دراسات الكائنات الحية المجهرية في الفئران حديثي الولادة باستخدام تزقيمية

Summary

تفاصيل هذه الدراسة العملية جافاجينج كميات محددة من البروبيوتيك للفئران حديثي الولادة. الإعداد التجريبية هو الأمثل لتشمل ولكن لا تقتصر على الكائنات الحية المجهرية الجرعات، أساليب الإدارة، والتقدير الكمي للبكتيريا في الأمعاء.

Abstract

نماذج الماوس الكبار قد استخدمت على نطاق واسع فهم الآلية وراء تطور المرض في البشر. ويقتصر تطبيق الدراسات التي أجريت في نماذج الماوس الكبار لأمراض الأطفال حديثي الولادة. إلى فهم أفضل لتطور المرض واستجابات المضيف والأثر الطويل الأجل للتدخلات في الولدان، نموذج الفأر حديثي الولادة المحتمل تتناسب بشكل أفضل. استخدام نماذج الماوس الولدان متفرق يمكن أن يعزى جزئيا إلى الصعوبات التقنية للعمل مع هذه الحيوانات الصغيرة. وضع نموذج الولدان ماوس لتحديد آثار إدارة الكائنات الحية المجهرية في وقت مبكر من الحياة وعلى وجه التحديد تقييم القدرة على إقامة الاستعمار في الأمعاء الماوس حديثي الولادة. على وجه التحديد، لتقييم الاستعمار الكائنات الحية المجهرية في الماوس الأطفال حديثي الولادة، تم تسليم بلنتروم ملبنة (ليرة لبنانية) مباشرة في الجهاز الهضمي الماوس الأطفال حديثي الولادة. وتحقيقا لهذه الغاية، تدار ليرة لبنانية للفئران بالتغذية عن طريق تزقيمية مدتها (IE) داخل المريء. تم تطوير أسلوب استنساخه بدرجة عالية لتوحيد عملية تزقيمية IE تسمح إدارة دقيقة لجرعات بروبيوتيك مع التقليل من الصدمات، جانبا بالغ أهمية نظراً لهشاشة الفئران حديثي الولادة. وتشمل القيود هذه العملية إمكانيات تهيج المريء أو تلف وتطلع إذا جافاجيد بشكل غير صحيح. هذا النهج يمثل تحسنا عن الممارسات الحالية تزقيمية IE إلى المريء القاصي يقلل فرص الطموح. عقب تزقيمية مدتها، كان تتبع الشخصية الاستعمار للكائنات الحية المجهرية استخدام الكمية تفاعل البوليميراز المتسلسل (qPCR) من الحمض النووي المعوية المستخرجة مع الإشعال ليرة لبنانية محددة. إعدادات مختلفة من القمامة وتقنيات إدارة قفص استخدمت لتقييم احتمالات انتشار الاستعمار. تفاصيل البروتوكول تعقيدات تزقيمية الماوس الولدان IE والكمي الاستعمار اللاحقة مع ليرة لبنانية.

Introduction

في الرضع والتعرض المبكر للكائنات الحية المجهرية ارتبطت مع آثار إيمونومودولاتوري مما أدى إلى انخفاض حالات الإصابة بأمراض مثل التهاب الأمعاء والقولون النّاخر، الاستشرائية والإنتان^{1،2،3، 4 , 5}-إلا أن تحدي الآلية وراء هذه الاستجابة إيمونومودولاتوري لاستكشاف نظراً إلى القيد لأخذ العينات في التجارب البشرية حديثي الولادة (أي توجه الدم متسلسلة وخزعات). نماذج الماوس حديثي الولادة يمكن أن تساعد دراسة إليه العمل المشاركة في التنظيم المناعي حديثي الولادة المرتبطة باستخدام الكائنات الحية المجهرية، والتغييرات في الحجمية المعوية. لسوء الحظ، معظم نماذج الماوس البروبيوتيك ركزت إلى حد كبير على الفئران الكبار؛ بيد أن تأثير البروبيوتيك يرجح أن تكون أعلى في بداية الحياة، مما يوحي بنماذج محددة لهذه الفئة العمرية سوف تكون مفيدة^3،6. وبالإضافة إلى ذلك، نماذج الماوس حديثي الولادة أكثر ملاءمة لدراسة الأمراض والتدخلات الموجهة للتطبيق في الحياة المبكرة للرضع البشرية كما أنها من المتوقع أن تحاكي أوثق تطوير نظام المناعة والميكروبات^{7،8 ،،}من⁹¹⁰. وكان الهدف لدراسة مدى وأنماط الكائنات الحية المجهرية الاستعمار للفئران حديثي الولادة مع تركيز على ميكانيكية التفاعل بين البلد المضيف وأن ميكروبيومي. لم يتم العثور على وصف مناسب لنماذج الوليد في الأدب، وهكذا كان تناول حاجة إلى تطوير أسلوب قوي وموحد.

