شاشة القامع عميق--التسلسل-ساعد، عفوية في "انشطار الخميرة" شيزوساكتشاروميسيس بومبي

Summary

نقدم بروتوكول شاشة القامع بسيطة في انشطار الخميرة. يعد هذا الأسلوب كفاءة خالية مطفر والانتقائي للطفرات التي غالباً ما تحدث في موضع الجينوم واحد.  البروتوكول مناسبة لعزل المكثفات التي تخفف من عيوب النمو في الثقافة السائلة التي تنتج عن طفرة أو دواء.

Abstract

شاشة وراثية للمسخ الآليلات التي تقمع المظهرية العيوب الناجمة عن طفرة هو نهج قوية لتحديد الجينات التي تنتمي إلى المسارات البيوكيميائية ارتباطاً وثيقا. الأساليب السابقة مثل تحليل صفيف الجينية الاصطناعية (SGA)، وتقنيات الطفرات العشوائية باستخدام الأشعة فوق البنفسجية (الأشعة فوق البنفسجية) أو المواد الكيميائية مثل إيثيل ميثانيسولفوناتي (EMS) أو N-إيثيل-ن-نيتروسوريا (ENU)، وقد استخدمت على نطاق واسع ولكن غالباً ما تكون مكلفة و شاقة. أيضا، هذه الأساليب المستندة إلى مطفر الفرز كثيرا ما يرتبط مع آثار جانبية حادة في الكائن الحي، وحمل العديد من الطفرات التي إضافة إلى الطابع المعقد لعزل المكثفات. نقدم هنا، بروتوكول بسيطة وفعالة للتعرف على الطفرات القامع في طفرات الذي يضفي على وجود خلل نمو في بومبي شيزوساكتشاروميسيس. يمكن رصد اللياقة البدنية للخلايا مع نقص نمو في وسائل الإعلام السائلة الغنية القياسية أو وسائل الإعلام السائلة الاصطناعية للاسترداد باستخدام قارئ الآلي 96-كذلك لوحة لفترة طويلة. وبمجرد خلية يكتسب طفرة القامع في الثقافة، توابعه أووتكومبيتي تلك الخلايا الأبوية. يمكن عزل الخلايا المستردة التي تتمتع بميزة تنافسية نمو عبر الخلايا الأبوية وباككروسيد مع الخلايا الأبوية. ثم تحديد الطفرات القامع استخدام تسلسل الجينوم كلياً. باستخدام هذا النهج، نحن قد عزلت بنجاح المكثفات المتعددة التي تخفف من عيوب النمو الحاد الناجم عن فقدان Elf1، أأأ أسرة ATPase أن المهم في النقل النووي مرناً وصون الاستقرار المجيني. هناك حاليا أكثر 400 الجينات في بومبي س. مع طفرات منح خلل نمو. كما أن العديد من هذه الجينات أونتشاراكتيريزيد، فإننا نقترح أن لدينا أسلوب سوف يعجل تحديد التفاعلات الوظيفية الرواية مع هذا النهج سهلة الاستعمال، والفائق.

Introduction

الأساس لفهم الصلات الوظيفية بين الجينات يعتمد على القدرة على تحديد الآليات الجزيئية التي تتباعد المعقدة الصفات الوراثية لإنتاج متنوعة تعمل¹. في انشطار الخميرة، بومبي شيزوساكتشاروميسيس (S. بومبي)، غالبية الجينات ترميز البروتين يمكن الاستغناء عنها لبقاء². ولا يتكلم هذه النتيجة إلى أونيمبورتانسي من هذه الجينات، ولكن بدلاً من ذلك إلى الآليات التعويضية المعقدة الكامنة وراء الممرات البيوكيميائية التي تنتمي إليها تلك الجينات. تشريح هذه الآليات التعويضية قد ولدت خرائط ابيستاسيس، والتي كشفت عن التفاعلات الجينية شاملة وتوسيع فهمنا لمسارات وظيفية البيوكيميائية^3،4.

وقد وضعت أساليب الفائق (مثلاً، تحليل "صفيف الجينية الاصطناعية"، أو SGA) لتحديد التفاعلات الوراثية الجينوم على نطاق المنظومة في مهدها الخميرة، وقد توسعت للاستخدام في انشطار الخميرة^5،6. مثل هذا النهج كثيرا ما تعتمد على مكتبة سلالات تحتوي على كل واحد ترميز البروتين مجدية الجينات الحذف (طفرات الحذف فرداني حوالي 3,300 تغطي أكثر من 92% جينوم الخميرة الأنشطار)، وتتطلب ذراع إليه لأداء الصلبان الوراثية بين سلالة من الفائدة وجميع سلالات الممكنة في library6. علاوة على ذلك، SGA تقنيات تعتمد على قدرة سلالات المكتبة أن يكون التزاوج سليمة وفعالة، وتتميز النمط الظاهري الذي حاليا غير طبيعي إلى 444 الجينات في بومبي س.².

وعلى الرغم من تعقيد التفاعلات الجينية، مقارنة النمط الظاهري من سلالة تحمل طفرات في اثنين من الجينات للنمط الظاهري سلالات اثنين تحمل الطفرات الفردية لكل الجينات يمكن أن يكون واحداً من اثنين من النتائج الجديرة بالذكر: 1) النمط الظاهري متحولة مزدوجة أسوأ من تعمل الأبوية المضاعف المتوقع في شكل مرض، أو في الحالة الأكثر تطرفاً، القدرة على الفتك. هذا يشار إلى وجود تفاعل وراثية سلبية، وهو علامة على أن تتصرف اثنين من الجينات في مسارات بيولوجية موازية عموما. 2) النمط الظاهري متحولة مزدوج أفضل من الجمع بين الوالدين تعمل، المعروف أيضا تفاعل إيجابي وراثية المتوقعة. تفاعل إيجابي وراثية مثيرة للاهتمام لا سيما لأنها تشير إلى أن هذه الجينات تعمل في نفس العملية. اثنين من الجينات التفاعل إيجابيا علاقات محتملة ثلاثة: مورثة متحولة قد تصل-تنظيم التعبير عن الجينات الأخرى في مسار مواز، قد تعمل اثنين من الجينات في الحفل ضمن المسار نفس المصب من بعضها البعض، أو ترميز الجينات اثنين البروتينات التي تتفاعل مباشرة مع بعضها البعض. ولذلك، يمكن استخدام التفاعلات الجينية الإيجابية لخريطة الجينات العقد التنظيمي وتصنيف الجينات أونتشاراكتيريزيد في المسارات البيوكيميائية^7،8.

