نموذج زراعة الأنسجة فيفو السابقين لمضاعفات فيبروفاسكولار في اعتلال الشبكية السكري التكاثري

Summary

نقدم هنا، بروتوكولا لدراسة الفسيولوجيا المرضية لاعتلال الشبكية السكري التكاثري باستخدام الأنسجة المستمدة من المريض، واقتطعت جراحيا، فيبروفاسكولار للنسيج الأصلي ثلاثية الأبعاد توصيف والسابقين فيفو ثقافة. هذا السابقين فيفو ثقافة النموذجي أيضا قابلة للاختبار أو تطوير علاجات جديدة.

Abstract

اعتلال الشبكية السكري (DR) مضاعفات microvascular الأكثر شيوعاً من داء السكري وواحدة من أبرز أسباب العمى في البالغين سن العمل. لا توجد نماذج حيوانية الحالية من مرض السكري واعتلال الشبكية الناجم عن الأكسجين وضع التغييرات التدريجية الكاملة تتجلى في اعتلال الشبكية السكري التكاثري البشري (PDR). ولذلك، اعتمدت فهم منشأ المرض والفيزيولوجيا المرضية إلى حد كبير على استخدام مقاطع نسيجية وعينات الزجاجي في النهج التي لا تقدم سوى معلومات الحالة المستقرة على العوامل المسببة للأمراض المشتركة. تزايد الأدلة يشير إلى أن دينامية خلية-خلية وتفاعلات المصفوفة خارج الخلية الخلية (ECM) في السياق ميكرونفيرونمينتس ثلاثية الأبعاد (3D) ضرورية للدراسات الميكانيكية والفنية نحو تطوير جديدة استراتيجيات العلاج. ولذلك، افترضنا أنه يمكن الاستفادة من الأنسجة فيبروفاسكولار المرضية جراحيا اقتطعت من العيون مع الديمقراطية الشعبية موثوق كشف الآليات الخلوية والجزيئية لهذا المرض المدمر واختبار إمكانات الرواية السريرية التدخلات. تحقيقا لهذه الغاية، قمنا بتطوير طريقة جديدة ل 3D السابقين فيفو ثقافة اقتطعت جراحيا المستمدة من المريض فيبروفاسكولار الأنسجة (قدم)، التي ستكون بمثابة نموذج ذات صلة البشرية الديمقراطية الشعبية الفيزيولوجيا المرضية. FTs تشريح في اكسبلانتس وجزءاً لا يتجزأ من مصفوفة فيبرينوجين للسابقين فيفو توصيف الثقافة و 3D. يسمح الفلورة الجامع-جبل FTs الأصلية والثقافات نقطة النهاية تحقيقا دقيقا في تكوين الأنسجة وعمليات متعددة الخلايا، وتسليط الضوء على أهمية توصيف مستوى الأنسجة ثلاثية الأبعاد للكشف عن ميزات ذات الصلة الديمقراطية الشعبية الفيزيولوجيا المرضية. سيسمح هذا النموذج المتزامن تقييم الآليات الجزيئية والخلوية/الأنسجة العمليات وعلاج الاستجابات في سياق معقدة من التفاعلات البيوكيميائية والفيزيائية الحيوية داخل هندسة الأنسجة الديمقراطية الشعبية والمكرويه. حيث يلخص هذا النموذج الديمقراطية الشعبية الفيزيولوجيا المرضية، سيكون أيضا قابلة للاختبار أو تطوير علاجات جديدة.

Introduction

الدكتور هو مضاعفات مرض السكري، مرض الذي وصل إلى أبعاد هائلة في العقود الثلاثة الماضية¹العين خطيرة. بعد عشرين عاماً على التشخيص، وتقريبا كل مريض بداء السكري من النوع 1 و 60% من المرضى بالنوع 2 من داء السكري علامات هذا اعتلال الشبكية، مما يجعل مرض السكري في حد ذاته واحداً من أبرز الأسباب للعمى في العمل البالغين سن². وفقا لمستوى انحطاط ميكروفاسكولار والأضرار الدماغية، يصنف الدكتور إلى الدكتور غير التكاثري (غير الديمقراطية)، والدكتور التكاثري (PDR). نهاية مرحلة المرض، الديمقراطية، يتسم بالناجم عن الاسكيمية، والتهاب نيوفاسكولاريزيشن والردود تليفية في واجهة زجاجي شبكي. في ظروف غير المعالجة، وسوف تؤدي هذه العمليات إلى العمى بسبب نزف الزجاجي وتليف الشبكية وانفصال الشبكية تراكشونال ونيوفاسكولار الزرق^3،4. وعلى الرغم من التقدم الذي أحرز مؤخرا، تستهدف خيارات العلاج الحالي سوى الدكتور المراحل، بما في ذلك السكري وذمة بقعيه والديمقراطية الشعبية، عند تلف الشبكية وقد تبع ذلك الفعل. وعلاوة على ذلك، أن نسبة كبيرة من مرضى الدكتور لا تستفيد من عتاد العلاج الحالي، تشير إلى حاجة ملحة لتحسين العلاجات^4،،من⁵⁶.