الأساليب المتبعة للإدارة عن طريق الفم من المركبات المختلفة للفئران حديثي الولادة تشمل نقل المركبات المطلوبة عن طريق حليب الأم بعلاج مصدر المياه للسدود الحوامل¹¹ أو باستخدام الإبر التغذية لتسهيل إدارة المطلوب من المركبات إلى البلعوم¹². هذه الأساليب مفيدة للتجارب التي لا تحتوي على متطلبات دقة الجرعة وحيث سهولة بلعها العلاج عن طريق الماوس المتلقية. وكثيراً ما تدار البروبيوتيك بالاقتران مع بربيوتيك مثل جالاكتوليجوساكتشاريدي وفروكتوليجوساكتشاريدي (المنحدر) التي تكون بمثابة مصدر للتغذية للبكتيريا بروبيوتيك؛ هذه المركبات المضافة تجعل الحل لزج وتحديا لإدارة عبر المنهجيات المشار إليها أعلاه. وضع أسلوب لإدارة كميات محددة من البروبيوتيك والبريبايوتكس للفئران حديثي الولادة ابتداء من أقرب وقت ضروري اليوم الأول من الحياة (DOL). عملية تطوير تقنية تزقيمية مدتها، إمكانية انتشار الاستعمار (كما لوحظ في دراسات أخرى الكائنات الحية المجهرية بين المعالجة ومراقبة الأسلحة^13،14،،من¹⁵¹⁶) وقد تم اختبار والوفرة النسبية للمستعمر بلنتروم ملبنة (ليرة لبنانية) في أمعاء الجراء مع تزقيمية مختلف الجداول الزمنية المقررة. إعداد الكائنات الحية المجهرية المستخدمة في التجارب التي تتألف من الوحدات المكونة للمستعمرة⁹ 10 (زيمبابوي) كل تزقيمية ليرة لبنانية (سلالة ATCC 202195)، مختلطة مع المنحدر (بربيوتيك) و maltodextrin (السواغ) كما هو موضح في المحاكمة البشرية الأخيرة³. وأنجز تسليم الكائنات الحية المجهرية باستخدام IE تزقيمية مدتها والعملية مفصلة في البروتوكول أدناه. تم تقييم الشخصية الاستعمار للكائنات الحية المجهرية استخدام الوقت الحقيقي تضخيم الحمض النووي المستخرج من الأمعاء كلها استخدام الإشعال ليرة لبنانية محددة.

Protocol

وأجريت جميع الإجراءات المتصلة بالمبادئ التوجيهية التي وضعتها موظفي الدعم في "منشأة رعاية الحيوان" في جامعة كولومبيا البريطانية ووافق جميع الإجراءات لجنة رعاية الحيوان UBC.

1. تحديد مقدار البروبيوتيك التي تديرها

ملاحظة: يوصي بهذه الخطوة لتحديد المبلغ الدقيق للكائنات الحية المجهرية زيمبابوي التي يمكن أن تدار في جرعة واحدة. كمية البروبيوتيك ومركبة (المنحدر و maltodextrin) تحدد الشروط التشبع بالحل. من الخبرة، يمكن أن تدار لا يزيد عن 30 ميليلتر (~ 20 مل للكيلو) من السوائل للفئران في دول 2 كأي وحدة تخزين أكبر يزيد من مخاطر الاستنشاق.

1. إعداد ست أنابيب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل لتخفيف المسلسل مع كل أنبوبة تحتوي على 180 ميليلتر من الدكستروز 5% عقيمة المالحة.
2. تزن قاسمة 0.2 غ من خليط الكائنات الحية المجهرية بربيوتيك وتذوب في 1 مل من المحلول الملحي الدكستروز 5% بطريقة عقيمة.
3. دوامة لمدة 30 ثانية وماصة لكسر كتل. كرر حتى تحترم لا كتل مرئية.
   ملاحظة: Maltodextrin يجعل الحل لزج وتسهم في حل التشبع.
4. أداء تسلسلي إضعاف استخدام أنابيب إعدادها في الخطوة 1، 1. دوامة المزيج.
5. لوحة ميليلتر 40 لكل تمييع على رباعي، المسمى لوحة السيدة أجار. لوحة كل تمييع في مكررة.
6. احتضان تحت اللاهوائية (أو ميكروايروفيليك) الشروط في 37 درجة مئوية ح 48 في جرة فراغ باستخدام حزمة غاز.
7. عد كل لوحة داخل مجموعة من المستعمرات 20-70 كل رباعي. التهم بإضعاف نفس لوحة متوسط وحساب العودة إلى الوحدات المطلوبة.

2-إعداد البروبيوتيك والبريبايوتكس تزقيمية

ملاحظة: حل سليم للكائنات الحية المجهرية وبربيوتيك ضروري لضمان سلاسة حقن السائل من خلال إبرة التغذية خلال تزقيمية مدتها.

1. الجمع بين المبلغ المطلوب للكائن بروبيوتيك المجففة بالتبريد مع المبالغ المطلوب البريبايوتكس ومركبة في أنبوب ميكروسينتريفوجي عقيمة.
2. إضافة الكميات المناسبة من المذيبات (5% سكر العنب المالحة) لإذابة الخليط بروبيوتيك بربيوتيك.
   ملاحظة: هو قدرة انحلال المركبات المستخدمة والمحدودة بربيوتيك. من التجربة، بلغ مجموعة سينبيوتيك (مع المنحدر و maltodextrin) التشبع في حوالي 0.3 غ/مل بينما حل في أنبوب ميكروسينتريفوجي 2 مل باستخدام 1 مل مذيب.
3. دوامة لخلط حتى يتم حل جميع المواد الصلبة. استخدام بيبيت لتفريق كريات الجزيئات الصلبة في المذيب من بيبيتينج صعودا وهبوطاً.
4. احتضان الحل في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
   ملاحظة: يمكن تخطي هذه الخطوة إذا تم إنشاء الحل بروبيوتيك بربيوتيك من ثقافة حية.
5. لوحة سلسلة خمسة إضعاف الوقت على السيدة أجار لوحات قبل تزقيمية لدقة القياس الكمي الكائنات الحية المجهرية التي تديرها ألجرو. يمكن تخطي هذه الخطوة إذا كان العد زيمبابوي دقيقة غير مطلوبة.