القامع هو الطفرات التي يمكن أن تخفف من النمط الظاهري المرض من تحور الجين آخر، عادة ما تمثل وراثية تفاعل إيجابي بين^9،اثنين من الجينات¹⁰. وتعرف الطفرات القامع على موضع مختلف عن الطفرة أنها قمع المكثفات اكستراجينيك. وذات قيمة خاصة في دراسة الطفرات الوراثية غير قادر على الاستمرار بإنقاذ صناعيا الفتاكة النمط الظاهري (يعرف أيضا باسم تأثير لازاروس)¹¹. كما أن لها تطبيقات علاجية محتملة في علاج الأمراض الوراثية^12،13.

لكل هذه الأسباب، تم تحديد الطفرات القامع في مختلف نموذج الكائنات تستخدم على نطاق واسع لتسهيل فهمنا لمختلف المسارات البيوكيميائية^14،،من¹⁵¹⁶. فحص المكثفات يستند عادة على النمط الظاهري للطفرة في السؤال، ويتطلب إجراء الطفرات العشوائية لعزل الطفرات التي من شأنه أن يخفف النمط الظاهري. وقد أنشأت تقريبا كل نموذج الكائنات أساليب الطفرات العشوائية. على سبيل المثال، N-إيثيل-ن-نيتروسوريا (ENU) واثيلميثانيسولفوناتي (EMS)، والمطفرات اثنين التي هي قادرة على استحثاث الطفرات في الحمض النووي، وهي تستخدم على نطاق واسع في نماذج مختلفة من البكتيريا للفئران^17،،من¹⁸¹⁹ . وباﻹضافة إلى ذلك، كلوريد المنغنيز طالما استخدمت في الخمائر لقدرة الموجبة المنغنيز تمنع الحمض النووي إصلاح مسارات²⁰. نهج مشترك آخر هو الطفرات المستحثة بالأشعة فوق البنفسجية، الذي يولد على نطاق الجينوم مطفرة بيريميدين dimers^21،22.

على الرغم من أن قد تم استغلال الطفرات الكيميائية التعرف على الطفرات القامع شعبية، الأسلوب يحتوي على العديد من العوائق، بما في ذلك استخدام المواد الكيميائية الخطرة ومعدلات نجاح عالية المتغير، والأخذ بالمتغيرات التباس إضافية وعرض الآثار الجانبية السلبية مطفر في العمليات الخلوية متعددة^،من²³²⁴. بالإضافة إلى ذلك، يدفع الطفرات الكيميائية غالباً متعددة الطفرات في الجينوم الذي يضيف إلى تعقيد استخدام الوراثية وتقنيات التسلسل لتحديد الطفرة الدقيقة التي تمنح النمط الظاهري القامع في الكائن الحي²⁵.

لمعالجة أوجه قصور النهج الطفرات الحالية، نقدم طريقة إلى الشاشة للطفرات العفوية القامع في انشطار الخميرة التي لا تعتمد على أي المطفرة أو مكتبة حذف. الأسلوب الذي يعزل المكثفات من خلال مقايسة تحديد إيجابي. يستند مبدأ هذا الأسلوب ميزة النمو يتدنى القامع تحور في الثقافة السائلة، التي يمكن رصدها بقارئ لوحة الآلي. التزاوج والانقسام الاختزالي تستخدم فقط إذا كان أحد يود أن تنظيف الخلفية الجينية أو تأكيد وجود الآليلات monogenic المكثفات قبل تسلسل الجينوم كلياً. النمط الظاهري القامع إذا كان النمط الظاهري قمع سببه طفرة واحدة، سيتم فصل 2:2 بعد باككروسينج مع السلالات الأبوية. يمكن ثم تحديد الطفرات القامع استخدام تسلسل الجينوم كلياً. ونحن نقترح أن هذا الأسلوب الواجب التطبيق لفحص المكثفات في جميع الكائنات الحية الدقيقة التي يمكن أن تنمو لعدد كبير من سكان في ثقافة السائل.

Protocol

1-سلالة البناء وإعداد

1. توليد طفرة أو حذف من الجينات (يفم، والطفرات المفضلة الخاصة بك) باستخدام معيار الموقع الموجه الطفرات (SDM) كما هو موضح سابقا²⁶.
2. قبل بدء تشغيل الشاشة، باككروس (على النحو الأمثل) سلالات متحولة بسلالة البرية من نوع لتنظيف الخلفية الوراثية وتوليد خلايا متحولة ولد الطازجة السلالات الأبوية. خط السلالة الأبوية إلى مستعمرات فردية على لوحات قياسية الوسائط الغنية. اختيار ثمانية إلى ستة عشر مستعمرات مستقلة (replicates البيولوجية) عشوائياً مع الطفرات المرغوبة للمقايسة قارئ لوحة (انظر 3.1).
   ملاحظة: هذا البروتوكول فعالة إلا عندما تكون السلالات الأبوية على نمو عيب في وسائل الإعلام السائلة (الحد الأدنى أو الغنية، مع أو دون المخدرات، أو مع تحولات درجة الحرارة التي تسبب خلل النمو). ينبغي أن تكون جميع السلالات الأبوية فرداني وهكذا قادرة على تجاوزها وراثيا مع غيرها سلالات فرداني بنوع التزاوج تكميلية.

