تحليل ثلاثي الابعاد للاستجابات متعددة الخلايا لتدرجات تشيمواتراكتانت

Summary

نحن وصف طريقه لبناء الاجهزه للثقافة 3D والتجريب مع الخلايا والهيكل العضوي متعدد الخلية. يسمح هذا الجهاز بتحليل الاستجابات الخلوية للإشارات القابلة للذوبان في البيئات المجهرية ثلاثية الابعاد مع تدرجات تشيمواتراكتانت محدده. Organoids هي أفضل من خلايا واحده في الكشف عن المدخلات الضعيفة الصاخبة.

Abstract

وقد أثارت القيود المختلفة لنظم الثقافة الخلية 2D الاهتمام في ثقافة الخلية 3D ومنصات التحليل ، والتي من شانها ان تحاكي بشكل أفضل التعقيد المكاني والكيميائي للانسجه الحية وتقليد في وظائف الانسجه المجرية. وقد يسرت التطورات الاخيره في تكنولوجيات التصنيع المجهري تطوير بيئات ثلاثية الابعاد في المختبر يمكن فيها دمج الخلايا في مصفوفة واضحة المعالم خارج الخلية (ECM) ومجموعه محدده من الجزيئات البيولوجية المرتبطة القابلة للذوبان أو المصفوفة. غير ان الحواجز التكنولوجية قد حدت من استخدامها علي نطاق واسع في مختبرات البحوث. هنا ، ونحن وصف طريقه لبناء أجهزه بسيطه للثقافة 3D والتجريب مع الخلايا والعضوية المتعددة الخلية في البيئات المجهرية 3D مع التدرج تشيمواتراكتانت محدده. ونحن نوضح استخدام هذه المنصة لتحليل استجابه الخلايا الظهاريه والعضوية العضوية لتدرجات عوامل النمو ، مثل عامل نمو البشرة (EGF). وكانت التدرجات EGF مستقره في الاجهزه لعده أيام مما ادي إلى تشكيل فرع الموجهة في الثدي العضوي. وقد سمح لنا هذا التحليل بالخلوص إلى ان استشعار التدرج الجماعي من قبل مجموعات من الخلايا أكثر حساسية مقارنه بالخلايا المفردة. ونحن أيضا وصف طريقه التصنيع ، والتي لا تتطلب مرافق التصوير الضوئي ولا تقنيات الطباعة الحجرية الناعمة المتقدمة. سيكون هذا الأسلوب مفيدا لدراسة السلوكيات الخلوية ثلاثية الابعاد في سياق تحليل التطور والحالات المرضية ، بما في ذلك السرطان.

Introduction

في البيئة الفسيولوجية ، يتم تضمين الخلايا في مصفوفة خارج الخلية (ECM) وتتعرض لكثرة من الجزيئات الحيوية. التفاعلات بين الخلايا والبيئة المجهرية المحيطة تنظم العمليات داخل الخلايا السيطرة علي الأنماط الظاهرية المتنوعة ، بما في ذلك الهجرة والنمو والتمايز والبقاء علي قيد الحياة^1،2. وقد تعلمت الكثير عن السلوكيات الخلوية في ثقافة خليه ثنائيه الابعاد التقليدية. ومع ذلك ، مع ظهور التصوير الانترافيتال والتجريب مع الخلايا المضمنة في الهلام المائي ثلاثي الابعاد ، تم التعرف علي الاختلافات الهامه في سلوكيات الخلايا في الثقافات المبسطة ثنائيه الابعاد في المختبر مقابل بيئات تشبه الانسجه ثلاثية الابعاد. بينما تتفاعل الخلايا مع ألياف ECM وتستشعر خواصها الميكانيكية داخل المصفوفة ثلاثية الابعاد ، فان الصلابة المادية للجل ليست متغيرا مستقلا تماما في نظام ثنائي الابعاد في المختبر. الابعاد يغير تشكيل التصاق البؤري ، مما يؤدي إلى شكل الخلية المختلفة والسلوك. وعلاوة علي ذلك ، تتعرض الخلايا علي سطح ثنائي الابعاد لإشارات اقل من الخلايا المفتوحة لجميع الاتجاات في الابعاد الثلاثية.