متعددة أخرى أنافيفو ن المرض/الإنمائية نماذج ونماذج حيوانية السكري قد وضعت حتى الآن، ولكن أيا منها لا يجمل النطاق الكامل لميزات باثولوجي في^7،الديمقراطية الشعبية البشرية⁸. وعلاوة على ذلك، أدلة متزايدة تشير إلى أن الاستجابات العلاج ترتبط محكم لتشكيل إدارة المحتوى في المؤسسة، وكذلك الترتيب المكاني والتفاعل بين المكروية الخلوية واللاخلوي⁹. ونحن لذلك وضعت لتطوير نموذج ذات صلة سريرياً للديمقراطية الشعبية البشرية عن طريق استخدام المواد المرضية FT التي هي عادة اقتطعت من عيون تمر الاستئصال الكلي الزجاجية كجزء من إدارة العمليات الجراحية للديمقراطية الشعبية¹⁰.

يصف هذه المخطوطة البروتوكول ل 3D السابقين فيفو ثقافة وتوصيف جراحيا-اقتطعت، الديمقراطية الشعبية المريض-المستمدة FT المرضية. وقد استخدمت الأسلوب الموصوفة هنا في منشور صدر مؤخرا أثبتت نجاح تفكيك الديمقراطية الشعبية 3D الأصلية الأنسجة المناظر الطبيعية، وخلاصة من سمات الديمقراطية الشعبية الفيزيولوجيا المرضية بما في ذلك الأوعية وردود تليفية غير طبيعي ¹¹من هياكل الأوعية الدموية. وكشف هذا النموذج أيضا تقتصر رواية من الميزات التي لا يمكن بسهولة تقدير من أقسام نسيجية رقيقة، مثل مكانياً المبرمج والانتشار، فضلا عن تشكيل الأوعية الدموية جزيرة¹¹. السائل الزجاجي وقد استخدمت بنجاح من قبل الآخرين على الثقافات كروي غشائي ثلاثية الأبعاد لتقييم به الأوعية المحتملة ونجاعة أنجيوستاتيك جزيئات¹². عندما يتم دمجها مع في المختبر 3D غشائي اللمفاوية خلية (LEC) كروي تنتشر المقايسة تستخدم الديمقراطية الشعبية زجاجي كمنشط، نموذجنا كشف عوامل مساهمة كلا فيتريل القابلة للذوبان العظة كذلك المحلية داخل الأنسجة نيوفاسكولار إلى حتى الآن غير مفهومة LEC المشاركة في الديمقراطية الشعبية الفيزيولوجيا المرضية^3،11. جراحة زجاجي شبكي في إدارة الديمقراطية الشعبية، إجراء المؤداة بعد التحدي بشكل روتيني. كما هي رؤية الأدوات الجراحية وأساليب النهوض المستمر والتطور، إزالة عينة التكاثري فيبروفاسكولار في الوقت المناسب والمحافظة ليس فقط بتحسين نتائج الرؤية ولكن أيضا يوفر مواد النسيج لا تقدر بثمن تحقيق الديمقراطية الشعبية استجابات الفيزيولوجيا المرضية والعلاج في الجوانب المعقدة متعدية الجنسيات المكروية أنسجة بشرية حية.

Protocol

وأقر هذا البحث "المؤسسي استعراض المجلس" واللجنة الأخلاقية في مستشفى جامعة هلسنكي. تم الحصول على الموافقة المستنيرة الموقعة من كل مريض.

1-إعداد الحلول ووسائل الإعلام والمعدات

1. إعداد المعدات التالية قبل جمع الأنسجة فيبروفاسكولار (قدم) لضمان المعالجة السريعة.
   1. ملاقط ميكروديسيكشن معقم اﻷوتوكﻻف اثنين.
   2. تحضير 1 × مخزنة الفوسفات المالحة (PBS) بإذابة قرص برنامج تلفزيوني 1 وزنه قبل (0.14 م NaCl، 0.0027 م بوكل، 0.010 م ص. ب₄^-3) في 900 مل من المياه وآثاره حل. ضبط حجم المياه يصل إلى 1 لتر ومعقم اﻷوتوكﻻف حل جاهز. مخزن في الرايت
   3. جمع الحل المذكور أعلاه والمعدات في سلة، جنبا إلى جنب مع مشرط معقمة تستخدم مرة واحدة وطبق ثقافة عقيمة 6-سم خلية وخمس لوحات الثقافة العقيمة جيدا 12 خلية.
2. إعداد 6 مغ/مل الحل الفيبرينوجين في هانكس متوازن الملح الحل (حبس) بإذابة 30 ملغ الفيبرينوجين البشري المستنفد البلاسمينوجين إلى 5 مل حبس، استخدام أنبوب 50 مل منغمسين في حمام مائي عند 37 درجة مئوية، على الأقل ح 1.
   ملاحظة: هذا الحل يمكن أن يوضع في حمام الماء (37 درجة مئوية) ح 7 (بحد أقصى 10 ح) قبل الاستخدام.
3. إعداد السابقين فيفو الثقافة المتوسطة بإضافة 5% مصل العجل الجنين (FCS) أو مصل الدم البشري 5% والملحق نمو الخلايا البطانية 0.4 في المائة، 10 نانوغرام/مل الماشوب البشري البشرة عامل النمو، 1 ميكروغرام/مل الهيدروكورتيزون ومع الجنتامايسين ميكروغرام/مل 50 إلى المتاحة تجارياً متوسط نمو الخلايا البطانية وتبقى في حوض ماء في 37 درجة مئوية حتى الاستخدام. تخزين في 4 درجات مئوية لتصل إلى شهر.