2-لوحة قارئ الإنزيم

1. مع قضيب عقيمة، تأخذ كمية صغيرة من كل من المستعمرات إعدادها في الخطوة 1، 1 (لا الضبط المبلغ اللازم لتطعيم بدءاً الثقافة) وفي ميكروسكوبية البوليستيرين 96-جيدا. تعليق كل من المستعمرات في 200 ميليلتر لوسائل الإعلام السائلة المناسبة (غنية أو الحد الأدنى، مع أو بدون المخدرات). وتشمل كذلك فارغة لكل صف على اللوحة التي تحتوي على 200 ميليلتر من نفس الوسائط (لا الخلايا).
2. تشغيل البروتوكول التالي في برامج الكشف عن قارئ لوحة متصلة إلى قارئ ميكروسكوبية الآلي: تعيين أحد برامج حركية 24 ساعة ودرجة الحرارة عند 30 درجة مئوية، مع الهز المداري السريع المستمر (425 cpm، السعة 3 مم). تعيين القراءة الضوئية لقياس الضوء المبعثر في موجه 600nm للكثافة البصرية، وعلى ضوء قراءة من أسفل اللوحة بتواتر قراءة من 2 دقيقة (721 قراءة المجموع على مدى فترة 24-ح كل بئر).
3. بعد 24 ساعة، سجل قراءات الكثافة البصرية استبدالها النهائي (استبدالها OD600) واستخدم الصيغة التالية لتحديد حجم الحاجة إلى تمييع كل من العينات وصولاً إلى نقلت = 0.1:
   
   ملاحظة: تصدير البيانات من برنامج قارئ لوحة واستخدام برامج جداول بيانات لإدراج الصيغة أعلاه كدالة لدفعة عملية تمييع وحدة التخزين ليتم استخدامها من كل بئر تجريبية.
4. كل 24 ساعة، تضعف كل من العينات باستخدام نفس الوسائط كيوم 0 إلى نقلت = 0.1 (حوالي 1.5 × 10⁶ خلايا/مل) باستخدام الصيغة المشار إليها في الخطوة 2، 3. حفظ كل نمو منحنيات المتولدة يوميا وملاحظة أي مستعمرة الفردية التي يبين معدل نمو المتزايد، يحكم نقلت نهائية التي أعلى بكثير من بقية الفوج مع نفس الخلفية الوراثية أو منحنى نمو التي مماثلة لتلك التي البرية من نوع المستعمرات.
   ملاحظة: هذا الفحص عادة ما يستغرق حوالي 7-14 يوما. تنفيذ كافة الخطوات تحت ظروف معقمة.

3-اختيار المستعمرات القامع وتأكيدا للنمط الظاهري.

1. من آخر يوم من مقايسة قارئ لوحة (الخطوة 2، 4)، حفظ ثقافات السائلة التي لها معدل نمو ملحوظ المستردة، يفترض أن تكتسب طفرة القامع التي يمكن أن تخفف من النمط الظاهري للطفرة الأبوية. نقل ومزج 250 ميليلتر ثقافة السائل إلى كريوتوبي التي تحتوي على 250 ميليلتر من الجلسرين 50%. فلاش تجميد الخلايا في النتروجين السائل، وحفظ السلالات في-80oC إلى أجل غير مسمى.
2. لتأكيد أن الطفرة القامع عنصر الموروثة جينياً، استخدام طرق عبور الجينية القياسية لعبور يفم ف (للسلالة الأبوية، المستخدمة في بداية الفحص قارئ لوحة) مع يفم S (للقامع، سلالة المحفوظة في النهاية للمقايسة قارئ لوحة). إذا كانت الطفرة القامع في الواقع عنصرا وراثيا الموروثة، يفم ف × يفم S ينبغي أن تسفر عن تيترادس التي لها مستعمرات هما النمط الظاهري المرض من السلالة الأبوية والمستعمرات اثنين معدل نمو المستردة القامع سلالة.
3. من صليب خطوة 3.2، اختيار المستعمرات الثلاث مع النمط الظاهري القامع (السلالة S) والمستعمرات الثلاث مع النمط الظاهري الأبوية (السلالة ف) من نفس الوراثية عبر (replicates البيولوجية 3 لكل منهما)، والمضي قدما في استخراج الحمض النووي الجينومي و تسلسل الخطوات أدناه.
   ملاحظة: الخطوات 3.2 و 3.3 يوصي بشدة، ولكن غير مطلوبة. بدلاً من ذلك، واحد نشر ثقافة السائل المستردة التي جمعت من 3.1 في المتوسط الغنية في المستعمرات واحدة، ثم عشوائياً اختيار المستعمرات الثلاث تريبليكاتيس البيولوجية لتسلسل الجينوم الجامعة دون مزيد من تأكيد الوراثية. في هذه الحالة، ينبغي أن تستخدم ثلاث تريبليكاتيس البيولوجية للسلالة الأبوية لمقارنة تسلسل الجينوم.

4-الجينوم الحمض النووي استخراج وإنتاج مكتبة وتسلسلها.

