة لإنشاء بنية تكاملية. يدخل الخليط ربط كولاي وتأكيد بناء التسلسل.
  4. كما سبق ذكره اليكتروبوراتي البناء في المذهبة س. سلالة RN422034. وباختصار، استخدم 1 ميكروغرام من بلازميد مع 70 ميليلتر من الخلايا الكهربائية المختصة (100 Ω، µF 25، و 2.3 كيلو فولت) في المرق B2 (1% [w/v] الكازين هيدروليساتي، استخراج الخميرة 2.5% [w/v]، 2.5% [w/v] كلوريد الصوديوم، 0.1% [w/v] ك2ص4، 0.5% [w/v] الجلوكوز). حدد للمقاومة الاريثروميسين (مص) عند درجة حرارة (30 درجة مئوية) متساهلة في فول الصويا تريبتيك أجار (TSA) وتستكمل مع الاريثروميسين (مل ميكروغرام 5-1) و 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-غال؛ 80 ميكروغرام مل-1). ترانسفورمانتس الناتجة الأزرق بسبب النشاط ترميز بلازميد β-جالاكتوسيداسي.
    ملاحظة: نقل الحمض النووي إلى يعزل السريرية صعب للغاية بسبب حاجز قوي تقييد-تعديل35. وهكذا، RN4220 المذهبة س. كمستلم متوسطة بناء الانصهار لأنها تقييد ناقصة والتحويلية العالية.
  5. نقل بلازميد إلى سلالة USA300 المذهبة س. الاهتمام باستخدام انهانسر أو توصيل بالعاثية بوساطة36 في درجة حرارة متساهلة. وباختصار، نشر Φ عاثية11 الجسيمات في سلالة المانحة استخدام لوحات حساب السياحة الفرعي الذي يحتوي على 5 مم كاكل2 بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية، وتعقيم ثم عن طريق الترشيح من خلال مرشح حقنه اسيتات السليلوز ميكرومتر 0.45. استخدم ليساتيس ترانسدوسي سلالة المذهبة س. لاك أن مآر.
    ملاحظة: من أمريكا اللاتينية والكاريبي عزل سريرية مستخدمة على نطاق واسع التي كان سبق أن قدمه م الحساسة مرور المسلسل في المتوسطة TSB لعلاج سلالة pUSA03 بلازميد الأصلي يمنح مص 37,38.
  6. الاندماج في البناء الأحداث المتعاقبة جزئ مثلى اثنين، في الصبغي كما هو موضح مسبقاً32. ريكومبينانتس هي الكلورامفينيكول المقاوم (سمr) على لوحات حساب السياحة الفرعي الذي يحتوي على 5 ميكروغرام مل-1 كلورامفينيكول، عرضه الاريثروميسين (Erms) ولا الأزرق أطول.
    ملاحظة: عندما يكون ذلك ممكناً، إعادة إدخال الانصهار ملحوظ في USA300 عن طريق توصيل بالعاثية بوساطة لتجنب تراكم الطفرات المرتبطة بالضغط في المختبر مرور39 ودرجة الحرارة نوبات.

2-الإصابة الحيوان: إعداد العدوى والإصابة الجهازية، وتجهيز الأنسجة

  1. إعداد العدوى البكتيرية
    1. متتالية سلالات المكوّرات س. من الفائدة للعزلة في لوحات أجار الدم من مخزون والغليسيرول مجمدة. احتضان في 37 درجة مئوية ح 16-24 لتأكيد الانحلالي تعمل استناداً إلى قدرتها على خلايا الدم الحمراء (كرات الدم الحمراء) ونموذج مسح مناطق شفافة.
    2. بدء الثقافات بين عشية وضحاها بتطعيم المستعمرات واحدة لكل سلالة إلى 4 مل مرق الصويا تريبتيك (TSB) في أنابيب زجاجية معقمة. تدوير الأنابيب في 37 درجة مئوية ح 16 – 24 في اسطوانة أنبوبة تعيين الساعة تقريبا بزاوية 70 درجة وتناوب 70 في الدقيقة الواحدة [ربم].