3-التحضير للسلامة الأحيائية مجلس الوزراء

1. استخدام خزانة السلامة عند العمل مع البروبيوتيك للحفاظ على الأسلوب العقيم. تعيين القفص مع السدود والجراء على بطانية تدفئة (مجموعة إلى حوالي 38 درجة مئوية) على أحد نصف بطانية. ضع قفص حيوانات نظيفة وفارغة في النصف الآخر من بطانية التدفئة.
2. مكان تطهير أو تعقيم، لوح ماصة على بطانية تدفئة تميل إلى الماوس أثناء تزقيمية مدتها.
3. جمع مواد التعشيش الجراء من أعلى العش الموجودة، وإنشاء السدود وإنشاء كأس تداخل مخروطية جديدة باستخدام الأيدي القفاز، المجففة وتطهيرها باستخدام الإيثانول 70%. مكان هذا العش الجديد في قفص عقد نظيفة وفارغة. وهذا يسهل نقل رائحة العش إلى أيدي القفاز ومما يقلل من إدخال الروائح الأخرى على ألجرو أثناء معالجتها لهذا الإجراء، الحد من مخاطر الإبدال.
4. الانتقال الجراء إلى العش المخروطي عقد قفص وإزالة القفص مع السد من مجلس الوزراء. وهذا يقلل الإجهاد للسد بمنعه من الاستماع الجراء أثناء الإجراء.
   ملاحظة: إذا كانت الكائنات الحية المجهرية مستعمر معروفة من الأمعاء مورين، شروط المعاملة يجب أن تكون مفصولة أقفاص أو السلامة البيولوجية المختلفة حتى خزانات لتجنب إمكانية عبر الاستعمار.

4-داخل المريء تزقيمية الولدان بالماوس

1. فتح العبوة حقنه ليسهل الوصول إليها. فتح تعبئة الإبرة بطريقة عقيمة وإرفاقه برأس المحاقن. أغسل الإبرة مع الإيثانول 70% والاوتوكلاف قبل الإجراء. استخدام مجموعات مختلفة من الإبر للعلاج ومجموعة المراقبة لتجنب التلوث.
2. رسم قليلاً أكثر من المبلغ المطلوب من حل صبغ الكائنات الحية المجهرية في المحاقن. عقد المحاقن مواجها لأعلى. ثم هدم أخرى ونفض الغبار بأصبع الاتهام إزاحة فقاعات والضغط على المكبس طرد الفقاعات وحجم السائل إضافية حتى يتم الوصول إلى وحدة التخزين المطلوبة. وهذا يضمن أن هناك لا الفضاء الجوي في الإبرة. للماوس DOL 2، يجب إلا يتجاوز حجم تزقيمية مدتها 30 ميليلتر.
3. مكان ألجرو على لوحة ماصة معقمة فوق وسادة التدفئة. استخدام إبرة التغذية (قياس 24, 1 "طول الإبرة، قطر الكرة 1.25 ملم) خارجياً لقياس طول المريء عن طريق وضع كرة الإبرة فقط دون عملية الرهابه (نهاية السفلي من القص). علامة الإبرة على مستوى الآنف ملاحظة الحد الأقصى لإدراج الإبرة (الشكل 1). مراقبة ألجرو لعلامات الصحية، التي تشمل التنفس العادية والتلون الوردي للجلد.
4. تراجع طرف الإبرة في المذيب غمس (المالحة الدكستروز 5%-أو الوسيلة المستخدمة لإذابة الكائنات الحية المجهرية والحيوية مسبقاً) تليين الأسطح الخارجية لابره التغذية. وهذا يسهل دخول سلس من الإبرة إلى المريء الماوس.
5. رفع ألجرو بالقفا أو الضغط برفق الرأس والجسم بين الإبهام والسبابة. ضمان الرأس والرقبة، وتعقد الهيئة في وضع مستقيم. لا تعقد ألجرو بالقفا لفترة أطول من 60 s كما أن هناك يكون خطر انسداد القصبة الهوائية مما يؤدي إلى الاختناق. التأكد من التنفس ألجرو. يمكن أن تتضمن علامات سكروفينج من الصعب جداً عدم القدرة على التنفس ويلهث كبيرة واللسان الموسعة بالفم. رصد لون ألجرو والتنفس أثناء الإجراء بأكمله.
6. إدراج لمبة الإبرة في وسط فم ألجرو بزاوية 45 درجة على الطائرة من الجذع حتى يصل إلى الجزء الخلفي الحلق.
7. تغيير زاوية الإبرة برفق بالتمحور حول لمبة الإبرة ويتحرك الحقن بعيداً عن الشخص جافاجينج (نحو الجانب الظهرية ألجرو) حتى أنها موازية لطائرة العمود الفقري ألجرو. سكروفينج ألجرو يساعد على إبقاء الإبرة في مكان في الجزء الخلفي من الحلق، وأيضا يمنع يرتبكون الماوس. تأكد من لا دفع كرة الإبرة أو أي الضغط على الجزء الخلفي الحلق من خلال تغيير زاوية.
8. إذا كان الماوس يحاول ابتلاع الإبرة، السماح لها بالشريحة إلى الأسفل بطبيعة الحال واعتقال الحركة عند وضع العلامات على الإبرة بمحاذاة مع الآنف. المحاقن والإبر عادة ما تكون ثقيلة بما يكفي للشرائح أسفل الواجبة للجاذبية. وزن الإبرة في جميع الأوقات حتى الإبرة الشرائح بسهولة أسفل المريء مع لا ضغط نزولي من الشخص الذي يقوم تزقيمية مدتها الدعم.
   1. إذا كان يفي الإبرة المقاومة في الجزء الخلفي من الحلق، سحب الإبرة تزقيمية قليلاً لإزاحة الكرة إبرة وإعادة زاوية الإبرة داخل الفم نحو اليسار للماوس (الحق في معالج) ببطء بزيادات صغيرة، 1 ملم. يجب أن تبدأ الإبرة الشرائح بسهولة إلى أسفل المريء.
   2. إذا توقف الإبرة قبل الوسم على إبرة تصل إلى الفم، حقن ليس الحل.
   3. لا تحتفظ إبرة تدخل لأكثر من 20 ثانية. في حالة حدوث ذلك، سحب الإبرة ببطء مع الاحتفاظ حقنه موازية الجذع واسمحوا ألجرو الراحة على منشفة ورقية لمدة 30 ثانية إلى 1 دقيقة جافاجينج حاول مرة أخرى بعد التشحيم السطح الخارجي للابرة مع المذيب.
      ملاحظة: التخدير لا يستخدم الإجراء كاستجابة للماوس ضروري لقياس مدى نجاح تزقيمية مدتها.
9. عندما الوسم على إبرة التغذية فوق الآنف والانحياز مع طرف الآنف، لا تدع الإبرة نقل أو دفع أي زيادة. إدخال وحدة التخزين المطلوبة من السائل ببطء. إذا كان السائل يستنشق أو لاحظت أن الفقاعة عن طريق الآنف، وقف الحقن فورا وسحب الإبرة ببطء.
   1. ضع ألجرو تستقيم على منشفة ورقية على منصة التدفئة للمساعدة على استعادتها. رصد عن كثب لمشاكل التنفس المستمرة أو تغيير اللون من ألجرو الذي يشير إلى الطموح. Euthanize الجراء قد يستنشق فورا.
10. بمجرد اكتمال تزقيمية مدتها، بلطف سحب إبرة التغذية في نفس الزاوية فإنه تم إدراج. ضع ألجرو على منشفة ورقية على لوحة تدفئة حرارة. انتظر 10 ثانية ألجرو لاستعادة النشاط الطبيعي ونمط التنفس. يجب أن تظهر لوناً وردي صحية على الجسم ألجرو والصبغ ينبغي إلا تكون مرئية في المقصورة المعدة. نقله مرة أخرى إلى القفص مع الجراء الأخرى.
    ملاحظة: يتم تلوين الطعام الأزرق جافاجينج طريقة ممتازة لممارسة الإجراء المبين أعلاه. إذا كان تزقيمية مدتها نجاح، ستكون مرئية لوناً أزرق معدّة الماوس. إذا تم العثور على الصبغة الزرقاء خارج معدّة ألجرو (الرقبة أو الصدر أو منطقة الإبطين)، الحيوان ينبغي أن تكون إنسانية euthanized (وفقا لقواعد الرعاية الحيوانية)، كما يشير هذا إلى تمزق المريء أو الطموح.