2-تشريح الأنسجة فيبروفاسكولار

1. جمع الأنسجة فيبروفاسكولار (قدم) التي كانت قد اقتطعت من البشر عملية جراحية ميكروينسيسيون ترانس مايوجد زجاجي شبكي، قبل 23 أو 20 قياس ثلاثة-ميناء بارس بلانا الاستئصال الكلي الزجاجية كجزء من إدارة العمليات الجراحية زجاجي شبكي للديمقراطية الشعبية.
   ملاحظة: قدم اقتطعت استخدام تجزئة وتنسل الأطراف، قص إذا لزم الأمر مع ميكروسسيسورس، وإزالتها من تجويف الزجاجي بالعين ميكروفورسيبس تجتاح نهاية بالجراح زجاجي شبكي ذوي الخبرة. يحتاج العناية القصوى التي يجب اتخاذها لإزالة FT سليمة، سليمة دون إلحاق أضرار بالعين الهياكل بما فيها العصب البصري أو ممر الأوعية الزمانية حيث الأنسجة نيوفاسكولار المرضية يقع الأكثر شيوعاً. حجم الأنسجة قصت متغير، وعادة ما تتراوح ما بين 3 و 50 مم².
2. الإبقاء قدم في صحن ثقافة الخلية 6 سم أو 1.5 مل أنبوب يحتوي على 1 مل PBS العقيمة على الجليد الرطب، ونقله فورا البحوث المختبرية للمعالجة.
   ملاحظة: من الضروري أن وحدة البحوث (مختبر مرافق) فعلياً قريبة من غرفة العمليات في المستشفى (أو) لتقليل أوقات نقل FT قصت الصغيرة. وفي هذه الحالة النقل يستغرق أقل من 5 دقائق و explants المضمنة داخل فيبرينوجين عادة في ح 1-1.5 (بحد أقصى 2 ح) بعد الاستئصال الجراحي. أثر أوقات أطول في نقل ثقافة 3D سوف تحتاج إلى اختبار.
3. المكان قدم في صحن ثقافة 6-سم خلية التي تحتوي على 1 مل من برنامج تلفزيوني في درجة حرارة الغرفة (RT، 25 درجة مئوية) والحصول على صور الأنسجة باستخدام مجهر مقلوب ابيفلوريسسينسي هدف 5 x.
   ملاحظة: يتم الحصول على الصور للتقييم النوعي والوثائق. وسوف يكون من الممكن لمراقبة حجم الأنسجة والكثافة والتركيب العام (مثلاً، هياكل الأوعية الدموية).
4. قطع قدم إلى ~ 1 مم² قطعة تحت ستيريوميكروسكوبي تشريح تستقيم، استخدام الملقط مشرط وميكروديسيكشن عقيمة. اضغط الأنسجة، وكذلك غارقة في برنامج تلفزيوني، في مكان استخدام الملاقط ميكروديسيكتيون، وإجراء التخفيضات واضحا باستخدام مشرط معقم. تجنب تمزق متر، كما أن هذا سيؤدي إلى تغيير هياكل فيبروفاسكولار الأصلية.
5. ضع كل قطعة فردية في بئر لوحة الثقافة 12-جيدا خلية تحتوي على 1 مل PBS العقيمة.
   ملاحظة: إذا لزم الأمر، بلطف انتشار متر على لوح، استخدام الملقط ميكروديسيكشن، قبل إجراء تخفيضات.