    3. استخدام جهاز المطياف الضوئي قياس الكثافة البصرية 600 نانومتر (OD600) الثقافات من الخطوة 2.1.2. استخدام الوسيلة عقيمة كإشارة ضوئية (فارغة). تضعف هذه الخلايا ل التطوير التنظيمي600 0.05 في 25 مل من العقيمة تريبتيك الصويا مرق (TSB) في فصل، 125 مل ديلونغ قوارير (قارورة 5:1 إلى نسبة الحجم)، واحتضان الثقافات في حمام مائي (لنقل الحرارة المناسبة للثقافات)، تهز 280 لفة في الدقيقة وتعيين إلى 37 درجة مئوية.
      ملاحظة: يمكن أن يتم النمو العدوى في طرق مختلفة؛ ويقدم أسلوب واحد لزراعة الخلايا إلى مرحلة الأسى. بغض النظر، من المهم أن استمرار استخدام نفس الأسلوب لإعداد الخلايا للتطعيم.
    4. OD600 ~ 1، إعادة تمييع الخلايا في متوسطة جديدة لانطلاق OD600 0.05 لضمان تحقيق الخلايا مرحلة الأسى وأن العوامل التي تتراكم خلال الحضانة بين عشية وضحاها قد خفضت إلى مستويات المرحلة الأسية.
    5. حصاد الخلايا أثناء مرحلة الأسى (OD600 ~0.6–0.8) التي سينتريفوجينج في 3,000 ز x لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    6. تغسل الكريات مرتين في ما يعادل حجم العقيمة 1 × مخزنة الفوسفات المالحة (برنامج تلفزيوني؛ ودرجة الحموضة 7.4).
    7. تعليق الخلايا في برنامج تلفزيوني 1 x (الرقم الهيدروجيني 7.4) بتركيز 1 × 108 مستعمرة تشكيل وحدات (كفوس) مل-1 أو ما يناسب المطلوب التجربة.
      ملاحظة: من الأهمية بمكان لتحديد العلاقة بين التطوير التنظيمي600 وزيمبابوي مل-1 لكل سلالة من الاهتمام نظراً للتعديلات المعتمدة على سلالة من حجم الخلية والشكل يمكن أن تؤثر على خصائص تشتت الضوء، وفي نهاية المطاف، جرعة العدوى.
  2. إعداد الحيوانات والعدوى البكتيرية
    1. تأقلم الفئران لمدة 7 أيام على حمية تنقية العين-93. وضعت في النظام الغذائي لتوفير التغذية الكافية مع التقليل من الأنسجة السيارات-الأسفار المرتبطة باستهلاك المكونات النباتية المستخدمة في الماوس القياسية تشو40.
      ملاحظة: الإناث فئران C57/BL6 (6-8 أسابيع من العمر) وتستخدم هنا، ولكن بضغط الماوس والجنس يعتمد على الدراسة.
    2. قبل الإصابة، تمدد الأوردة ذيل الماوس بماء فاتر.
    3. تصيب الحيوانات بالحقن ميليلتر 100 من العدوى البكتيرية عن طريق الأوردة الذيل لإنتاج عدوى المجموعية. حفظ قاسمة للعدوى الأولية إذا كان أداء التدفق الخلوي (انظر القسم 4).
    4. مراقبة الحيوانات يوميا وتقييم حالتهم الصحية باستخدام نظام رصد لاستعراضها والموافقة عليها أحد لرعاية الحيوان المؤسسية واستخدام اللجنة.
    5. السماح بالعدوى إلى التقدم للمدة المطلوبة. هنا، هي التجارب التي أنهيت 3 أيام بعد الإصابة.
      ملاحظة: في ظل هذه الظروف، والخراجات تتألف من مجتمع الخراج العنقوديات من البكتيريا، وإحاطتها برواسب فيبرينوجين، ومحاطة بطبقات متحدة المركز من الخلايا المناعية5،41.