5-جمع عينات إينتيسشونال لتحليل الاستعمار

1. أثناء الرصد اللاحقة أو جافاجينج، جمع عينات البراز ميكروبيومي من الجراء.
   ملاحظة: ألجرو كثيرا ما يبول ويتبرز عند جافاجيد، ويمكن استخدام هذا الوقت كفرصة لجمع عينات البراز لتحليل ميكروبيومي.
2. لإنهاء التجارب، جمع الأمعاء من العفج إلى المستقيم بعد القتل الرحيم الجراء. دبوس ألجرو إلى لوحة العمليات جراحية وتطهير الجلد مع الإيثانول 70%. قص بعيداً من الجلد إلى أربعة أجزاء دون الأضرار طبقة البريتوني باستخدام أدوات معقمة مع الإيثانول 70% ومن تعقيم حبة ساخنة في 250 درجة مئوية.
3. استخدام مجموعة مختلفة من الأدوات المعقمة لقطع الصفاق إلى أربعة أجزاء ونقله بعيداً عن المركز بطريقة تعرض أجهزة الحشوي.
4. موقع المعدة واستخدام المشبك لقرصة أدناه مصرة البواب وفي نهاية المستقيم. تشغيل طول الأمعاء باستخدام أداة غير حادة أو الملقط لتبسيط الأمعاء وتحريره من النسيج الضام والأنسجة المساريقي العلوي. مرة واحدة وقد تم الإفراج عن طول الأمعاء من النسيج الضام، قطع في نهايات فرضت.
5. مارك رقائق الألومنيوم باتجاه الأمعاء، ويلتف بطريقة آمنة وتجميد في-80 درجة مئوية.
   ملاحظة: هذا الإجراء استخراج الحمض النووي يمكن القيام في هذه المرحلة دون تجميد. الصبغة الزرقاء واعتبر أيضا تمر من خلال الأمعاء أكثر من 24 ساعة وجمع العينات للتحليل الاستعمار أفضل عند الأمعاء جمع 24 ساعة على الأقل بعد تزقيمية الأخير. قد تتضخم إشارات قبل أن تيميبوينت بالبكتيريا غير التقيد عابر يمر الخليط تزقيمية مدتها.

6-استخراج الحمض النووي من الأمعاء لتحليل الاستعمار

ملاحظة: يتم استخراج الحمض النووي باستخدام مجموعة أدوات تجارية مع الاستفادة المثلى من التعديلات التي أدخلت على البروتوكول لاستخراج الحمض النووي الأمعاء. التأكد من تعيين جهاز التدفئة إلى درجة الحرارة المطلوبة والحلول التي تحتاج إلى تعديلات أو الاحترار مسبقاً تعد على نحو ملائم.