1. لاستخراج الحمض النووي، وإعداد مكتبة، وتسلسلها، تختار عشوائياً ثلاثة replicates البيولوجية كل سلالة يفم ف ، ويتطابق البيولوجية ثلاث سلالات فردياً نشأت يفم S كل من الصلبان الوراثية (الخطوة 3.2) أو من اللوحات التي انتشرت للحصول على مستعمرات واحد من سلالة S (ملاحظة الخطوة 3، 3).
2. زراعة سلالات في الثقافات 10 مل في الوسائط الغنية إلى سجل منتصف المرحلة (نقلت = 0.5 – 0.8، حول 0.75 – 1.2 × 10⁷ خلايا/مل)، واستخدام حاضنة تهتز لتنمو الثقافات السائل عند 30 درجة مئوية مع تهتز باستمرار في 250 دورة في الدقيقة. جمع الخلايا باستخدام الطرد المركزي عند 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق في 1000 x ز.
3. تعليق الخلايا الأعلاف في 400 ميليلتر من المخزن المؤقت لاستخراج الحمض النووي (2% X-100 تريتون، 1% الحزب الديمقراطي الصربي، كلوريد الصوديوم، 100 ملم 10 ملم تريس Cl (pH 8.0)، 1 مم Na₂-يدتا)، ثم قم بإضافة 400 ميليلتر من الزجاج الخرز و 400 ميليلتر من الكحول الفينول: كلوروفورم: إيسواميل 25:24:1. الدوامة بشدة لمدة دقيقة 2 في 4 درجات مئوية.
4. إضافة ميليلتر 200 إضافية من المخزن المؤقت لاستخراج الحمض النووي والمزيج بعكس عدة مرات. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية في 20,000 x ز.
5. نقل المرحلة المائية إلى أنبوب نظيف وإضافة 20 ميكروغرام من مزيج رناسي A/T1 واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
6. إضافة وحدة تخزين متساوية من الكحول الفينول: كلوروفورم: إيسواميل 25:24:1، وتدور لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية في 20,000 س ز، ثم نقل في مرحلة مائي لأنبوب نظيفة.
7. إضافة وحدة تخزين متساوية من كلوروفورم، تخلط بعكس عدة مرات، ثم تدور لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية في 20,000 س ز، ثم نقل في مرحلة مائي لأنبوب نظيفة.
8. الحمض النووي المتعجل مع مجلدين من الإيثانول 100% بالإضافة إلى 10% حجم 3 م نواك (pH 4.3) في-20 درجة مئوية على الأقل ح 2، ثم تدور لمدة 5 دقائق عند درجة 4 مئوية 000 20 شخص × ز وجمع بيليه.
9. أغسل بيليه (سرع DNA) مرتين مع برود 70% إيثانول (أجهزة الطرد المركزي في 20,000 س ز، دقيقة 5، 4 درجة مئوية) وتعليق بيليه في 50 ميليلتر من 10 ملم تريس المخزن المؤقت (درجة الحموضة 7.4).
10. استخدام الإعدادية مكتبة كيت (انظر الجدول للمواد) كل توصيات الشركة المصنعة لإعداد المكتبة تسلسل الجينوم كل.
    ملاحظة: نوصي بمجموعة المواد المدرجة في الجدول للمواد لأنه يسمح ببناء مكتبة الجينوم دون [بكر] تضخيم، مما يقلل من حدوث طفرات الخطأ التي تم إنشاؤها أثناء [بكر] تضخيم. وبالإضافة إلى ذلك، أثناء إعداد مكتبة الجينوم، لا تسمح الخرز إلى جافة تماما بتقصير حبة تجفيف الوقت إلى 1 – 2 دقيقة.
11. لإمالة المعلمات أثناء إعداد المكتبة، استخدم سونيكاتور مركزة (انظر الجدول للمواد) وتعيين عامل واجب إلى 20%، ذروة السلطة إلى 175 W، مع دورات 200 لكل دفعة، ووضع التردد كاسحة في 5.5oC إلى 6 درجة مئوية ل 45 س. بدلاً من ذلك، استخدم الحمض النووي والقص نظام تشوماتين (انظر الجدول للمواد) مع الإعدادات التالية: السعة 50% في 4 درجات مئوية مع وضع النبض، 15 s s 15 وعلى إيقاف لمدة 10 دقيقة، مع مجموع وقت تجهيز 20 دقيقة.
12. من الضروري للتعامل مع المواد الخطرة المستخدمة في هذه الخطوة بعناية. ويتشاور مع المناسبة صحائف بيانات السلامة المادية والمؤسسة الصحة البيئية ومكتب السلامة للتعامل مع نواك، الإيثانول، والكحول الفينول: كلوروفورم: إيسواميل 25:24:1 وكلوروفورم.
13. التسلسل المكتبات الجينية الناتجة عن ذلك. ينبغي أن يشمل ما يلي التسلسل الكامل ثلاث مرات على الأقل للجينوم الكامل مع القرار في مجموعة واحدة من النوكليوتيدات. ينصح انتهت لإقران التسلسل (أو أحدث التكنولوجيا).