  3. تجميع الأجهزة وتجهيز الأنسجة
    1. Euthanize الحيوانات باستنشاق أول أكسيد الكربون2 والتفكك عنق الرحم كوسيلة ثانوية وأداء نيكروبسي.
    2. الحصاد الكلي (يمين) والأجهزة الحيوية الأخرى (القلب والكبد والرئتين والطحال) ونقل إلى 15 مل أنابيب البولي بروبلين التي تحتوي على الفورمالين 10% [v/v] مخزنة مؤقتاً. المضي قدما في هذه الأجهزة الخطوة 2.3.4 أدناه.
    3. نقل الكلي اليسرى إلى أنبوب مقاومة لتأثير معقم 2 مل تحتوي على ميليلتر ~ 500 2 مم والسليكا الخرز ومل 1 x 1 العقيمة PBS (درجة الحموضة 7.4). المضي قدما مع هذا الجهاز إلى الخطوة 4، 2.
    4. السماح للأجهزة من الخطوة 2.3.2 لإصلاح في الظلام في درجة حرارة الغرفة بالهز لطيف أو بالتناوب لمدة 24 ساعة على الأقل ولكن ليس أكثر من 48 ساعة.
    5. قم بتضمين أجهزة في الأنسجة واضحة تجميد المتوسطة وتخزين الأنسجة في-80 درجة مئوية.
    6. استخدام كريوستات، قسم النسيج إلى شرائح من 10 ميكرون سمك.
    7. الجاف للمقاطع على شريحة زجاج تنظيفها مسبقاً، ومشحونة لمدة 20 دقيقة في الظلام وتطبيق المتوسطة التركيب الثابت مع 4 ', 6-دياميدينو-2-فينيليندولي (DAPI) وصمة عار، وتطبيق ساترة. علاج الشرائح المركبة في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها، ونقل إلى 4 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل.

3-ليزر المسح المجهري [كنفوكل] ومعالجة الصور

  1. دراسة الشرائح المحملة لتحديد موقع الآفات استخدام أشعة الليزر المناسبة للمراسل الفلورسنت المستخدمة. في هذه الحالة، والأخضر (التجارة والنقل) والأحمر (تدتوماتو)، والأزرق (DAPI) الأسفار تستخدم الإشارات.
  2. الحصول على الصورة باستخدام الهدف المناسب لتصور خلايا فردية (مثل عادة 20 x أو 40 س الأهداف المستخدمة).
  3. قياس كثافة fluorescence في الصور [كنفوكل].
    1. فتح الصورة [كنفوكل] في "ي الصورة" وضبط السطوع/التباين لتصور إشارة fluorescence الآفة بشكل صحيح.
    2. تعريف المنطقة من الفائدة، وقبل استخدام خيار مستوى العتبة ، وتعيين حدود fluorescence السفلي والعليا حسب الضرورة.
    3. تعريف centroid واسطة تحديد ← متوسط قيمة الرمادي ← منطقة Centroid ← الحد إلى عتبة ضمن علامة التبويب تحليل في "صورة ج."
    4. استخراج قيمة كثافة fluorescence centroid أو قياس كثافة fluorescence يعني في آفة معين في وحدة المساحة (الأسفار متوسط الكثافة، مؤسسة مونتانيار) للتجارة والنقل وتدتوماتو. وهنا استخدمت المناطق من واحد ميكرومتر2 .
      ملاحظة: إجراء تحليل ثان أعمى يقلل التحيز عندما يعرف هوية العينة.
    5. رسم البيانات وإجراء التحليلات الإحصائية المناسبة لكل مقارنة.

4-التدفق الخلوي التحليل

  1. (اختياري) تحديد النشاط الانصهار للعدوى في يوم العدوى (من القسم 2.2.3)
    1. إلى 899 ميليلتر من 1 x PBS العقيمة (درجة الحموضة 7.4) إضافة 100 ميليلتر من كل العدوى ووصمة 1 ميليلتر من غشاء بيرميانت الحمض النووي (انظر الجدول للمواد). كعنصر تحكم، يجب التأكد من إدراج عينة تفتقر إلى الأحماض النووية وصمة عار.