3-صب قطرات جل فيبرينوجين تستقيم لتوصيف FT الأصلية والثقافة السابقين فيفو

1. معقمة-تصفية الحل الفيبرينوجين استعداد إعدادها في الخطوة 1.2 مع عامل تصفية 0.22 ميكرومتر شنت في محقن 10 مل.
2. تحضير مختبرين الحل الفيبرينوجين (25 ميكروليتر كل أنبوب 1.5 مل) وأن يبقى في تحضير الرايت قاسمة فيبرينوجين هلام/كل قطعة متر تم الحصول عليها بعد التشريح، وزوجين من مختبرين إضافي للاختبار في فيبرينوجين هلام تشكيل.
3. تحضير حلاً لحبس تحتوي على 4 وحدات/مل من ثرومبين و 400 ميكروغرام/مل من أبروتينين، يسمى الآخرة تا الحل، وتبقى في تحضير الرايت قدر الحل تا حسب الحاجة، اعتماداً على عدد القطع التي تم الحصول عليها بعد تشريح (25 ميكروليتر تا الحل هو استخدام لكل هلام FT/fibrin)، ومبلغ إضافي (مثلاً 250 ميكروليتر) لاختبار تكوين هلام فيبرينوجين وضمان أن تكفي الحل متاح في جميع أنحاء صب قطرات جل فيبرينوجين.
   ملاحظة: ثرومبين مطلوب من أجل بلمرة فيبرينوجين حين يضاف إلى منع تدهور جل فيبرينوجين aprotinin البروتياز الخلوية التي أعرب عنها^13،FTs¹⁴.
4. اختبار توقيت فيبرينوجين هلام تشكيل: إضافة 25 ميكروليتر تا الحل إلى الحل الفيبرينوجين 25 ميكروليتر الكوتيد إعدادها في الخطوة 3، 2، واستخدام ماصة آخر تعيين إلى 50 ميكروليتر، خلط في الأنبوب بيبيتينج والاستغناء عن إلى طبق ثقافة خلية 6 سم ، تشكل الحبرية تستقيم.
   ملاحظة: تكوين هلام فيبرينوجين ينبغي أن يجري في ~ 1 دقيقة. إذا كان هذا يأخذ أكثر من 1.5 دقيقة، يمكن زيادة تركيز ثرومبين في الحل تا إعدادها في الخطوة 3، 3 بإضافة أكثر من حل الأسهم ثرومبين. يمكن إضافة عشر حجم المستخدمة في البداية من حل الأسهم ثرومبين، مرارا وتكرارا، حتى تشكيل جل فيبرينوجين يحدث داخل 1.5 دقيقة. وقت تكوين هلام فيبرينوجين أمر حاسم لثلاثة أبعاد للثقافة، كجل سريع تشكيل (في غضون دقائق 1.5) يمنع متر قطعة من غرق إلى الجزء السفلي من جل فيبرينوجين، وهكذا تأتي على اتصال بسطح البلاستيك 2D الخلية لوحة الثقافة، والتي يمكن أن تؤدي إلى التصاق الخلايا 2D وثمرة.
5. جيدا من صفيحة 24-جيدا باستخدام ملقط معقم مكان قطعة متر واحد في المركز واحد وإزالة أي برنامج تلفزيوني الزائدة عن طريق بيبيتينج مع 0.5-10 ميكروليتر ماصة لتجنب قوة الشفط على قدم. في حالة الأنسجة تتمسك الملاقط، استخدم الملاقط إضافية للمساعدة في وضع قطعة النسيج في اللوحة.
   ملاحظة: يمكن أن يلقي الجل FT/فيبرينوجين أيضا على لوحة 48-جيدا للحد من استخدام المواد الكاشفة. ومع ذلك، هذا أكثر صعوبة كما أن الفضاء أكثر محدودية وسوف تنتشر فيبرينوجين إذا أنه يأتي في اتصال مع الجدار جيدا.
6. إضافة 25 ميكروليتر تا الحل إلى الحل الفيبرينوجين ميكروليتر 25 اليكووتيد في الخطوة 3، 2، واستخدام ماصة آخر تعيين 50 ميكروليتر ميكس في الأنبوب بواسطة بيبيتينج. الاستغناء عن على قطعة متر توضع على اللوحة جيدا، وماصة صعودا وهبوطاً 2-3 مرات كي تشمل قطعة متر داخل الحبرية تستقيم، توفير مصفوفة ثلاثية الأبعاد المحيطة بها إلى قدم.
   ملاحظة: تأكد من أن قدم لا يستنشق خلال بيبيتينج وأن يتم تشكيل لا فقاعات الهواء. تكفل أيضا خلط، إعفاء وبيبيتينج أداء بسرعة كما سوف تشكل جل فيبرينوجين داخل 1.5 دقيقة، كما تم اختبارها في الخطوة 3.4. إذا صب المواد الهلامية فيبرينوجين على لوحة 48، حسنا، استخدم بدلاً من ذلك 20 ميكروليتر من حل الفيبرينوجين و 20 ميكروليتر من حل تا.
7. كرر الخطوات من 3.5 و 3.6 لكل قطعة متر.
8. تسمح المواد الهلامية فيبرينوجين ترسيخ التي تفرخ اللوحات في حاضنة ثقافة خلية عند 37 درجة مئوية في جو هوميديفيد مع شركة 5%₂.
9. بعد 0.5-1 ح، تحقق من أن جل فيبرينوجين يتكون تماما من عناية إمالة اللوحة. انتقل إلى الخطوة 3، 10 عند الجل لا تتحرك عند تحريك اللوحة، مشيراً إلى أن تشكيل جل فيبرينوجين كاملة.
10. تراكب الجل FT/فيبرينوجين مع السابقين فيفو الثقافة المتوسطة (600 ميكروليتر/أيضا في لوحة 24-جيدا) أو 300 ميكروليتر/بئر في لوحة 48-جيدا وتستكمل مع 100 ميكروغرام/مل أبروتينين. "الماصة؛" المتوسطة بلطف بإعفاء دروبويسي.
    ملاحظة: هنا، aprotinin تستخدمها لمنع تدهور جل فيبرينوجين البروتياز الخلوية التي أعرب عنها^13،FTs¹⁴. السابقين فيفو المتوسطة الثقافة يمكن بالإضافة إلى ذلك أن تستكمل بعوامل النمو المؤتلف، مثل فيجفا، فيجفك، بفجف، TGFβ (انظر الجدول للمواد)¹¹.
11. مكان قدم السابقين فيفو ثقافة اللوحة مرة أخرى إلى 37 درجة مئوية ونسبة 5% CO₂ خلية ثقافة حاضنة والثقافة للفترة الزمنية المطلوبة (مثلاً، 2-18 يوما، ثقافة أطول فترات سوف تحتاج إلى اختبار). يستعاض عن 50 في المائة المتوسط مع الطازجة السابقين فيفو الثقافة المتوسطة كل ثلاثة أيام.