5-المعلوماتية الحيوية التحليل للتعرف على الطفرات القامع

1. إجراء تحليل المعلوماتية التركيز على التغييرات الجينية التي يتم تحديدها دائماً بين الوالدين وسلالات قمعت يفم في جميع البيولوجية وإنشاء نسخ متماثلة.
   ملاحظة: عملية إكمال خط الأنابيب ويرد أدناه وصف، ولكن، بالإضافة إلى ذلك، ترد الملفين من السيناريو باش كنص عادي، fastq_to_vcf.sh و vcfprocess.sh، كمواد تكميلية لإظهار أمثلة لسير العمل من تجهيز ما يلي إلى متغير VCF الملفات وتجهيزها وتقاطع VCF الملفات، على التوالي.
2. تقليم قصير-يقرأ باستخدام القص (https://github.com/jbpease/shear) بعد أسطر الأوامر (جميع سائر الخيارات الافتراضية):
   shear.py-fq1 $FASTQ1-fq2 $FASTQ2-out1 $OUTFQ1-out2 $OUTFQ2 \
   -barcodes1 $BARCODE-تروسيق-تريمكوال منصة 20:20 \
   تريمبوليات-0-تريمامبيج-فيلتيرلينجث 50-فيلتيرونبيريد
3. يقرأ الخريطة إلى v2.30 الجينوم مرجع بومبي س. التي تم الحصول عليها من بومباسي (ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/pombase/pombe/Chromosome_Dumps/fasta/) استخدام التحالف v0.7.15²⁷. استخدام سطر الأوامر التالية (كافة الأخرى الخيارات الافتراضية):
   التحالف mem-تي $GENOME 8 $OUTFQ1 $OUTFQ2 > $SAM1
4. ضع ملفات المحاذاة سام عن طريق جتك خط الأنابيب أفضل الممارسات²⁸ لاستدعاء متغير باستخدام جتك v3.6²⁹، بيكاردتولس v2.5.0 (http://broadinstitute.github.io/picard)، وسامتولس v1.3.1³⁰. استخدم أسطر الأوامر والمعلمات (جميع سائر الخيارات الافتراضية) التالية:
   جافا--Xmx30g--جرة picard.jar "الإدخال أدوريبلاسيريدجروبس" = $SAM1 \
   إخراج = رغيد $BAMMARKED = رجلب 1 = رجبل lib01 = إيلومينا \
   رجبو = رجسم $BARCODE = $SAMPLENUMBER
   سامتولس فيكسماتي--يا أم $BAMMARKED $BAMFIXED
   سامتولس فرز أم-O-o $BAMSORTED/home/peasejb/tmp-تي $BAMFIXED
   فهرس سامتولس $BAMSORTED
   جافا--Xmx30g-GenomeAnalysisTK.jar-T جرة هابلوتيبيكالير \
   -ص $GENOME--أنا $BAMSORTED-genotyping_mode اكتشاف \
   --stand_emit_conf 10-stand_call_conf 30-o $VCFRAW
5. ضغط وفهرسة ملفات VCF استخدام تابيكس:
   $VCFRAW.vcf بجزيب
   $VCFRAW.vcf.gz تابيكس
6. مقارنة ملفات VCF بين الوالدين والقامع سلالات replicates التسلسل باستخدام بكفتولس v1.3.1²⁷. استخدم أسطر الأوامر والمعلمات (كل أخرى خيارات اليسار الافتراضي) التالية:
   isec بكفتولس-n + 1 $VCFPARENTAL1.gz $VCFPARENTAL2.gz $VCFPARENTAL3.gz \
   $VCFMUTANT1.gz $VCFMUTANT2.gz $VCFMUTANT3.gz > common_variants.list
   ملاحظة: هذا الأمر أسفر عن ملف ترميز مع أنماط ثنائي حيث سيكون تسلسل المتغيرات التي تظهر في الطور الأولى فقط ترميز ثنائي ك "000100"، الطور الثاني إلا بوصفها "000010"، جميع طفرات الثلاث ك "000111"، إلخ. تم إنشاء هذه الملفات لكل مجموعة من الوالدين والمسخ إجراء نسخ متماثل ملفات VCF.
7. ترجمة ملفات قائمة تقاطع البديل جنبا إلى جنب مع اسم الملف الملحقة بكل سطر باستخدام الأمر grep يونيكس:
   grep "." *.list > all.list
8. إنشاء إسناد ترافقي لقائمة البديل كاملة مع ملف التعليق التوضيحي الحالي GFF3 (ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/pombase/pombe/Chromosome_Dumps/gff3/schizosacchar omyces_pombe.chr.gff3) باستخدام برنامج نصي بايثون مخصص (variant_characterize.py) لتحديد مواقع SNP متسقة في مناطق (مترادفين وغير مترادفين) وتحيلها 5 و 3 ' ونكرنا ترميز البروتين.
   python3 variant_characterize.py-common_variants.list قائمة \
   -السينمائي schizosaccharomyces_pombe.chr.gff3 \
   -فاستا Schizosaccharomyces_pombe. ASM294v2.30.dna.genome.fa \
   -نمط 000100-خارج all.list.filter.000100
   كرر هذا تعديل البرنامج النصي--نمط ولاحقة لملف الإخراج (-خارج) استخدام الثنائي
   أنماط: 000010، 000001، 000110، 000011، 000101، و 000111
9. الجمع بين الإخراج من جميع هذه تشغيل البرنامج النصي في ملف مفصولة بعلامات جدولة، ليتم عرضه كجدول بيانات. يتضمن الجدول مشروحة من المتغيرات تلك التي تظهر في أحد أو كلا strain(s) متحولة بالنسبة للخلفية. ميدان العلم ثنائي يدل أما المظهر في سلالة متحولة واحدة (000100, 000010, 000001)، اثنين من سلالات متحولة (000011, 000101, 000110)، أو جميع سلالات متحولة الثلاثة (000111).
10. تحليل القوائم إخراج المشروح من المتغيرات غير موجود في عينات الأبوية، ولكن وجدت في واحد أو اثنين أو كل ثلاث عينات المسخ. التعليق التوضيحي ترمز إلى كل موقع جينومي وفئة من البديل (مرادف/غير-مرادفة في منطقة ترميز، 3/5 ' UTR، غير الترميز، إلخ.). من هذه القائمة من الطفرات المرشح، قد يكون مثالاً للمرشحين بقوة ذات الصلة متغير غير مترادفين ترميز التي تظهر دائماً في كل ثلاث سلالات. نوع آخر من المرشح القوى سيكون تراكم الطفرات سلالات متحولة الظهور قريبة من بعضها البعض أو داخل نفس الجين التنظيمية المختلفة غير مترادفين أو المفترضة.

النتائج

تظهر طفرات النمو البطيء الانتعاش المظهرية في ثقافة السائل
اخترنا ثلاث طفرات تشارك في مجموعة متنوعة من المسارات البيولوجية مع النمط الظاهري والمرضى، وبطيئة النمو،: AAA الأسرة ATPase Elf1، Deacetylase Clr6 هيستون واكسون تقاطع معقدة المكون Fal1. كانت السنة اللهب أثناء سلالة البرية من نوع وسلالات تحمل طفرات الجينات الثلاثة هذه التي قد تم باككروسيد مع السلالات البرية من نوع إلى مستعمرات فردية، ومستعمرات واحدة 16 اختيرت عشوائياً لتكون مثقف في الوسائط السائلة الغنية باستخدام لوحة 96-جيدا الموصوفة أعلاه. وسجلت منحنيات نمو المستعمرات الفردية في النقطة الزمنية الأولى (يوم 0) و لمدة 6 أيام مع الرصد المستمر باستخدام قارئ لوحة. كما هو متوقع، تظهر المستعمرات البرية من نوع لا تغييرات ملحوظة في منحنيات النمو بهم طوال التجربة³¹ (الشكل 1). جدير بالذكر أن أربع مستعمرات مع الخلفية elf1∆ وواحد fal1∆ مستعمرة تظهر تحولاً مثيرا في النمو من النمو البطيء لبعض مستويات متفاوتة من النمو مماثلة أو قريبة من مستعمرات البرية من نوع. جذريا، إظهار جميع clr6-1 طفرات انتعاش المظهرية متسقة، تنمو بمعدل أسرع في نهاية المقايسة³¹ (الشكل 1). تميز تعمل مختلف، نشير إلى السلالات الأصلية التي بطيئة النمو مثل "سلالات ف" (أو السلالات الأبوية) وعلى سلالات عرض الاسترداد المظهرية "S سلالات" (أو سلالات قمعت). يرجى ملاحظة أن الرقم 1 هو مثال لجولة واحدة من تجربة الفرز، ولا تمثل المكثفات غير مكملة الإجمالية المحددة والتسلسل في النتائج التمثيلية التالية.