    2. أداء التدفق الخلوي في جميع العينات.
      ملاحظة: للتجربة الأولى، أنها مفيدة لتضمين عنصر تحكم فقط ناقل لانصهار الفائدة لتحديد الجهد المناسب لاستخدام. مشيراً إلى المراسل فصل واضح بين نماذج إيجابية وسلبية أمر أساسي لتحليل البيانات، وكذلك أعلاه إشارة خلفية.
    3. لتحديد السكان البكتيرية، وصمة عار على المحور (ص) أحداث الأرض باستخدام الحمض النووي والإمام المبعثر (س).
    4. رسم بوابة إدراج حول الأحداث التي وصمة عار الحمض النووي على حد سواء إيجابية والحجم الصحيح للبكتيريا استناداً إلى مبعثر إلى الأمام (بين 0.5 إلى 2.0 ميكرون المكوّرات س.).
      ملاحظة: تكون صارمة عند تحديد هذه الفئة من السكان كما أنها حاسمة لتشمل الأحداث التي من الواضح أنها في حدود هذه البارامترات. تأكد من أن هذه البوابة لا يشمل جميع الأحداث لعناصر التحكم السلبي في ظل ظروف أخرى. في هذه الدراسة، حوالي 70% السكان خلية اجتمعت هذه الشروط في التحليل.
  2. تحليل عينات الأنسجة بعد التضحية:
    1. Euthanize الحيوانات والحصاد الكلي اليسرى (راجع الخطوة 2، 3) ونقل إلى ضرب حبة أنابيب تحتوي على 1 مل 1 × PBS العقيمة (درجة الحموضة 7.4) و 250 ميليلتر من حبات البورسليكات 2 مم.
    2. تعطيل الأنسجة للإفراج عن الخلايا البكتيرية. للكلى واستخدام الخالطون لتعطيل الخلايا. هنا، استخدمت s 30 ثلاث رشقات نارية عند 6800 دورة في الدقيقة مع 1 دقيقة فترات الجليد الرطب بين دورات التبريد للتقليل من عينات التدفئة.
    3. بيليه الحطام الأنسجة أكبر من سينتريفوجينج في 250 x ز لمدة 3 دقائق في ميكروسينتريفوجي منضدية تبريده إلى 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: بشكل عام، هناك بيليه خلية في الجزء السفلي من الأنبوب وطبقة من الحطام العائم في الجزء العلوي. طبقة وسطى مائي يحتوي على الخلايا البكتيرية.
    4. نقل 10 ميليلتر من الطبقة المائية في أنبوب ميكروسينتريفوجي نظيفة 1.5 مل يحتوي على 1 ميليلتر من الحمض النووي وصمة عار في 989 ميليلتر من برنامج تلفزيوني (إجمالي حجم 1 مل).
    5. أداء التدفق الخلوي باستخدام نفس المعلمات اقتناء البيانات والنابضة بالنسبة لقاح الأولية.
      ملاحظة: عدد خلايا بكتيرية ستكون منخفضة للغاية نظراً لأن العينة تحتوي أساسا على الحطام الأنسجة. يمكن أيضا استخدام الخيار "بوابة لايف" إذا كانت الخلايا وصمة عار الحمض النووي إيجابية وبوابات الحجم عندما يتم تحميل البيانات إلى التطبيق. هذا سوف يساعد أيضا تحليل أكثر من الأحداث المستهدف وتقليل حجم الملف. يتم عد الأحداث تقريبا 1 مليون لكل عينة، ولكن أكثر الأحداث التهم قد يكون من الضروري تبعاً لخطورة الإصابة وحجم الأنسجة التي تم تحليلها.
    6. تحليل البيانات: تحديد يعني شدة الفلورسنت (MFI) لكل فلوروفوري في عينة معينة باستخدام بوابات إدراج العزم في قسم 4.1.4. تطبيع عينات في برمجيات تحليل تدفق الحدث التهم الموجهة إليه. 10,000 التهم الموجهة إليه عادة ما تكون كافية في التحليل.