4-"في مادة خلالية التصوير

1. الحصول على صور قدم السابقين فيفو الثقافات في نفس اليوم (يوم 0) وفي فترات زمنية معينة (مثلاً كل يوم)، باستخدام مجهر مقلوب ابيفلوريسسينسي، من أجل متابعة نمو 3D.
   ملاحظة: يمكن استخدام الصور التي تم الحصول عليها للتحديد الكمي لثمرة متر كالطول الإجمالي لاثنين من أقطار متعامدة عبر ال explant¹¹.

5. قدم الأصلية ونقطة النهاية الثقافة السابقين فيفو

ملاحظة: يمكن مثقف السابقين فيفو للفترة الزمنية المطلوبة (قدم السابقين فيفو الثقافات) المواد الهلامية FT/فيبرينوجين أو ثابتة في نفس اليوم (قدم الأصلي) ل توصيف FT الأصلية¹¹.

1. إصلاح قدم الأصلي أو قدم السابقين فيفو الثقافات بالاستعاضة عن المتوسط الثقافة مع 1 مل/جيدا من بارافورمالدهيد 4 ٪ في حل برنامج تلفزيوني، ح 1 في الرايت للهلام FT/فيبرينوجين الأصلية، إصلاح 0.5-1 ح بعد إضافة السابقين فيفو الثقافة المتوسطة (إذا كان قد تم غارقة الجل فيبرينوجين ليس في المتوسط، التثبيت سوف تلحق الضرر لهم).
   ملاحظة: إجراء هذه الخطوة في غطاء الدخان كما بارافورمالدهيد أكالة والسامة والمسببة للسرطان.
2. شطف الجل FT/فيبرينوجين مع ثلاثة 5 دقائق يغسل في برنامج تلفزيوني (2 مل في البئر).
3. استبدال برنامج تلفزيوني مع 2 مل/جيدا لبرنامج تلفزيوني يتضمن أزيد الصوديوم 0.02 في المائة، وتخزين المواد الهلامية فيبرينوجين ثابتة عند 4 درجة مئوية حتى مزيد من المعالجة. ختم اللوحات مع الفيلم البارافين التأكد من أن المواد الهلامية FT/فيبرينوجين الجاف لا في التخزين.
   ملاحظة: إجراء هذه الخطوة في غطاء الدخان كما أزيد الصوديوم السامة.

6-تلوين الفلورة كل-جبل

ملاحظة: هذا البروتوكول تستمر 5 أيام، ويمكن أن توقف مع إينكوبيشنز بين عشية وضحاها حيث المشار إليها. لا تدع فيبرينوجين الجل الجاف عند أي نقطة. يتم تنفيذ كافة الخطوات في الرايت ما لم يشر إلى خلاف ذلك.