وقد زادت هذه القيود من الاهتمام بالانظمه ثلاثية الابعاد التي تمثل التعقيد المكاني والكيميائي للانسجه الحية والتنبؤ بشكل أفضل بوظائف الانسجه المجرية. وقد وضعت في اشكال كثيره من organoids كما الذاتي تجميع الهياكل الخلوية إلى خلايا تتخللها عشوائيا في ECM^3,4. وقد يسرت التطورات الاخيره في تكنولوجيات التصنيع المجهري ظهور أنواع مختلفه من نظم الثقافة ثلاثية الابعاد^{5، 6،7،8،9} لدراسة التغيرات الظاهرية الاستجابات الخلوية للإشارات القابلة للذوبان; بيد ان الحواجز التكنولوجية تحد من الاستخدام الواسع النطاق في مختبرات البحوث. في كثير من الحالات ، تتطلب عمليات التصنيع تقنيات التصوير الضوئي والمعارف الخلفية للطباعة الحجرية الناعمة. وعلاوة علي ذلك ، يجب السيطرة علي عوامل مختلفه لبناء جهاز بنجاح وتحقيق وظيفة الأمثل للجهاز علي مدي فتره طويلة من الزمن.

طريقتنا يصف كيفيه بناء جهاز PDMS 3D لدمج الخلايا والعضوية المتعددة الخلية في البيئة المجهرية 3D مع التدرجات تشيمواتراكتانت المحددة ومن ثم تحليل الاستجابات الظهاريه إلى EGF¹⁰. بياناتنا تكشف عن ان قدره organoids للرد علي التدرجات EGF الضحلة تنشا من اقتران الكيميائية بين الخلايا من خلال تقاطعات الفجوة. وهو يوحي بقدره العضو العضوي علي الكشف بدقه أكبر عن المدخلات الضعيفة والصاخبة المصنفة مكانيا. عمليه التصنيع لا تتطلب مرفق غرفه الأبحاث ولا تقنيات التصوير الضوئي. ومع ذلك ، فان جهاز PDMS ثلاثي الابعاد يتضمن العوامل الضرورية للبيئة الفسيولوجية ثلاثية الابعاد. هذه الطريقة ستكون مفيده لدراسة السلوكيات الخلوية ثلاثية الابعاد ولديها إمكانات بحثيه كبيره مع أنواع مختلفه من الخلايا ، تشيمواتراكتانتس ، وتركيبات ECM.

Protocol

وقد أجريت جميع الاعمال الحيوانية وفقا للبروتوكولات التي استعرضتها ووافقت عليها اللجنة المؤسسية للعناية بالماشية واستخدامها ، جامعه جونز هوبكنز ، كليه الطب.

1. تصنيع جهاز الجريان الوسطي

1. تصميم قناع العفن للجهاز PDMS باستخدام برنامج CAD 3D.
2. اطبع القالب باستخدام معدات التصوير الفراغي مع الراتنج المقاوم للحرارة.
   ملاحظه: تم تنفيذ الإجراءات الموصوفة هنا بواسطة خدمه طباعه ثلاثية الابعاد تجاريه.
3. اخلط جيدا محلول مونومير PDMS مع عامل المعالجة بنسبه 10:1. 3 مل من خليط PDMS كان مطلوبا لتصنيع الجهاز. الحجم الكلي يعتمد علي عدد من قوالب لتكون ملفقه.
4. Degas الخليط عن طريق تطبيق فراغ مع استخدام فراغ مختبر في المنزل أو مضخة فراغ في المجفف فراغ لمده 1 ساعة.
5. ربت سطح القالب مع شريط لاصق لأزاله الغبار ، ومن ثم صب خليط PDMS إلى العفن. إذا تم إدخال فقاعات في هذه العملية ، وتكرار التفريغ في المجفف فراغ. فقاعات المحاصرين بين أعمده من العفن يمكن ازالتها بدس لهم مع ابره حاده.
   ملاحظه: يجب ان يتم عمليه التفريغ في درجه حرارة الغرفة في غضون ساعة واحده أو اقل.
6. علاج PDMS عن طريق التدفئة في 80 درجه مئوية لمده 2 ساعة. السماح للقالب لتهدئه في درجه حرارة الغرفة.
7. قطع الحدود بين العفن و PDMS مع شفره ثم قشر قباله PDMS من العفن بعناية.
8. تقليم الجزء pdms لتناسب 22 مم × 22 ملم كوفيرسليب ولكمه ثقب في مدخل.
   ملاحظه: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا.
9. تنظيف الجزء pdms و 22 مم × 22 ملم كوفيرسليب عن طريق مسح الأسطح مع انسجه منخفضه الوبر و 70 ٪ الايثانول. ثم قم بازاله جزيئات الغبار الكبيرة عن طريق الضباب بشريط لاصق.
10. تعقيم الجزء pdms وكوفيرسليب اما عن طريق التعقيم (121 درجه مئوية لمده 8 دقائق الرطب ، 15 دقيقه جافه) أو التعرض للاشعه فوق البنفسجية لمده 1 ساعة.
11. علاج السطح السفلي للجزء PDMS وتغطيه زلة مع بندقية التفريغ كورونا لمده 5 دقائق في النسيج الثقافة هود ومن ثم السندات لهم معا.
    تحذير: وضع اي مواد غير الاجراء مثل رغوة البوليسترين في الجزء السفلي وأزاله جميع المواد التي تجري خلال هذه العملية. حقن الكولاجين في الجهاز علي الفور ، في غضون 5 دقائق ، بعد العلاج لزيادة الترابط بين هلام الكولاجين والزجاج coverslip.