ويعزى الانتعاش المظهرية إلى السمات الموروثة
يمكن أن تنمو بومبي س. فرداني في الوسائط الغنية، ولكن اثنين من السلالات فرداني مع رفيقه أنواع التزاوج التكميلية تحت المجاعة النيتروجين. الانقسام في انشطار الخميرة يستتبع جولة ازدواجية متبوعاً بجولتين من انقسام الخلية. نتائج دورة الجنسي في تشكيل أربعة جراثيم فرداني تحمل المادة الوراثية للسلالة الأبوية مع الفصل 2:2 من الصفات الوراثية التقيد بقواعد علم الوراثة مندلية الكلاسيكي (الشكل 2A). ونحن عندما نمت على نفس اللوحة لنفس المقدار من الوقت، أكد الفصل 2:2 عند كل معبر العودة قمعت سلالات (سلالات S) مع على السلالات الأبوية (سلالات ف)، مما أسفر عن 2 صغيرة (خلل النمو) و 2 كبيرة (القامع النمط الظاهري) المستعمرات. تظهر الأمثلة الفردية للخلايا elf1∆و clr6-1 و fal1∆ قمعت في الشكل 2. وقد أكدنا أن جميع سلالات S المعزولة تحمل عنصر monogenic الجينية الذي يقمع النمط الظاهري بطيئة النمو على سلالات ف (البيانات لا تظهر).

يحدد تسلسل الجينوم الجامعة بنجاح الطفرات القامع
كمثال على ذلك، قمنا باستخدام تسلسل الجينوم كله نهاية الاقتران لتحديد العناصر الوراثية المسؤولة عن استرداد المظهرية في سلالات elf1∆ S . هو وصف أكثر اكتمالا لتحليل البيانات المتاحة على الإنترنت³¹. بإيجاز، استخدمنا تريبليكاتيس البيولوجية لاثنين من سلالات ف elf1∆ الذي تم إنشاؤه بشكل مستقل والتكرارات البيولوجية من خمس مجموعات غير متكاملة من سلالات elf1∆ S ، كل منها يحتوي على المكثفات مختلفة. بعد أن حصلنا على قائمة بالمتغيرات المشروح من تحليل المعلومات البيولوجية (6.1-10)، ونحن الأولوية لفئات معينة من المتغيرات ذات الصلة بتحليلنا. وركزنا على الكشف عن التغيرات الجينية متسقة أن كانت متطابقة في جميع replicates البيولوجية الفردية سلالات elf1∆ S مقارنة سلالات ف elf1∆ الأبوية (الشكل 3 و تكميلية الجداول 1-4 ). وقد حددنا خمسة تغييرات نونسينونيموس في مناطق الأقراص المدمجة في جميع سلالات elf1∆ S مختلفة الخمس، بما في ذلك rli1 +، SPBPJ4664.02، cue2 + و rpl2702 +. S-A1 و S A2 تتضمن تحور SPBPJ4664.02، على الرغم من الطفرات تحدث في الأحماض الأمينية المختلفة. لأن SPBPJ4664.02 جين طويلة (11,916 النيوكليوتيدات) مع مئات يكرر، الطفرات لم يتمكنوا من تأكيد إجراء PCR متبوعاً بالتسلسل. S-A3 تحتوي على متحولة حذف في rli1 الذي يتسق في كل التكرارات البيولوجية. بيد المسخ لا يشترك فصل مع النمط الظاهري S في الخلفية elf1∆ . وقد حددنا متحولة cue2 (cue2-1) في S-B1، مع الأحماض الأمينية 396-400 في عداد المفقودين. S-B2 يحتوي على المسخ rpl2702 (rpl2702-1)، مما يؤدي إلى تغيير الأحماض الأمينية في موقف 45 من جليكاين إلى اسبارتاتي³¹. وتأكدت cue2-1 و rpl2702-1 المكثفات elf1∆ كما هو موضح أدناه.

يقوم بالتحقق من تأكيد القامع تحديد الطفرات الوراثية التوريث من النمط الظاهري الانتعاش
اثنين من التغييرات المحددة نونسينونيموس، cue2-1 و rpl2702-1، أعيد في المختبر باستخدام البروتوكولات القياسية للطفرات الموجهة من الموقع. سلالات متحولة مزدوجة cue2-1 ف elf1∆ و rpl2702-1 ف elf1∆ وقد عبرت على المجاملة ف elf1∆ سلالة³¹ (الشكل 4). إذا الطفرات نونسينونيموس، يتم تحديدها من خلال هذه الشاشة، كانت كافية لقمع ف elf1∆، ثم tetrads الناتجة سوف تظهر 2:2 الصغيرة بنسبة كبيرة في المستعمرات الناتجة عن جراثيم 4 في كل تتراد. وفي الواقع، أظهرت العبور الوراثي أن الطفرات القامع المحددة هي النجاح في القضاء النمط الظاهري بطيئة النمو ف elf1∆ والموروثة.

رقم 1: يمكن رصد المظهرية الانتعاش عن طريق تسجيل منحنيات النمو في قارئ لوحة. ووضعت ستة عشر مستعمرات واحدة البرية من نوع (WT)، elf1∆، clr6-1، و fal1∆ في صفيحة 96-جيدا. وسجلت منحنيات النمو على مدى فترة 24-ح والمستعمرات كانت إعادة المخفف يوميا في وسائل الإعلام الغنية. ويتضح خلل النمو بامتصاص منخفضة (نقلت) في نهاية فترة 24 ساعة في اليوم 0. سلالات phenotypically المستردة هي تلك التي عرض منحنى نمو مماثل، أو بالقرب منها، التي من نوع البرية على مدى فترة 24-ح في يوم 6. وأظهرت أربع مستعمرات elf1∆ومستعمرة واحدة من fal1∆، وجميع المستعمرات clr6- 1 مستويات مختلفة من استرداد المظهرية بعد 6 أيام. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

رقم 2: عبور الوراثية يمكن تأكيد أن الانتعاش المظهرية يعزى إلى اليل الموروثة واحد. (أ) عند انشطار الخميرة الخلايا تتعرض للمجاعة النيتروجين، خليتين فرداني بنوع التزاوج تكميلية يمكن أن تولد من الزيجوت الذي سبورولاتيس لتوليد tetrad الأبواغ 4. سيتم عزل المواد الوراثية الوالدين أثناء الانقسام الاختزالي التقيد بقواعد الوراثة مندلية. (ب) فينوتيبيكالي استرداد المستعمرات (S المسمى، لقمعها) مع ذكر الأنماط الجينية الأبوية قد عبرت مرة أخرى مع مستعمرتهم الأبوية مجاني (الذي يظهر لا انتعاش المظهرية، المسمى ف، للوالدين). الوراثية الصلبان عرض 2:2 صغيرة (ضعف اللياقة البدنية) إلى مستعمرات كبيرة (اللياقة البدنية المستردة) إثبات أن الانتعاش المظهرية الموروثة ويمكن أن يعزى إلى عنصر وراثية واحد. مربعات حمراء مستعمرات تحمل اليل القامع، ومربعات زرقاء مستعمرات تحمل اليل الأبوية. لقد تم تعديل هذا الرقم من ماراياتي et al., 2018³¹. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