1. إعداد المخزن المؤقت تحلل الانزيمية (الصناعيين) على النحو التالي: جعل التوصل إلى حل مع 20 مم تريس Cl، يدتا الصوديوم 2 مم و 1.2% X-100 تريتون. قم بضبط درجة الحموضة إلى 8.0. مباشرة قبل استخدام الصناعيين، إضافة ليسوزيمي بتركيز 20 ملغ/مل نهائي.
2. قبل وزن أنابيب حبة العقيق على التوازن التحليلية مع قبعات إزالتها.
   ملاحظة: يتم ذلك حيث أنه إذا كان الوزن المطلوب هو تجاوز بكثير، من الأسهل لإزالة محتويات الأمعاء.
3. قطع الأمعاء إلى شرائح صغيرة باستخدام مشرط المتاح عقيمة وحلج القطن في الجزء المتعلق بالمطلوب في أنابيب حبة العقيق قبل موزون.
   ملاحظة: تأكد من تغيير المشارط بين كل عينة الحمض النووي في كل مكان، ويمكن أن تؤثر على نتائج PCR.
4. أضف 1 مل الصناعيين مع lysozyme (من الخطوة 6.1) لكل أنبوبة ووضع على الخافق حبة فورتيكسينج وتشغيل في إعداد الحد الأقصى (14) لمدة 5 دقائق.
5. بمجرد تعطل الأنسجة، نقل الأنابيب إلى حمام الماء 37 درجة مئوية واحتضانها لمدة 30 دقيقة.
   ملاحظة: تتم هذه الخطوة تنشيط lysozyme والحث على انهيار peptidoglycan جدار الخلية للبكتيريا إيجابية.
6. إعداد أنابيب مع 20 ميليلتر من "البروتيناز ك" لكل عينة بتركيز 600 ماو كل مل.
7. الطرد المركزي هذه الأنابيب في 400 x ز لمدة 10 دقائق. يجب أن ننظر واضحة مع بعض بقايا الأنسجة على رأس الخرز.
8. نقل 180 ميليلتر من المادة طافية (المرحلة العليا) في أنبوب يحتوي على "ك بروتيناز" ثم قم بإضافة 200 ميليلتر للمخزن المؤقت للأنبوب. دوامة لمدة 15 ثانية لمزيج.
9. وضع أنابيب على كتلة التدفئة في 56 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
10. إضافة 200 ميليلتر من الإيثانول 100% للأنبوب ومزيج من فورتيكسينج لمدة 15 ثانية.
11. إضافة حوالي 600 ميليلتر من ليستي على عمود الدوران (من مجموعة).
12. أجهزة الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في س 8,000 ز. تجاهل التدفق من خلال.
13. كرر الخطوة 6.12 حتى تم وضع جميع من خلال العمود.
14. مكان العمود في أنبوب مجموعة جديدة. إضافة 500 ميليلتر AW1 المخزن المؤقت والطرد المركزي في 8,000 س ز لمدة 1 دقيقة.
15. تجاهل في التدفق من خلال. إضافة 500 ميليلتر AW2 المخزن المؤقت والطرد المركزي في س 8,000 ز لمدة 3 دقائق.
16. التدفق من خلال تجاهل والطرد المركزي العمود في أنبوب مجموعة فارغة في س 8,000 ز لمدة 3 دقائق.
17. نقل العمود إلى أنبوب شطف الحمض النووي. إضافة 60 ميليلتر بكر الصف المياه عالي النقاوة مباشرة على الغشاء واحتضان لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
18. استخدام الماء شطف المعالجون مسبقاً عند 37 درجة مئوية الوت. يمكن أن يتم شطف مرتين باستخدام نصف حجم شطف النهائي وتكرار الخطوة 6.15 مرتين لزيادة الغلة.
19. أجهزة الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في 8,000 س ز الوت الحمض النووي.
20. قياس تركيز الحمض النووي التيد استخدام الأسلوب الكمي المطلوب. غلة عملية الاستخراج في المجموعة من 10-40 نانوغرام/ميليلتر الحمض النووي.
21. تخزين الحمض النووي التيد عند-20 درجة مئوية.

7-قبكر الإعداد

1. شروط بكر
   1. قم بتشغيل الجهاز وتحميل البرنامج في الجدول 1 إلى آلة قبكر في وقت الحقيقي.
   2. تكرار الخطوات من 3 إلى 5 في الجدول 1 لدورات 40 وعقد العينة في 4 درجات مئوية في نهاية رد فعل.
2. الإعداد التجريبية بكر
   1. استخدام أجهزة الإشعال ودرجة الحرارة الموجودة في الجدول 2. استخدام تركيزات ورد فعل الظروف الموجودة في الجدول 3. قم بإعداد كل رد فعل في ثلاث نسخ لمراقبة التغيير الإجرائي.
3. ضع رد فعل PCR الأنابيب/اللوحة في النظام قبكر وتشغيل البرنامج تحميله في النظام من الخطوة 7، 1.
4. إزالة الأنبوب في نهاية الشوط، ووضعه على 4 درجة مئوية والتحضير لجل تحميل.

8-التحديد الكمي لاستعمار ليرة لبنانية

1. إعداد يمزج qPCR ميليلتر 10 أو 20 ميليلتر من ردود الفعل وفقا الجدول 3.
2. LP المجينية الحمض النووي المنحنى المعياري 10⁷ إلى 10¹ نسخة/ميليلتر
   ملاحظة: حيث سوف يكون مطلي 4 ميليلتر من كل تمييع، 10 نسخ⁷ في 4 ميليلتر أو 2.5 × 10⁶ نسخ لكل ميليلتر مطلوب في رصيد بداية. استخدام نفس المبدأ لبقية المنحنى.
   1. إعداد إضعاف 1:4:10⁷ نسخ لكل ميليلتر في 50 ميليلتر.
      ميليلتر 3.147 لبدنا + ميليلتر 46.85 dH₂س = 2.5 × 10⁶ نسخ لكل ميليلتر
   2. متسلسل تمييع 10 إضعاف: إضافة 5 ميليلتر إلى 45 ميليلتر dH₂س ل 1.25 × 10⁵ نسخة/ميليلتر.
   3. لوحة 4 ميليلتر لتمييع كل بئر.
3. تصور أمبليكونس ليرة لبنانية
   1. استخدام هلام [اغروس] 2% لتصل إلى فصل واضح ~ 197 bp الجزء تضخيم ليرة لبنانية.
   2. تحميل 9 ميليلتر لكل منتج PCR في الهلام.
   3. تشغيل الهلام لمدة 30 دقيقة في 120 الخامس.

النتائج

تقع على الطابع الفريد لهذا الأسلوب في تكيفها مع تقنية جافاجينج لحجم وهشاشة ماوس الولدان. المقطع السابق وصف الخطوات الهامة في الاضطلاع بإجراء تزقيمية ناجحة على ماوس 2 دول. وضع جدول لتقدير جيد، تم إنشاء منحنى قياسي باستخدام "الحمض النووي ليرة لبنانية" خالصة مع ثلاثة replicates التقنية (الشكل 2). قدمت المنحنى القياسي مجموعة ديناميكية من الكشف عن "الحمض النووي ليرة لبنانية" في كبسولة تفجير باستخدام. وكان النطاق الديناميكي بين 7 و 28 دورات فيها مجموعة من 10 تم الكشف عن¹ إلى 10⁷ نسخ الحمض النووي "ليرة لبنانية". ميل المنحنى القياسي مطرد تمثل كفاءة وقابلية لرد فعل.