      ملاحظة: فإنه ليس من غير المألوف للعثور على العينات التي تحتوي على أقل من هذا العدد من الأحداث أن الأمر يعتمد على شدة الخراج تشكيل والعدوى. الأحداث واستخدام هذا النهج، 500-40,000 توجد عادة في الأنسجة المصابة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

وضعنا بلازميد المستمدة من بماد32 التي يمكن أن يحقق أي مراسل بناء الانصهار في الكروموسوم من جزئ مثلى كروس مزدوجة (الشكل 1). هذا البناء يسمح للتحليل الكمي لأي منطقة التنظيمية التي تدعم إنتاج البروتين بروتينات فلورية خضراء وإشارة مضيئة فوق الخلف?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

الأمراض المعدية البكتيرية مشكلة صحية متزايدة في جميع أنحاء العالم بسبب الحصول على مقاومة المضادات الحيوية محددات46. لأن التكيف مع البيئات المضيف أمر ضروري للنمو والبقاء على قيد الحياة خلال العدوى، استراتيجيات تستهدف البرامج تعبير الجينات التي تزيد من اللياقة البدنية الممرض...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.

Acknowledgements

ونحن نشكر ألكسندر هورسويل لهدية فsarAP1-تدتوماتو الانصهار، وكريسويل كارين للمساعدة في تحليل التدفق الخلوي. ونشكر أيضا الملك أليسا لإسداء المشورة بشأن التحليل الإحصائي. تم تمويل هذا العمل جزئيا "تحكيم البحث" الاستكشافي/الخلقية المعاهد الوطنية للصحة (منحة AI123708) وكلية أموال بدء التشغيل إلى SRB. وكان الممولين أي دور في تصميم الدراسة أو جمع البيانات وتفسير أو مقرر أن يقدم عمل للنشر.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
5% sheep bloodHardy Diagnostics (Santa Maria, CA)A10
5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal)ThermoScientificR0402
AmpicillinFisher ScientificBP1760-25
C57Bl/6 MiceCharles RiverNA
ChloramphenicolSigma-AldrichC-0378
confocal laser scanning microscopeZeissNA
cryostat microtomeThermo ScientificNA
Culture, CapVWR International2005-02512
D+2:25NA OligoIntegrated DNA Technologies (Coralville, Iowa)NA
DNA LigaseNew England BiolabsM0202S
ErythromycinSigma-AldrichE5389
Flow AnalyzerBecton DickinsonNA
glass beadsSigmaZ273627
Miniprep, plasmidPromegaA1220
orbital shaking water bathNew Brunswick InnovaNA
PCR purificationQIagen28106
Phosphate Buffer Saline (PBS)Cellgrow46-013-CM
Plate readerTecanNA
Precellys 24 homogenizerBertin LaboratoriesNA
pUC57-KanGenScript (Piscataway, NJ)NA
Q5 Taq DNA PolymeraseNew England Biolabs (Ipswich, MA)M0491S
Restriction EnzymesNew England Biolabs (Ipswich, MA)R0150S (PvuI), R3136S (BamHI), R0144S (BglII), R3131S (NheI), R0101S (EcoRI), R0141S (SmaI).
Reverse transcriptaseNew England BioLabsE6300L
Sanger SequencingGenewiz (Germantown, MD)NA
Sub Xero clear tissue freezing mediumMercedes MedicalMER5000
Superfrost Plus microscope slidesFisher Scientific12-550-15
superloopGE Lifesciences18111382
Syringe, FilterVWR International28145-481
Syto 40Thermo Fisher ScientificS11351Membrane permeant nucleic acid stain
TetracyclineSigma-AldrichT7660
Tryptic Soy BrothVWR90000-376
UV-visible spectrophotometerBeckman Coulter-DU350NA
Vectashield Antifade Mounting medium with DAPIVector LaboratoriesH-1500

References

  1. Hood, M. I., Skaar, E. P. Nutritional immunity: transition metals at the pathogen-host interface. Nature Reviews Microbiology. 10 (8), 525-537 (2012).