2. اعداد الخلية: العزل العضوي الثديية الاوليه

ملاحظه: يمكن العثور علي تفاصيل العزلة organoid الثديية في العمل السابق¹¹. يمكن اعداد اي نوع من خليه واحده أو organoid وفقا لبروتوكولات العزلة/مفرزه الخاصة بهم.

1. فرم نسيج الغدة الثديية من الفئران مع مشرط حتى يرتاح النسيج ويهز لمده 30 دقيقه في 37 درجه مئوية في 50 مل من محلول كولاجيناز/التريبسين (10 مل لكل ماوس) في DEME/F12 تستكمل مع 0.1 غرام من التريبسين ، 0.1 غرام من كولاجيناز ، 5 مل من ال250 الواحدة ، والتي تبلغ μL 1 ميكروغرام/مل الانسولين ، و 50 μL من 50 ميكروغرام/مل جنتاميسين.
2. الطرد المركزي الحل كولاجيناز/التريبسين في 1,250 x g لمده 10 دقيقه أزاله ماده طافي عن طريق الطموح. تفريق الخلايا في 10 مل من DMEM/F12 ، وأجهزه الطرد المركزي في 1,250 x g لمده 10 دقيقه. بعد أزاله DMEM/F12 عن طريق الطموح ، أعاده تعليق الخلايا في 4 مل من DMEM/F12 تستكمل مع 40 μL من DNase (2 وحده/μL).
3. يهز حل DNase باليد ل 2-5 دقيقه ومن ثم أجهزه الطرد المركزي في 1,250 x g لمده 10 دقيقه.
4. منفصلة organoids من خلايا واحده من خلال أربعه سينتريفوجيشنز التفاضلية (النبض إلى 1,250 x g ووقف الطرد المركزي 3-4 s بعد ان تصل إلى السرعة المقصودة). بين كل نبضه ، يستنشق ماده طافي وأعاده تعليق بيليه في 10 مل من dmem/F12.
5. أعاده تعليق بيليه النهائي في المبلغ المطلوب من متوسط نمو DMEM/F12 مع 1 ٪ البنسلين/ستربتوميسين و 1 ٪ الانسولين-ترانسفيرين-السيلينيوم-X لاعداد الكولاجين.

3. اعداد الكولاجين والحقن

ملاحظه: يمكن اعداد أنواع أخرى من الهلام ECM وفقا لبروتوكولات دبق الخاصة بهم.

1. اعداد الكولاجين نوع I الحل (3.78 ملغ/مل) ، 10x DMEM ، 1 N NaOH الحل ، متوسط النمو العادي علي الجليد.
   ملاحظه: الاحتفاظ علي الجليد حتى يتم إكمال الاجراء.
2. أضافه 6 μL من 1 N NaOH الحل ، 200 μL من المتوسطة النمو و 50 μL من 10x DMEM إلى أنبوب الطرد المركزي قبل المبردة ومزيج الحل تماما.
3. أضف 425 μL من الكولاجين إلى المحلول المختلط مسبقا واخلطه جيدا عن طريق التنضيد.
4. الطرد المركزي خليط الكولاجين لفتره وجيزة (اقل من 5 ثوان) لفصل وأزاله فقاعات من الخليط.
5. الحفاظ علي محلول الكولاجين تحييد علي الجليد لمده 1 ساعة للحث علي تشكيل ألياف.
6. أضافه 50 μL من تعليق الخلية في خليط الكولاجين وتخلط جيدا.
   ملاحظه: تركيز الكولاجين النهائي هو 2 ملغ/مل.
7. حقن المحلول باستخدام ماصه pipet-x 200 μL من خلال مدخل الجهاز PDMS حتى يتم ملء الغرفة بأكملها في. إذا كان خليط الكولاجين يفيض من خلال الفجوات من الركائز ، وقطع هلام الكولاجين الزائدة مع شفره جراحيه حاده بعد gelation.
8. الحفاظ علي الجهاز في الحاضنة في 37 درجه مئوية مع 5 ٪ CO₂ لمده 1 ساعة للحث علي gelation.
9. ملء الخزانات علي كلا الجانبين مع متوسط النمو والحفاظ علي الجهاز في الحاضنة في 37 درجه مئوية مع 5 ٪ CO2 حتى يتم تنفيذ التصوير البؤري.