قد استخدمت إجراءات تزقيمية IE في الفئران الكبار بسهولة نسبية. ومع ذلك، الجهاز الهضمي العلوي بالماوس الولدان هشة والمطلوب تحركات معايرة تزقيمية مدتها إبرة أثناء الإجراء. جافاجيس المتكررة يمكن أن تزيد من فرص تهيج داخل المريء أو الإصابة والفشل أو الرفض بالسد بسبب التعامل. وهكذا، تم اختبار جدولين جافاجينج مختلفة واستعمار الأمعاء كان كمياً باستخدام الحمض النووي من هوموجيناتيس الأمعاء كاملة. وكانت الفئران جافاجيد من دول 2 إلى 8 دول بالكائنات الحية المجهرية التي تديرها كل يوم أو كل يومين (الشكل 3). كل عينة الوارد تكرار التقنية واحدة وكل شرط replicates البيولوجي اثنين على الأقل. الجراء جافاجيد كل يوم مع جرعة 7 كان حوالي 10³ نسخ من ليرة لبنانية بينما الجراء جافاجيد كل يومين مع جرعات 4 كان حوالي 10⁵ نسخ. اتساق النتائج بين replicates إضافة رصيد إلى الدقة للأسلوب. وكان هناك المزيد ليرة لبنانية اكتشاف في أمعاء الجراء جافاجيد كل يومين بالمقارنة مع الجراء التي كانت جافاجيد كل يوم. ونظرا لهذا، التجارب اللاحقة أقيمت مع تزقيمية جدول كل يوم كما أنه يقلل أيضا من الضغط الجراء.

من المهم تجنب القمامة داخل الكائنات الحية المجهرية عبر التلوث عند العمل مع البروبيوتيك. ويتوقع ميكروبيومي ليتيرماتيس أن مماثلة كما أنها تشترك في نفس الأم وتداخل البيئة. وهذا يثبت مشكلة بالنسبة للدراسات بروبيوتيك لو لم تكن موجودة داخل القمامة نفس ظروف العلاج ومراقبة الكائن الكائنات الحية المجهرية لديه القدرة على أن تصبح جزءا من الحجمية ("الاستعمار نشر'). لتحديد إذا كان الكائنات الحية المجهرية سوف تلوث واستعمار ليتيرماتيس غير المعالجة، كان نصف القمامة جافاجيد أعلاه وجمعت الأمعاء ل qPCR. وأظهر تحليل qPCR المعوية من الفئران 10 دول التضخيم المتوقع من "الحمض النووي ليرة لبنانية" في الفئران جافاجيد ولكن أيضا، بدرجة أقل في ليتيرماتيس غير جافاجيد (الشكل 4). أظهرت أمعاء الفئران دول نفسه من قفص دون علاج لا التضخيم أو التضخيم الحد الأدنى في دورات أكبر من 32. وهذا دليلاً للتقاسم الطائفي ميكروبيومي داخل القمامة في قفص. وهكذا، لتجارب مع البروبيوتيك المجموعات المعاملة يجب أن تكون مفصولة أقفاص لعنصر التحكم للتقلبات المناخية من خلال الصليب التلوث. يمكن اعتبار استخدام السدود الحاضنة إذا كانت تجربة إعداد إطار إعداد القمامة، ولكن آثار الخلط مثل تضاؤل الرعاية من السد الحاضنة والرفض ينبغي تقييمها والأمثل ل. عند الفئران جافاجيد حتى 8 دول وتركت دون علاج لمدة ستة أيام وكان تحليل الحمض النووي المعوية في 14 دول، تم العثور على حوالي 10 نسخ من ليرة لبنانية (الشكل 5). وهكذا، تم العثور على استعمار ليرة لبنانية أن تكون عابرة وتناقص السكان يمكن اكتشافها على مر الزمن.

الشكل 1 . قياس طول بين عملية الرهابه (نهاية القص السفلي) والأنف جعل الحد الأقصى الإدراج مناسبة للابرة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 2 . المنحنى المعياري المنشأة باستخدام كبسولة تفجير ليرة لبنانية و ATCC ليرة لبنانية الحمض النووي- مسلسل إضعاف "الحمض النووي ATCC ليرة لبنانية" صدر بإنشاء مجموعة ديناميكية قابلة للكشف للإشعال المستخدمة في الدراسة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 3 . LP تضخيم الحمض النووي المعوية من الجراء 10 دول تعامل بين دول 2 و 8 دول في جافاجيس المجدولة يوميا (7 جرعات) وكل يوم (4 جرعات). جافاجينج كل يوم أظهر LP المعوية أعلى بالمقارنة مع جافاجينج كل يوم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 4 . علاج LP تضخيم الحمض النووي المعوية من 10 دول الجراء مع 2 2 وغير المعالجة في القمامة من الجراء 4. كان تزقيمية مدتها بين دول 2 و 8 دول في جافاجيس المجدولة يوميا (7 جرعات). بروبيوتيك اثنين تعامل الجراء إظهار الشخصية التضخيم المتوقع. إظهار الجراء غير المعالجة التضخيم متغير لليرة لبنانية تشير إلى تقاسم الطائفي في الحي بروبيوتيك داخل القمامة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 5 . LP تضخيم الحمض النووي المعوية من 14 دول الجراء تعامل بين دول 2 و 8 دول في جافاجيس المجدولة يوميا (7 جرعات) وكل يوم (4 جرعات). قطرات تحميل ليرة لبنانية أدناه تشير إلى تطهير دورة 28 ليرة لبنانية على مدى 6 أيام بعد آخر بروبيوتيك تزقيمية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الخطوة	درجة الحرارة	الوقت
1	50 درجة مئوية	2 دقيقة
2	95 درجة مئوية	3 دقائق
3	95 درجة مئوية	30 ثانية
4	58 درجة مئوية	30 ثانية
5	72 درجة مئوية	30 ثانية

الجدول 1-ظروف التضخيم qPCR. درجة الحرارة وعدد من شروط دورة لتفاعل PCR.