  2. Lowy, F. Staphylococcus aureus infections. The New England Journal of Medicine. 339 (8), 520-532 (1998).
  3. Grosser, M. R., et al. Genetic requirements for Staphylococcus aureus nitric oxide resistance and virulence. PLoS Pathogen. 14 (3), 1006907(2018).
  4. Valentino, M., et al. Genes contributing to Staphylococcus aureus fitness in abscess- and infection-related ecologies. MBio. 5 (5), 01714-01729 (2014).
  5. Cheng, A., et al. Genetic requirements for Staphylococcus aureus abscess formation and persistence in host tissues. FASEB Journal. 23 (10), 3393-3404 (2009).
  6. Meyers, L. A., Levin, B. R., Richardson, A. R., Stojiljkovic, I. Epidemiology, hypermutation, within-host evolution and the virulence of Neisseria meningitidis. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 270 (1525), 1667-1677 (2003).
  7. Balasubramanian, D., et al. Staphylococcus aureus Coordinates Leukocidin Expression and Pathogenesis by Sensing Metabolic Fluxes via RpiRc. MBio. 7 (3), 00818(2016).
  8. Geiger, T., Goerke, C., Mainiero, M., Kraus, D., Wolz, C. The virulence regulator Sae of Staphylococcus aureus.: promoter activities and response to phagocytosis-related signals. Journal of Bacteriology. 190 (10), 3419-3428 (2008).
  9. Weiss, A., Broach, W. H., Shaw, L. N. Characterizing the transcriptional adaptation of Staphylococcus aureus. to stationary phase growth. Pathogens and Disease. 74 (5), (2016).
  10. Balaban, N., Novick, R. P. Autocrine regulation of toxin synthesis by Staphylococcus aureus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (5), 1619-1623 (1995).
  11. Pohl, K., et al. CodY in Staphylococcus aureus: a regulatory link between metabolism and virulence gene expression. Journal of Bacteriology. 191 (9), 2953-2963 (2009).
  12. Majerczyk, C. D., et al. Staphylococcus aureus CodY negatively regulates virulence gene expression. Journal of Bacteriology. 190 (7), 2257-2265 (2008).
  13. McNamara, P. J., Milligan-Monroe, K. C., Khalili, S., Proctor, R. A. Identification, cloning, and initial characterization of rot, a locus encoding a regulator of virulence factor expression in Staphylococcus aureus. Journal of Bacteriology. 182 (11), 3197-3203 (2000).
  14. Liu, Q., Yeo, W. S., Bae, T. The SaeRS Two-Component System of Staphylococcus aureus. Genes (Basel). 7 (10), 81(2016).
  15. Giraudo, A., Calzolari, A., Cataldi, A., Bogni, C., Nagel, R. The sae locus of Staphylococcus aureus encodes a two-component regulatory system. FEMS Microbiology Letters. 177 (1), 15-22 (1999).
  16. Cho, H., et al. Calprotectin Increases the Activity of the SaeRS Two Component System and Murine Mortality during Staphylococcus aureus Infections. PLoS Pathogen. 11 (7), 1005026(2015).
  17. Sun, F., et al. In the Staphylococcus aureus two-component system sae, the response regulator SaeR binds to a direct repeat sequence and DNA binding requires phosphorylation by the sensor kinase SaeS. Journal of Bacteriology. 192 (8), 2111-2127 (2010).
  18. Liang, X., et al. Inactivation of a two-component signal transduction system, SaeRS, eliminates adherence and attenuates virulence of Staphylococcus aureus. Infection and Immunity. 74 (8), 4655-4665 (2006).
  19. Giraudo, A. T., Cheung, A. L., Nagel, R. The sae locus of Staphylococcus aureus controls exoprotein synthesis at the transcriptional level. Archives of Microbiology. 168 (1), 53-58 (1997).
  20. Flack, C. E., et al. Differential regulation of staphylococcal virulence by the sensor kinase SaeS in response to neutrophil-derived stimuli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (19), 2037-2045 (2014).