4-التصوير الثلاثي الابعاد والقياس الكمي

1. تثبيت الخلية الحية التصوير الثقافة الغرفة إلى المجهر البؤري وقبل تعيين درجه الحرارة و CO₂ إلى 37 درجه مئوية و 5 ٪ ، علي التوالي. للحصول علي الرطوبة ، أضافه الماء في خزان الغرفة ووضع مناديل مبلله في الغرفة إذا لزم الأمر.
2. وضع جهاز PDMS في الغرفة وأضافه EGF إلى واحد من الخزان باعتباره ' مصدر ' EGF في تشكيل التدرج. سيخدم الخزان الآخر ' بالوعة ' اللازمة لتطوير توزيع EGF المتدرج مكانيا. تمت أضافه 2.5 nM من EGF في بالوعة لجعل الانحدار من 0.5 nM/mm في هذه الدراسة.
3. تعيين نطاق Z-المكدس تغطي حجم العضوية من الاهتمام وبدء التصوير.
   تحذير: لتجنب السمية الضوئية ، جرب كثافة الليزر الأقل في التصوير البؤري أو استخدم تقنيات التصوير متعدد الفوتونات.
4. أعاده بناء صوره ثلاثية الابعاد من مكدسات الصور ثنائيه الابعاد باستخدام برامج تجاريه أو برنامج مخصص. قياس طول وزاوية الفروع الممتدة من الهيكل العضوي أو هجره الخلايا الفردية. هنا ، قم باجراء القياس الكمي عن طريق رسم الخطوط العريضة اليدوية حول الجسم العضوي باستخدام ImageJ.

النتائج

EGF هو منظم أساسي من النشاه المتفرعة في الغدد الثديية وتشيمواتراكتانت الحرجة توجيه هجره الخلايا الظهاريه الثدي في نمو السرطان الغازية. استخدمنا الاجهزه ميسوسكوبيك فلويديك المذكورة أعلاه لدراسة استجابه الخلايا لتحديد التدرجات egf (الشكل 1a، B)

Discussion

تم اجراء تصنيع قوالب PDMS باستخدام خدمه الطباعة 3D التجارية ، ولكن يمكن أيضا ان يتحقق من قبل الطابعة 3D نهاية عاليه في المنزل. من بين مختلف أساليب التصنيع ثلاثي الابعاد ، ينصح بالتصوير المجسم لتوليد العفن عالي الدقة. لان معالجه PDMS يحدث في درجه حرارة عاليه (80 درجه مئوية) ، يجب ان تكون المواد مقاو?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
22mm x 22mm coverslip	Fisher Scientific	12-542-B
Collagen I, Rat	Fisher Scientific	CB-40236
Collagenease	Sigma-Aldrich	C5138
COMSOL Multiphysics 4.2	COMSOL Inc		Used for simulating diffusion dynamics
10x DMEM	Sigma-Aldrich	D2429
DEME/F12	Thermo Fisher	11330032
DNase	Sigma-Aldrich	D4623
EGF Recombinant Mouse Protein	Thermo Fisher	PMG8041
Fetal Bovine Serum (FBS)	Life technologies	16140-071
Fiji-ImageJ			Used for measuring branching length and angles
Gentamicin	GIBCO	5750-060
IMARIS	Bitplane
Insulin	Sigma-Aldrich	19278
Insulin-Transferrin-Selenium-X	GIBCO	51500
Low-lint tissue	Kimberly-Clark Professional	Kimtech wipe
Mold Material	Proto labs	Accura SL5530
Mold printing equipment	Proto labs	Stereolithogrphy	Maximum dimension: 127mm x 127mm x 63.5mm, Layer thnickness: 0.0254mm
Mold printing Service	Proto labs	Custom	https://www.protolabs.com/
NaOH	Sigma-Aldrich	S2770
Penicillin/Streptomycin	VWR	16777-164P
Spinning-disk confocal microscope	Solamere Technology Group
Sylgard 184	Electron Microscopy Sciences	184 SIL ELAST KIT	PDMS kit
Trypsin	Sigma-Aldrich	T9935