الهدف	منطقة فاصلة إينتيرجينيك 16S-23S
حجم جزء المتوقعة	144 bp
Tm التمهيدي	58˚C
التمهيدي إلى الأمام (FP)	Lpn-1: المنسوجات والملابس تج TCC لجنة التنسيق الإدارية TTT كبار المستشارين التقنيين AGG صرفة
عكس التمهيدي (RP)	Lpn-2: القط TTT وظفته TGT TCT تأت جا AAA ATA

الجدول 2. تفاصيل المكونات لرد فعل qPCR. التفاصيل في كبسولة تفجير، انلينغ درجة الحرارة، وحجم جزء المتوقعة في تفاعل PCR.

	تركيز	رد فعل 10 ميليلتر	رد 20 ميليلتر
قالب الحمض النووي	200 جزء من الغرام/ميليلتر	1 ميليلتر	1 ميليلتر
سيبر ماستر ميكس	-	5 ميليلتر	10 ميليلتر
تنظيم الأسرة	10 ميكرومتر	ميليلتر 0.3	ميليلتر 0.6
البرنامج العادي	10 ميكرومتر	ميليلتر 0.3	ميليلتر 0.6
dH2س	-	3.4 ميليلتر	ميليلتر 8.8

الجدول 3. كل رد فعل كميات وتركيزات. تركز الكواشف ووحدات التخزين لردود الفعل.

Discussion

ووضعت إجراءات تزقيمية IE بإدارة جرعة محددة من الكائنات الحية المجهرية الفئران حديثي الولادة بأمان. يتم تسليم كميات صغيرة من السائل إلى الجهاز الهضمي العلوي باستخدام إبرة تغذية لمنع تطلع مع ضمان إيصال الجرعة في الثقة. جمعت أمعاء الفئران لاستعمار تحليل اثنين وستة أيام بعد تزقيمية مدتها. تعديل الإجراءات المتعلقة باستخراج الحمض النووي لضمان عالية الغلة في الحي إيجابية الكائنات الحية المجهرية. قبكر تحليل الحمض النووي المستخرج يومين بعد آخر تزقيمية أظهرت أعلى نسبيا استعمار ليرة لبنانية في الفئران جافاجيد كل يومين بالمقارنة مع الفئران جافاجيد كل يوم بين دول 2-8. كان هناك أيضا انخفاضا قدرة ليرة لبنانية على مدى ستة أيام، عرض هذه الكائنات الحية المجهرية أن يكون كائن عابر في أمعاء الفأرة. نتائج هذه التجارب تهيئة الظروف اللازمة لإجراء البحوث مع دقة عالية في هذه الفئة العمرية.

لمراقبة آثار طويلة الأجل من البروبيوتيك في الفئران حديثي الولادة، كانت تدار بالفئران حديثي الولادة في دول 2؛ وقت بدء مماثلة تشير إلى المحاكمة البشرية. المكنسية تغذية الفئران حديثي الولادة هو الموصوفة سابقا في الأدب وقد نفذ إلا بعد^12،DOL 5-8¹⁷ عندما يكون خطر تطلع أقل بسبب ميكانيكا البلع متطورة. تغذية المكنسية غير مناسبة تماما للفئران 2 دول كما لوحظت معدلات أعلى من الطموح في الدراسة التجريبية (البيانات لا تظهر). طبيعة لزج حل بربيوتيك إضافة إلى مخاطر الاستنشاق والكائنات الحية المجهرية. اتباع الإجراء جافاجينج IE إلى أدنى حد خطر تطلع في الفئران DOL 2 بينما كان يلقي وحدة التخزين المطلوبة مباشرة إلى الجهاز الهضمي العلوي. وكان أولاً التحقق من صحة نجاح الإجراء استخدام تلوين الطعام غرست تزقيمية الكائنات الحية المجهرية. تلوين الطعام بمثابة علامة مرئية من خلال جلد ألجرو. أي آثار سلبية قد لوحظت في الفئران جافاجيد مع تلوين الطعام، ومن المستحسن للتحقق من صحة الإجراء جافاجينج بهذه الطريقة قبل بدء التجارب على نطاق واسع. يمكن استخدام القرار السريع من تزقيمية وظيفة المشاهدة منعكس تجمع أيضا كمؤشر إضافي تزقيمية ناجحة. حالما يتم وضع الماوس على بطانية تدفئة تزقيمية مدتها بعد، سوف تهدأ المعاكسة تجمع وسوف يلاحظ زيادة في وتيرة التنفس خلال 20 ثانية. استمرار المعاكسة تجمع لمدة أطول من 30 ثانية يشير إلى تزقيمية فاشلة. تزقيمية النجاح يعتمد أيضا على إدخال إبرة التغذية المناسبة مع لمبة يجلس الحق فوق فتح المصرة القلب المعدة. يمكن أن يتيسر ذلك بضمان أن الوسم على إبرة قياس طول بين عملية الرهابه وطرف الآنف، عدم تجاوز الآنف الماوس أثناء تزقيمية مدتها. وهذا يقلل من فرصة الإصابة بالماوس. تواتر تزقيمية يمكن أن يكون لها تأثير كبير على النتائج التجريبية. جافاجينج المتكررة كما يمكن إنشاء مزيد من الضغط الجراء والأم بسبب اضطراب مستمر من القفص والعش. جدول تزقيمية المثلى عند أقل تواترا جافاجيس وخلال مدة أقصر من الوقت دون أن تفقد الأثر المتوقع في النظام. لضمان سلامة والعقم من الإجراء تزقيمية يجب تعقيم إبرة الغسيل والتعقيم الفترات الفاصلة بين استخدام. الغسيل صرامة على استخدام خارج فرك والداخل عن طريق إجبار المياه عن طريق الإبرة باستخدام حقنه قبل التعقيم ضروري كأي جزيئات بقايا يمكن انكروست على الإبرة أثناء التعقيم، ويمكن أن تتداخل مع الإجراء جافاجينج.