رقم 3: تحليل البيانات تسلسل الجينوم على نطاق المنظومة لتحديد العناصر الجينية المسؤولة عن استرداد المظهرية. يتطابق البيولوجية ثلاث سلالات "P" الأبوية اثنين (فا وب ف)، وتحولت replicates البيولوجي اثنين من خمسة phenotypically تعافي سلالات "S" (S-A1 و S A2 S-A3 استردادها من فا؛ S-B1 و S-B2 من فب)، تم تعيين تسلسل والطفرات نظمت كقائمة لكل طفرة في سلالة المستردة بالمقارنة مع أن الجينوم السلالة الأبوية أنها مستمدة من (مثلاً، با مقابل S-A1، إلخ.). وكان العدد الإجمالي للكشف عن الطفرات عبر الجينوم الكامل لجميع هذه المقارنات العشوائية 660. تم تحديد ما مجموعة 44 الطفرات عندما اختيرت فقط الطفرات التي تحدث في كلا replicates البيولوجية من نفس السلالة "S". من أصل 44 الطفرات، كانت الطفرات 12 الإدراج/الحذف (إينديل) أو الطفرات غير مترادفين. من أصل 12 إينديل أو الطفرات غير مترادفين، حدثت خمس حالات في البروتين الترميز تسلسل. التحولات الخمسة يحتمل أن ترتبط بعنصر واحد الوراثية المسؤولة عن سلالات phenotypically المستردة: طفرة غير مترادفين في SPBPJ4664.02 وجدت في S-A1 و S-A2، العثور على إينديل في rli1 في S-A3، إينديل في cue2 الموجودة في S-B1، والطفرات غير مترادفين في rpl2702 الموجودة في S-B2. يتم تضمين معلومات تسلسل مفصل عن الطفرات والخلفية التي تمت تصفيتها في تكميلية الجداول 1-4. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 4: تأكيد للمكثفات يتم تحديدها من خلال تسلسل الجينوم الجامعة. تأكدت النتائج من تسلسل الجينوم كلياً بتوليد الطفرات بشكل مستقل وأداء تقاطع الوراثية للتأكد من استرداد المظهرية طريق عبور سلالة elf1∆ cue2-1 مع سلالة ف elf1∆ ، و elf1∆ rpl2702-1 مع سلالة elf1∆ ف . تظهر ثلاثة tetrads الرأسي الممثل. مربعات حمراء هي المستعمرات مزدوجة--المسخ (elf1 cue2-1، أو elf1 rpl2702-1)؛ مربعات زرقاء هي المستعمرات elf1∆ . لقد تم تعديل هذا الرقم من ماراياتي et al., 2018³¹. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

تكميلية الجدول 1- اضغط هنا لتحميل هذا الجدول. 

تكميلية الجدول 2 . اضغط هنا لتحميل هذا الجدول. 

3 الجدول الإضافي . اضغط هنا لتحميل هذا الجدول. 

تكميلية الجدول 4 . اضغط هنا لتحميل هذا الجدول. 

ترميز ملفات تكميلية . اضغط هنا لتحميل الملفات. 

Discussion

البروتوكول هو موضح هنا يمثل الرواية وشاشة بسيطة للطفرات العفوية القامع لا يمكن اكتشافها من خلال استرداد المظهرية من الطفرات التي تخول النمو البطيء في انشطار الخميرة، النمط الظاهري مميزة لما يزيد على 400 الجينات في بومبي س.، الدالة للكثير منها ما زال غير معروف^2،32. الأساليب السابقة اتخذت نهج أخرى للشاشة للطفرات القامع في الكائنات الحية الدقيقة، بما في ذلك استخدام والمطفرات²¹، أو تطبيق درجة حرارة التحول في الخلفيات متحولة حساسة لدرجة الحرارة³³. وفي المقابل، يظهر هذا البروتوكول أن الانتعاش المظهرية يحدث دون تدخل البيئية الكيميائية الإضافية، ويسلط الضوء على اللياقة البدنية وميزة ظهور الطفرات قمع الاستيلاء في نهاية المطاف على الموارد المتاحة في السائل الثقافة. تسمح هذه الشاشة عزلة المكثفات تجاوز أو المكثفات التفاعل لأنها فعالة بالنسبة لكل الطفرات الخسارة من دالة مثل elf1∆ أو fal1∆ والطفرات مثل clr6-1، ما دام ذلك طفرات إظهار عيوب اللياقة البدنية في ثقافة السائل.

حتى الآن، أظهرت جميع سلالات S المستردة التي كنا قد حققت درجات متفاوتة من الانتعاش المظهرية. كما كشف عن طريق معبر الوراثية، النمط الظاهري المستردة يعزى إلى عنصر واحد وراثية والموروثة (الأمثلة هو مبين في الشكل 2). هذا هو واحد من أهم مزايا هذا الأسلوب مقارنة بالشاشات القامع المستندة إلى المادة الكيميائية أو المستندة إلى الأشعة فوق البنفسجية، التي كثيرا ما تستهدف المكاني الجينوم متعددة. ومن الشائع لمراقبة واحد أو اثنين من المستعمرات استردادها من أصل 16 المستعمرات/سلالة (حوالي 10%) في غضون أسبوع واحد. ومع ذلك، نحن فعلت إشعار التقيد بطفرات معينة، مثل فقدان الوظيفة Rrp6، فرعية اكسوسومي النووية الخاصة، تسترد ابدأ إلى معدل النمو تقريبا البرية من نوع في الخلايا elf1Δ ³¹. ومن المرجح أن وظيفة Rrp6 يمكن فقط الحصول على تعويض جزئي من المكثفات، خلافا لوظيفة أخرى طفرات اختبارها، بما في ذلك fal1∆، التي تبين أن يسبب عيب هو الالتهاب من خلال وظيفة هامة في تنظيم الربط³⁴. ونحن نعتقد أن القامع البديلة فحص أساليب ستكون خاضعة لنفس المشكلة عندما يفج أدوار فريدة من نوعها، وعدم الاستبدال في نمو الخلايا.