1. إعداد الحلول التالية قبل بدء تشغيل البروتوكول المصبوغة.
   1. الحل بعد انتهاء التثبيت: إعداد 50: 50 الأسيتون: الميثانول الحل عن طريق خلط كميات متساوية من الأسيتون والميثانول (مثلاً 50 مل). مخزن في-20 درجة مئوية. إعداد هذا الحل أحدث في اليوم السابق لتلطيخ. هذا الحل يمكن تخزينها مرة أخرى في-20 درجة مئوية، وستستخدم ستينينجس اللاحقة.
      ملاحظة: يعد هذا الحل في غطاء الدخان كذلك الأسيتون والميثانول القابلة للاشتعال وخطرة على الصحة.
   2. عرقلة الحل: إعداد 15% الجنيني بقرى مصل (FBS)، 0.3% octyl الفينول الحل اثوكسيلاتي في برنامج تلفزيوني بأول إضافة 15% FBS لبرنامج تلفزيوني. إضافة الفينول أوكتيل اثوكسيلاتي وآثاره إلى حل. مخزن في 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: هذا الحل يمكن إعداد كمية كبيرة مقدما، المخزنة في اليكووتيس 15 مل في-20 درجة مئوية وإذابة قبل الاستعمال، في اليوم عند بدء تشغيل البروتوكول المصبوغة. استخدام الكوت طازجة أو المذابة طازجة لكل بروتوكول المصبوغة.
   3. الغسيل الحل: تحضير 1 لتر من برنامج تلفزيوني مع 0.45 في المائة octyl الفينول اثوكسيلاتي تكملها إضافة 4.5 مل فينول أوكتيل اثوكسيلاتي لمل 995.5 من برنامج تلفزيوني. إثارة إلى حل. مخزن في الرايت
2. رفع قطرات بعناية من اللوحة باستخدام ملعقة ذات حواف مربع فولاذ المقاوم للصدأ. فصل الحبرية أولاً من الحواف قبل رفع المركز، ونقل إلى بئر 12-جيدا صفيحة تحتوي على 1 مل من برنامج تلفزيوني.
   ملاحظة: إجراء التثبيت بعد ويغسل وعرقلة الخطوات في هذا الشكل لوحة.
3. بعد إصلاح القطرات مع 1 مل من المثلج 50: 50 الأسيتون: الميثانول الحل لدقيقة ~ 1 (سوف تتحول حدود القطرات بيضاء).
   ملاحظة: إجراء هذه الخطوة في غطاء الدخان كما الأسيتون والميثانول تشكل خطرا على الصحة.
4. شطف مع يغسل 3-5 في 2 مل من برنامج تلفزيوني (سوف تنزل القطرات في برنامج تلفزيوني الحل عند اكتمال الإماهة).
   ملاحظة: تجنب لمس القطرات مع طرف ماصة، كما بعد التثبيت فيما بعد، لاصقة للبلاستيك. في جميع أنحاء البروتوكول، تجنب يسفط ما بعد الإصلاح، جسم، حجب وغسل الحلول بالشفط، كما أن هذا قد تضر أو تدمر تماما القطرات. بدلاً من ذلك، إمالة اللوحة وإزالة حلول باستخدام ماصة ميكروليتر 500-5,000 بعناية.
5. الطرد المركزي حل حظر لمدة 15 دقيقة في 21,000 س ز و 4 درجة مئوية من أجل إزالة الحطام.
   ملاحظة: يمكن أن يكون الحل الكوتيد في أنابيب 1.5 مل للطرد المركزي. يمكن تخزين في 4 درجات مئوية الحل غير المستخدمة والمستخدمة لجميع الخطوات اللاحقة ذات الصلة.
6. احتضان القطرات في 500 ميكروليتر عرقلة الحل ح 2 في الرايت
   ملاحظة: لتقليص حجم عرقلة الحل المستخدم، اللوحة يمكن يميل على دعم ويمكن استخدام أقل قدر من 300 ميكروليتر من الحل/الحبرية.
7. إعداد الخليط جسم الأولية (على الأقل 30 ميكروليتر/الحبرية) في تمييع المناسبة في عرقلة الحل والطرد المركزي لمدة 15 دقيقة في س 21,000 ز و 4 درجة مئوية.
8. نقل القطرات في جولة (U)-أسفل لوحة 96-جيدا باستخدام ملعقة ذات الحواف المستديرة، واحتضان مع ميكروليتر/الحبرية مالا يقل عن 30 من خليط جسم الأولية بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
9. اليوم التالي، نقل القطرات في بئر 12 لوحة تحتوي على 2 مل من الغسيل الحل/حسنا، شطف مع 5 ثلاث دقائق يغسل أولاً ثم مع تسع 30 دقيقة يغسل. إجازة تغسل الماضي (2 مل) بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