لوحظ أعلى LP الاستعمار في الجراء التي كانت جافاجيد مرة كل يوم بالمقارنة مع الجراء جافاجيد كل يوم. يمكن أن يكون هذا بسبب انخفاض الضغط على الجراء جافاجيد كل يوم، ويحتمل أن بروبيوتيك الحصول على المزيد من المواد الغذائية عن طريق بلعها من هذه الجراء الحليب أكثر نسبيا. التبعية جرعة من العلاج بروبيوتيك قد درست سابقا في الماوس نماذج^18،19 وهكذا المهم إدارة الجرعة الصحيحة. هو مطلي الحل بروبيوتيك أعدت قبل كل تزقيمية للحصول على حصيلة دقيقة لزيمبابوى التي تديرها. إذا كان الكائن الحي بروبيوتيك اللاهوائية، من المهم لمعرفة ما إذا كان هناك فرق في زيمبابوي عند مثقف هوائيا أو لاهوائيا. ولما ليرة لبنانية أهوائي اختياري، هو مثقف باستخدام كلا الأسلوبين وكان يلاحظ أي اختلاف في زيمبابوي.

تم القيام بتحليل تحميل ليرة لبنانية المعوية وظيفة تزقيمية استخدام عينات الحمض النووي قبكر وعالية الجودة. لتقليل التلوث LP الحمض النووي بين العلاج ومجموعات المراقبة، مختلفة تغذية الإبر، خزانات السلامة البيولوجية والمعدات الجراحية واستخدمت لضمان أعلى جودة العينات. القياس الدقيق للكائنات الحية المجهرية في الأمعاء تتطلب طريقة استخراج الحمض النووي أمثل. الأساليب الأكثر كفاءة لاستخراج الحمض النووي من البراز ينطوي على عدة حبة ضرب الخطوات^20،،من²¹²². هذا الأسلوب اعتمد لاستخراج البكتيريا المعوية باستخدام الضرب حبة ولاحظ تقلص التمثيل (< 10 نسخ² المستردة) لليرة لبنانية في استخراج الحمض النووي كله الأمعاء. كما ليرة لبنانية كائن إيجابية غرام مع كمية كبيرة من peptidoglycan في جدار الخلية، كان تحسين البروتوكول مع خطوة حل بيبتيدوجليكان باستخدام ليسوزيمي^23،24 إضافة إلى المخزن المؤقت تحلل الانزيمية. وهذا زاد تمثيل ليرة لبنانية في نفس العينة المعوية بأكبر من شقين. ويضمن معاملة lysozyme انحلال الطبقة الخارجية بينما حبة ضرب خطوة يسهل تحلل الكائن الحي. الأمثل لكمية من الأنسجة، نوع حبة العقيق وفترة انقطاع استخدام الخرز ضروري للحصول على منتجات الحمض النووي المثلى لإجراء تحليل PCR.

يدل على الأثر الإيجابي البروبيوتيك تدار كالوقاية أو العلاج في الولدان قبل الأجل والأجل في الدراسات الأخيرة^25،26،،من²⁷²⁸. هناك ما يبرر إنشاء نموذج الفأر الوليد السليم البروبيوتيك فك تأثير وقائي من البروبيوتيك. يمثل هذا البروتوكول المبينة هنا دليل للباحثين غير مألوف مع عمل الماوس الولدان استخدام البروبيوتيك. على الرغم من المشكلات التي تحدث مع الحجمية القوارض أثناء الدراسة صحة الإنسان والمرض، ويمكن تمديد هذا الأسلوب للبحوث التي تركز على فهم التغييرات التي حدثت ميكروبيومي بسبب البروبيوتيك. هذا النموذج أيضا منبرا لدراسة التفاعل الميكروبات والمضيف والاستجابات المناعية على مدى مراحل إنمائية مختلفة.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL tuberculin syringe with slip tip	BD	309659
1.2% Triton X-100	Millipore-Sigma	X100-100ML
2 mM sodium EDTA	Thermo Fisher Scientific	15575020
20 mM Tris·Cl	Thermo Fisher Scientific	15568025
5% dextrose and 0.9% NaCl injection solution	Baxter Corp.	JB1064
Alphaimager	Alpha Innotech	N/A	Gel imaging system
Anaerobic jar	Millipore-Sigma	28029-1EA-F	2.5 L
BD GasPak EZ anaerobe container system sachets	BD	260678
BD Difco Lactobacilli MRS Broth	BD	288130
Disruptor Genie	Scientific Industries Inc.	SI-D236
Feeding/oral gavage needles for newborn mice and rats	Cadence Science Inc.	01-290-1	24 Gauge, 1” needle length, 1.25 mm ball diameter
Fructooligosaccharides	Millipore-Sigma	F8052	from chicory
Garnet bead tubes 0.70 mm	Qiagen	13123-50
iTaq Universal SYBR Green Supermix	BioRad	172-5120
Lactobacillus plantarum (Orla-Jensen) Bergey et al.	ATCC	BAA-793	for qPCR standard curve
Lyophilized probiotic bacteria	N/A	N/A
Lysozyme	Thermo Fisher Scientific	89833
Maltodextrin	Millipore-Sigma	419672	dextrose equivalent 4.0-7.0
Mini-Sub Cell GT Cell	BioRad	1704406	Gel chamber
Nanodrop 1000	Thermo Fisher Scientific	N/A
QIAamp Blood and Tissue kit	Qiagen	51504
StepOnePlus Real-Time PCR System	Thermo Fisher Scientific	4376600
UltraPure Agarose	Invitrogen	16500-500
Ultrapure dH2O	Invitrogen	10977023