قبل تنفيذ تسلسل الجينوم، الأمثل الخلف عبر المستعمرات phenotypically المستردة، حددت من اللوحة-القارئ، ومع الضغوط الوالدية لمسح الخلفية الوراثية والحصول على replicates البيولوجية. وباﻹضافة إلى ذلك، يحدد تسلسل العميق الجامع-الجينوم مئات التغييرات النوكليوتيدات واحدة، معظمها ليست متطابقة بين replicates البيولوجية التي تحظى باهتمام ضئيل للفحص. على سبيل المثال، وجدنا ما مجموعة 660 التعديلات الجينية عبر جميع الكروموسومات ثلاثة بين اثنين elf1Δ ف وخمس سلالات S مختلفة (الشكل 3). ونحن لم عادة يلاحظ الطفرات متماثلة بين التسلسل البيولوجية وإنشاء نسخ متماثلة لكل سلالة، مما يوحي بأن الطفرات الجديدة قد تنشأ خلال استزراع الخلايا elf1Δ قبل بناء مكتبة الجينوم أو قد تكون أخطاء عشوائية وعرض خلال بناء مكتبة وتسلسلها. ومن ثم عزل الطفرات التي تتسق عبر replicates البيولوجية جانبا مهما في تحديد المكثفات باستخدام تسلسل الجينوم كل نجاح.

حددنا وأكد المكثفات اثنين في مناطق الأقراص المدمجة في خمس سلالات S متسلسلة. على الرغم من أن تم الكشف عن الطفرات في SPBPJ4664.02 في S-A1 و S A2 سلالات، أنه من المستبعد أن SPBPJ4664.02 هو القامع صالحة لأن S-A1 و S A2 لا تتضمن القامع في نفس الجين كما أنها ليست متكاملة مع بعضها البعض ( البيانات لا تظهر). ونحن أيضا لم تؤكد rli1 في S-A3، وعدم فصل يشترك مع النمط الظاهري S عندما باككروسيد مع elf1Δ. وبدلاً من ذلك، وجدنا طفرات محددة في مناطق غير الترميز S-A1, S-A2 و S-A3. فمن الممكن أن هذه المناطق الجينوم غيرت الترميز غير التخفيف من النمط الظاهري elf1Δ ، التي سيجري تناولها في دراساتنا المستقبلية. مقارنة بالطرق التقليدية مثل مقايسة ربط، الذي قد يستغرق سنوات لخريطة طفرة جينية، حددنا المكثفات اثنين خلال شهرين بعد التأكد من أن عنصر مونوجينيك بسبب النمط الظاهري S. مع التطور السريع للتكنولوجيا تسلسل الجينوم كلياً، نحن متفائلون بأن هذا الأسلوب سوف تكون أكثر فعالية لتحديد الطفرات الوراثية متسقة في المستقبل المنظور.

وباختصار، يوفر هذا البروتوكول توجيهات خطوة بخطوة لتحديد الطفرات القامع لأي الجينات للفائدة مع وجود خلل النمو البطيء في ثقافة السائل بنجاح. البساطة من هذا الفحص يسمح بفحص واسعة النطاق متعددة الخلفيات الوراثية للفائدة مع القليل من التدريب العملي. هناك مجال زيادة أتمتة العملية باستخدام روبوت مناولة سائل لإجراء تخفيف اليومية. منذ التلاعب مختبر الكائنات الدقيقة يتطلب حتما النمو في الثقافة السائل، وهي عملية التي من طبيعتها انتقائية للياقة البدنية، فإننا نقترح أن هذا البروتوكول يمكن أن تطبق على نطاق واسع للكائنات نموذج السكانية الكبيرة الأخرى مثل البكتيريا و أنواع أخرى من الخميرة.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adenine, Powder	Acros Organics	147441000	Use at 75 mg/L to make liquid and solid rich media (YEA)
Bacteriology Petri Dish	Corning, Falcon	C351029	100 ×15 mm, use to grow strains to single colonies on solid rich media
D-Glucose Anhydrous, Powder	Fisher Chemical	D16-1	Use at 30 g/L to make liquid and solid rich media (YEA)
Difco Agar, Granuated	Becton, Dickinson and Co.	214530	Use at 20 g/L to make solid rich media (YEA)
DNA extraction buffer			2% Triton X-100, 1% SDS, 100 mM NaCl, 10 mM Tris-Cl (pH 8.0), 1mM Na2-EDTA
Focused-ultrasonicator	Covaris Inc.	S220	Alternatively, use QSonica Q800R sonicator/DNA and chromatin shearing system
Gen5 Data Collection and Analysis Software	Biotek, Inc.	GEN5SECURE	Or equivalent, must be compatible with the micro-plate reader, use to export data readings from the micro-plate reader
Hydrochloric Acid 1N, Liquid	Fisher Chemical	SA48-4	Use to adjust pH to 5.5 in liquid and solid rich media
Liquid Rich Media (liquid YEA)			30 g/L D-Glucose, 5 g/L Yeast Extract, 75 mg/L Adenine, pH adjusted to 5.5 with 1 M HCl
Microplate Reader, Synergy H1 Hybrid Multi-Mode Reader	Biotek, Inc.	BTH1MG	Or equivalent, must read visible light at 600 nm wavelength range
Rich Media agar plates (YEA plates)			30 g/L D-Glucose, 5 g/L Yeast Extract, 75 mg/L Adenine, 20 g/L Agar, pH adjusted to 5.5 with 1 M HCl.
RNase A/T1 mix	Thermo Fisher Scientific	EN0551	Use according to manufacturer recommendation
Sterile Polystyrene Inoculating Loop	Corning, Inc.	OS101	Or equivalent, use to transfer colonies from agar plates to 96-well plate
Sterile workspace and burners
Tissue Culture Plate, 96-well Optical Flat Bottom with Low Evaporation Lid	Corning, Falcon	C353072	Or equivalent, must have optical flat bottom for micro-plate ready
TruSeq DNA PCR-Free LT/HT Library Prep Kit	Illumina, Inc.	20015962	Use to prepare the whole-genome sequencing library
Yeast Extract, Powder	Fisher Chemical	BP1422-500	Use at 5 g/L to make liquid and solid rich media (YEA)