10. اليوم التالي، شطف ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني ونقل القطرات في جولة (U)-96-جيدا لوحة أسفل.
11. خلال يغسل، إعداد المخلوط مناسبة جسم الثانوي مترافق fluorophore (المخفف 1: 500، على الأقل 30 ميكروليتر/الحبرية) في عرقلة الحل والطرد المركزي لمدة 15 دقيقة في 21,000 س ز و 4 درجة مئوية.
12. نقل القطرات إلى جولة (U)-أسفل لوحة 96-جيدا باستخدام ملعقة ذات الحواف المستديرة واحتضان مع ميكروليتر على الأقل 30 الخليط الجسم المضاد الثانوي، عن ح 4 في الرايت، محمية من الضوء.
    ملاحظة: تنفيذ جميع إينكوبيشنز اللاحقة وخطوات الغسيل محمية من الضوء.
13. نقل القطرات في لوحة 12-البئر الذي يحتوي على 2 مل من الغسيل الحل/جيدا باستخدام ملعقة ذات الحواف المستديرة، شطف مع ثلاثة 5 دقائق يغسل أولاً ومن ثم مع أربعة 30 دقيقة يغسل. إجازة تغسل الماضي (2 مل) بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
14. اليوم التالي، شطف الجل مع خمسة 30 دقيقة يغسل وثم ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني. إجازة تغسل الماضي (2 مل) بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
15. اليوم التالي، نقل القطرات إلى جولة (U)-لوحة 96-جيدا أسفل باستخدام نوى البسط وكونتيرستاين ذات الحواف المستديرة التي تفرخ مع 10 ميكروغرام/مل هويشت النووية وصمة عار (على الأقل 30 ميكروليتر/الحبرية) لمدة 30 دقيقة في الرايت
    ويمكن بدلاً من ذلك استخدام ملاحظة: تصاعد المتوسطة وتستكمل مع 4 '، 6-دياميدينو-2-فينيليندولي (DAPI) لنواة كونتيرستينينج. في هذه الحالة، تخطي هذه الخطوة والخطوة 6.16، الانتقال مباشرة إلى الخطوة 6.17.
16. نقل القطرات في لوحة 12-البئر الذي يحتوي على 2 مل من برنامج تلفزيوني/جيدا باستخدام ملعقة ذات الحواف المستديرة وشطف ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني.
17. جبل قطرات على شريحة المجهر على النحو التالي:
    1. تطبيق طبقة ضيقة من تصلب سريعة التركيب المتوسطة على حواف كوفيرجلاس على شكل مربع 22 مم × 22 مم واسمحوا جافة ~ 1 دقيقة. تنفيذ هذه الخطوة لكل قطره على حدة، لتجنب تصلب المفرط في المتوسط المتصاعدة.
       ملاحظة: تنفيذ هذه الخطوة في غطاء الدخان كما المتوسط التركيب السريع-تصلب خطرة على الصحة.
    2. شطف الحبرية بالغمس في بئر صفيحة 12-جيدا يحتوي على 2 مل مياه ونقلها إلى شريحة مجهر، استخدام ملعقة ذات الحواف المستديرة. إزالة المياه الزائدة باستخدام قطعة صغيرة من ورقة ماصة.
    3. الاستغناء عن 15 ميكروليتر من تصاعد عدم تصلب أنتيفادي المتوسطة على الحبرية.
       ملاحظة: بدلاً من ذلك، إذا لم يتم استخدامه هويشت النووية وصمة عار، تصاعد المتوسطة التي تحتوي على 4 ', 6-دياميدينو-2-فينيليندولي (DAPI) يمكن استخدامها.
    4. بلطف ضع زجاج الغطاء، مع المتوسطة تصاعد تصلب السريعة التي تواجه شريحة مجهرية، عبر الحبرية والسماح لتسوية.
       ملاحظة: وسيلة سريعة-تصلب ستلتزم الشرائح المجهرية وإبقاء الحبرية في المكان.
18. كرر الخطوة 6.17 قطرات كافة. جبل قطرات اثنين على كل شريحة المجهر.
19. واسمحوا الشرائح أيردري على RT ح ~ 2 وتخزينها في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها. تأكد من أن الشرائح يتم وضعه أفقياً ومحمية من الضوء.
20. الصورة الأصلية الملون أو نقطة النهاية قدم السابقين فيفو الثقافات باستخدام مجهر [كنفوكل] أو مجهر ابيفلوريسسينسي تستقيم مزودة بوظيفة تقطيع ضوئية و 20 x أو 40 س الهدف. استخدم الدالة بلاط لالتقاط مساحة أكبر من الأنسجة في وقت واحد.