  21. Mainiero, M., et al. Differential target gene activation by the Staphylococcus aureus two-component system saeRS. Journal of Bacteriology. 192 (3), 613-623 (2010).
  22. Li, D., Cheung, A. Repression of hla by rot is dependent on sae in Staphylococcus aureus. Infection and Immunity. 76 (3), 1068-1075 (2008).
  23. Bischoff, M., et al. Microarray-based analysis of the Staphylococcus aureus sigmaB regulon. Journal of Bacteriology. 186 (13), 4085-4099 (2004).
  24. Novick, R., Jiang, D. The staphylococcal saeRS system coordinates environmental signals with agr quorum sensing. Microbiology. 149, Pt 10 2709-2717 (2003).
  25. Olson, M. E., et al. Staphylococcus aureus nuclease is an SaeRS-dependent virulence factor. Infection and Immunity. 81 (4), 1316-1324 (2013).
  26. Berends, E., et al. Nuclease expression by Staphylococcus aureus facilitates escape from neutrophil extracellular traps. Journal of Innate Immunity. 2 (6), 576-587 (2010).
  27. Waters, N. R., et al. A spectrum of CodY activities drives metabolic reorganization and virulence gene expression in Staphylococcus aureus. Molecular Microbiology. 101 (3), 495-514 (2016).
  28. Cassat, J., et al. Transcriptional profiling of a Staphylococcus aureus clinical isolate and its isogenic agr and sarA mutants reveals global differences in comparison to the laboratory strain RN6390. Microbiology. 152, Pt 10 3075-3090 (2006).
  29. Kiedrowski, M., et al. Nuclease modulates biofilm formation in community-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus. PLoS One. 6 (11), 26714(2011).
  30. Fujimoto, D. F., et al. Staphylococcus aureus SarA is a regulatory protein responsive to redox and pH that can support bacteriophage lambda integrase-mediated excision/recombination. Molecular Microbiology. 74 (6), 1445-1458 (2009).
  31. Yeo, W. S., et al. The FDA-approved anti-cancer drugs, streptozotocin and floxuridine, reduce the virulence of Staphylococcus aureus. Scientific Reports. 8 (1), 2521(2018).
  32. Arnaud, M., Chastanet, A., Débarbouillé, M. New vector for efficient allelic replacement in naturally nontransformable, low-GC-content, Gram-positive bacteria. Applied and Environmental Microbiology. 70 (11), 6887-6891 (2004).
  33. Malone, C. L., et al. Fluorescent reporters for Staphylococcus aureus. Journal of Microbiological Methods. 77 (3), 251-260 (2009).
  34. Schenk, S., Laddaga, R. A. Improved method for electroporation of Staphylococcus aureus. FEMS Microbiology Letters. 73 (1-2), 133-138 (1992).
  35. Monk, I. R., Foster, T. J. Genetic manipulation of Staphylococci-breaking through the barrier. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 2, 49(2012).
  36. Novick, R. P. Genetic systems in staphylococci. Methods in Enzymology. 204, 587-636 (1991).
  37. Diep, B. A., et al. Complete genome sequence of USA300, an epidemic clone of community-acquired meticillin-resistant Staphylococcus aureus. Lancet. 367 (9512), 731-739 (2006).
  38. Boles, B. R., Thoendel, M., Roth, A. J., Horswill, A. R. Identification of genes involved in polysaccharide-independent Staphylococcus aureus biofilm formation. PLoS One. 5 (4), 10146(2010).
  39. Villaruz, A. E., et al. A point mutation in the agr locus rather than expression of the Panton-Valentine leukocidin caused previously reported phenotypes in Staphylococcus aureus pneumonia and gene regulation. Journal of Infect Diseases. 200 (5), 724-734 (2009).
  40. Reeves, P. G., Nielsen, F. H., Fahey, G. C. J. AIN-93 purified diets for laboratory rodents: final report of the American Institute of Nutrition ad hoc writing committee on the reformulation of the AIN-76A rodent diet. Journal of Nutrition. 123 (11), 1939-1951 (1993).