النتائج

فهم أعمق لخصائص الأنسجة فيبروفاسكولار الديمقراطية الشعبية والتعبير البروتين تعتمد أساسا على عينات الزجاجي ورقيقة النسيجي قدم أقسام^3،15،،من¹⁶¹⁷. بتطوير طريقة لإجراء تحقيق شامل في المنظمة أنسجة ثلاثية ?...

Discussion

وبالنظر إلى أهمية المكروية الأنسجة ذات الصلة للخلية الفنية موثوق بها والنتائج الميكانيكية الجزيئية، يتحتم إيجاد النماذج التجريبية المناسبة التي توفر هذه البيئة الأنسجة. هذه الوثيقة وصف السابقين فيفو الديمقراطية الشعبية ثقافة نموذج FTs جزءا لا يتجزأ من فيبرينوجين يسمح التحقيق في آل?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Material
Microforceps	Medicon	07.60.03	Used for handling the FTs
Disposable Scalpels - Sterile	Swann-Morton	0513	Used for FT dissection
Culture dish, vented, 28 ml (60mm)	Greiner Bio-One	391-3210	Used for dissection and for testing fibrin gel formation
Cell culture plates, 12-well	Greiner Bio-One	392-0049	Used for FT dissection and whole-mount immunofluorescence
Reagent/centrifuge tube with screw cap, 15 mL	Greiner Bio-One	391-3477
Reagent/centrifuge tube with screw cap, 50 mL	Greiner Bio-One	525-0384
Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 µm, PVDF	Millipore	SLGV033RS	Used to sterile-filter the fibrinogen solution
Syringe, 10 mL	Braun	4606108V	Used to sterile-filter the fibrinogen solution
Polypropylene Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL	Fisher	FB74031
Cell-Culture Treated Multidishes, 24-well	Nunc	142475	Used for casting the FT/fibrin gels for native FT characterization and ex vivo culture
Cell culture plates, 96-well, U-bottom	Greiner Bio-One	392-0019	Used for whole-mount immunofluorescence
Round/Flat Spatulas, Stainless Steel	VWR	82027-528	Used for whole-mount immunofluorescence
Coverslips 22x22mm #1	Menzel/Fisher	15727582	Used for mounting
Microscope slides	Fisher	Kindler K102	Used for mounting
Absorbent paper	VWR	115-0202	Used for mounting
Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
PBS tablets	Medicago	09-9400-100	Used for preparing 1x PBS
Fibrinogen, Plasminogen-Depleted, Human Plasma	Calbiochem	341578
Hanks Balanced Salt Solution	Sigma-Aldrich	H9394-500ML	Used for preparing the fibrinogen and TA solution
Fetal bovine serum	Gibco	10270106	Used for preparing the blocking solution
Human Serum	Sigma-Aldrich	H4522	Aliquoted in -20 °C, thaw before preparing the ex vivo culture media
Gentamicin Sulfate 10mg/ml	Biowest	L0011-100
Endothelial cell media MV Kit	Promocell	C-22120	Contains 500 ml of Endothelial Cell Growth Medium MV, 25 mL of fetal calf serum, 2 mL of endothelial cell growth supplement,  500 μL of recombinant human epidermal growth factor (10 μg/ mL) and 500 μL of hydrocortisone (1 g/ mL)
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S2002	Used for storage of the native and ex vivo cultured FTs. TOXIC: wear protective gloves and/or clothing, and eye and/or face protection. Use in fume hood.
Acetone	Sigma-Aldrich	32201-2.5L-M	Used to prepare the post-fixation solution. HARMFUL: wear protective gloves and/or clothing. Use in fume hood.
Methanol	Sigma-Aldrich	32213	Used to prepare the post-fixation solution. TOXIC: wear protective gloves and/or clothing. Use in fume hood.
Triton X-100 (octyl phenol ethoxylate)	Sigma-Aldrich	T9284	Used for whole-mount immunofluorescence. HARMFUL: wear protective gloves and/or clothing.
Hoechst 33342, 20mM	Life Technologies	62249	For nuclei counterstaining. HARMFUL: wear protective gloves and/or clothing, and eye and/or face protection.
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1000	Wear protective gloves and/or clothing, and eye protection. Use in fume hood.
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI	Vector Laboratories	H-1200	Mounting medium with nuclei counterstaining. Wear protective gloves and/or clothing, and eye protection. Use in fume hood.
Eukitt Quick-hardening mounting medium	Sigma-Aldrich	03989-100ml	TOXIC: Wear protective gloves and/or clothing, and eye protection. Use in fume hood.
Thrombin from bovine plasma, lyophilized powder	Sigma-Aldrich	T9549-500UN	Dissolve at 100 units/ mL, aliquote and store at -20 °C, avoid repeated freeze/ thaw
Aprotinin from bovine lung, lyophilized powder	Sigma	A3428	Dissolve at 50 mg/ mL, aliquote and store at -20 °C, avoid repeated freeze/ thaw
Name	Company	Catalog Number	Comments
Growth factors
Recombinant human VEGFA	R&D Systems	293-VE-010	50 ng/ mL final concentration
Recombinant human VEGFC	R&D Systems	752-VC-025	200 ng/ mL final concentration
Recombinant human TGFβ	Millipore	GF346	1 ng/ mL final concentration
Recombinant human bFGF	Millipore	01-106	50 ng/ mL final concentration
Name	Company	Catalog Number	Comments
Primary antibodies
CD31 (JC70A)	Dako	M0823	Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab
CD34 (QBEND10)	Dako	M716501-2	Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab
CD45 (2B11+PD7/26)	Dako	M070129-2	Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab
CD68	ImmunoWay	RLM3161	Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab
Cleaved caspase-3 (5A1E)	Cell Signalling	9664	Used at 1:200 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab
ERG (EP111)	Dako	M731429-2	Used at 1:100 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab
GFAP	Dako	Z0334	Used at 1:100 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab
Ki67	Leica Microsystems	NCL-Ki67p	Used at 1:1500 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab
Lyve1	R&D Systems	AF2089	Used at 1:100 dilution, Donkey anti Goat Alexa 568 Secondary Ab
NG2	Millipore	AB5320	Used at 1:100 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab
Prox1	ReliaTech	102-PA32	Used at 1:200 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 568 Secondary Ab
Prox1	R&D Systems	AF2727	Used at 1:40 dilution, Chicken anti Goat Alexa 594 Secondary Ab
VEGFR3 (9D9F9)	Millipore	MAB3757	Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab
α-SMA (1A4)	Sigma	C6198	Used at 1:400 dilution, Cy3 conjugated
Name	Company	Catalog Number	Comments
Secondary antibodies
Alexa Fluor488 Donkey Anti-Mouse IgG	Life Technologies	A-21202	Used at 1:500 dilution
Alexa Fluor594 Goat Anti-Rabbit IgG	Invitrogen	A-11012	Used at 1:500 dilution
Alexa Fluor568 Donkey anti-Goat IgG	Thermo Scientific	A-11057	Used at 1:500 dilution
Alexa Fluor568 Goat anti-Rabbit IgG	Thermo Scientific	A-11036	Used at 1:500 dilution
Alexa Fluor594 Chicken Anti-Goat IgG	Molecular Probes	A-21468	Used at 1:500 dilution
Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscopes
Axiovert 200 inverted epifluorescence microscope	Zeiss		For imaging of the fresh and fibrin-embedded FT
SZX9 upright dissection stereomicroscope	Olympus		For FT dissection
LSM 780 confocal microscope	Zeiss		For imaging of whole-mount immunostained FT
AxioImager.Z1 upright epifluorescence microscope with Apotome	Zeiss		For imaging of whole-mount immunostained FT