  41. Thomer, L., Schneewind, O., Missiakas, D. Pathogenesis of Staphylococcus aureus Bloodstream Infections. Annual Review of Pathology. 11, 343-364 (2016).
  42. Olson, M., et al. Staphylococcus aureus nuclease is an SaeRS-dependent virulence factor. Infection and Immunity. 81 (4), 1316-1324 (2013).
  43. Thammavongsa, V., Missiakas, D., Schneewind, O. Staphylococcus aureus degrades neutrophil extracellular traps to promote immune cell death. Science. 342 (6160), 863-866 (2013).
  44. Cheung, A. L., Nast, C. C., Bayer, A. S. Selective activation of sar promoters with the use of green fluorescent protein transcriptional fusions as the detection system in the rabbit endocarditis model. Infection and Immunity. 66 (12), 5988-5993 (1998).
  45. Pilsczek, F. H., et al. A novel mechanism of rapid nuclear neutrophil extracellular trap formation in response to Staphylococcus aureus. Journal of Immunology. 185 (12), 7413-7425 (2010).
  46. Uhlemann, A. C., Otto, M., Lowy, F. D., DeLeo, F. R. Evolution of community- and healthcare-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Infection, Genetics and Evolution. 21, 563-574 (2014).
  47. Voyich, J. M., et al. The SaeR/S gene regulatory system is essential for innate immune evasion by Staphylococcus aureus. Journal of Infectious Diseases. 199 (11), 1698-1706 (2009).
  48. Cheng, A., DeDent, A., Schneewind, O., Missiakas, D. A play in four acts: Staphylococcus aureus. abscess formation. Trends in Microbiology. 19 (5), 225-232 (2011).
  49. Balasubramanian, D., Harper, L., Shopsin, B., Torres, V. J. Staphylococcus aureus pathogenesis in diverse host environments. Pathogens and Disease. 75 (1), (2017).
  50. Vitko, N. P., Grosser, M. R., Khatri, D., Thurlow, L. R., Richardson, A. R. Expanded Glucose Import Capability Affords Staphylococcus aureus Optimized Glycolytic Flux during Infection. MBio. 7 (3), 00296(2016).
  51. Landete, J. M., et al. Use of anaerobic green fluorescent protein versus green fluorescent protein as reporter in lactic acid bacteria. Applied Microbiology and Biotechnol. 99 (16), 6865-6877 (2015).
  52. Buckley, A. M., et al. Lighting Up Clostridium Difficile: Reporting Gene Expression Using Fluorescent Lov Domains. Scientific Reports. 6, 23463(2016).
  53. Bose, J. L. Genetic manipulation of staphylococci. Methods in Molecular Biology. 1106, 101-111 (2014).
  54. Krute, C. N., et al. Generation of a stable plasmid for in vitro and in vivo studies of Staphylococcus. Applied and Environmental Microbiology. , 02370(2016).
  55. Cassat, J. E., et al. Integrated molecular imaging reveals tissue heterogeneity driving host-pathogen interactions. Science Translational Medicine. 10 (432), 6361(2018).
  56. Handlogten, M. E., Hong, S. P., Westhoff, C. M., Weiner, I. D. Apical ammonia transport by the mouse inner medullary collecting duct cell (mIMCD-3). American Journal of Physiology-Renal Physiology. 289 (2), 347-358 (2005).
  57. Hijmans, B. S., Grefhorst, A., Oosterveer, M. H., Groen, A. K. Zonation of glucose and fatty acid metabolism in the liver: mechanism and metabolic consequences. Biochimie Journal. 96, 121-129 (2014).
  58. Davis, K. M., Mohammadi, S., Isberg, R. R. Community behavior and spatial regulation within a bacterial microcolony in deep tissue sites serves to protect against host attack. Cell Host & Microbe. 17 (1), 21-31 (2015).
  59. Stenman, J. M., et al. Canonical Wnt signaling regulates organ-specific assembly and differentiation of CNS vasculature. Science. 322 (5905), 1247-1250 (2008).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

144

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved