طريقة إعداد عينة من المسح الضوئي وانتقال المجهر الإلكتروني لزوائد خنفساء الخشب

Summary

من أجل مراقبة البنية الفائقة للsensilla الحشرات ، تم عرض المسح الضوئي والمجهر الإلكتروني للإرسال (SEM و TEM ، على التوالي) بروتوكول إعداد العينة في الدراسة. تمت إضافة Tween 20 إلى المثبت لتجنب تشوه العينة في SEM. كان المجهر الفلوري مفيدًا لتحسين دقة التقطيع في TEM.

Abstract

وصف هذا التقرير طرق إعداد العينة التي تقوم بمسح وانتقال ملاحظات المجهر الإلكتروني ، التي تجلت من خلال إعداد الزوائد من الخنفساء الخشبية ، Chlorophorus caragana Xie & Wang (2012) ، لكلا النوعين من المجهر الإلكتروني. واستند بروتوكول إعداد عينة المجهر الإلكتروني المسح (SEM) على تثبيت عينة الكيميائية، والجفاف في سلسلة من حمامات الإيثانول، والتجفيف، وطلاء البولتر. بإضافة Tween 20 (Polyoxyethylene sorbitan laurate) إلى محلول الغسيل والمثبت ، تم غسل سطح جسم الحشرات من خنفساء الخشب بشكل أكثر نظافة في SEM. هذه الدراسة المجهرية الإلكترونية انتقال (TEM) إعداد عينة شملت سلسلة من الخطوات بما في ذلك التثبيت، وجفاف الإيثانول، والتضمين في الراتنج، وتحديد المواقع باستخدام المجهر الفلوري، والقسمة، وتلطيخ. Fixative مع Tween 20 تمكين اختراق جدار جسم الحشرات من خنفساء الخشب أكثر سهولة مما كان عليه من دون Tween 20 ، وبالتالي أفضل الأنسجة الثابتة والأعضاء في الجسم ، وبالتالي أسفرت عن ملاحظات المجهر الإلكتروني انتقال واضح من الهياكل الفائقة sensilla الحشرات. وكانت الخطوة التالية من هذا الإعداد تحديد مواقف sensilla الحشرات في العينة جزءا لا يتجزأ من كتلة الراتنج باستخدام المجهر الفلوري لزيادة دقة تحديد المواقع sensilla الهدف. هذا تحسين دقة تشريح.

Introduction

المسح المجهري الإلكترون هو أداة هامة في العديد من الدراسات مورفولوجيا، أن SEM يظهر هياكل السطح^1،2. نداء المجهر الإلكتروني ناقل الحركة هو أنه يمكن استخدامه لدراسة مجموعة واسعة من الهياكل البيولوجية على مقياس نانومتر، من الهندسة المعمارية للخلايا والبنية الفائقة للorganelles، إلى بنية المجمعات الجزيئية الكلية والبروتينات. TEM يظهر الهياكل الداخلية^3،4،5.

Coleoptera هي أكبر مجموعة من الحشرات ، بما في ذلك حوالي 182 أسرة و 350،000 نوع. معظم الحشرات الكولوبثران ، ولا سيما الخنفساء الخشبية ، تتغذى على النباتات ، وكثير منها آفات مهمة من الغابات وأشجار الفاكهة ، مما يسبب أضرارًا مدمرة للأشجار^6. في الوقت الحاضر ، والوقاية من ومكافحة السكان من الآفات على أساس نظرية الإيكولوجيا الكيميائية قد تلقت اهتماما متزايدا^7. أصبحت أساليب التحكم فعالة ومنخفضة السمية وخالية من التلوث فيرومون طريقة فعالة^8. دراسة مورفولوجيا sensilla وultrastructure من الحشرات هو جزء مهم من بحوث البيئة الكيميائية الحشرية. يتم استخدام المجهر الإلكتروني المسح الضوئي وانتقال (SEM و TEM، على التوالي) لتأثير كبير لدراسة مورفولوجيا والتشريح الداخلي. ومع ذلك ، أثناء إعداد عينات الحشرات للمجهر الإلكتروني (EM) ، قد تتأثر موضوعية وأصالة موقع المراقبة^9. بشكل عام ، يتطلب إعداد عينة SEM من الحشرات التنظيف ، تثبيت الأنسجة ، الجفاف ، الميتاسب ، التجفيف ، وطلاء السطاق^10. نظرًا للبيئة المعقدة التي تعيش فيها الخنفساء الخشبية ، غالبًا ما يكون لسطح الجسم ملوثات مختلفة وغالبًا ما تحتوي الزوائد عليها على العديد من السينسيلا الطويلة الجميلة أو الشعيرات. على وجه الخصوص ، لا تتوفر بعض الحطابين من تربية المختبرات ، والتي تم جمعها مباشرة في الحقل ، ثم وضعها في إصلاح السوائل لضمان نضارة ثم غسلها في المختبر. إذا تم إصلاح العينة أولاثم غسلها، فمن الواضح أنه من الصعب جدا لإزالة الحطام لأن الجلوتارالدهيد يصلح بقوة إلى العينة. Tween 20 هو السطحي^{11،12،13،14}، الذي يلعب دورا هاما في عملية الغسيل ، بما في ذلك الحد من التوتر السطحي للمياه وتحسين قابلية المياه على سطح الغسيل. في هذه الدراسة ، تمت إضافة Tween 20 إلى محلول التثبيت ومحلول تنظيف PBS لتقليل التوتر السطحي للسائل ، ومنع الأوساخ من الترسب على سطح الجسم من الخنفساء الخشبية ، مما جعل سطح الجسم أنظف في SEM.

باستخدام TEM ، يمكن تقطيع sensilla على أعضاء مختلفة من الحشرات إلى شرائح للكشف عن الهياكل الواضحة داخلها ، مما يوفر أساسًا لتحليل وظائف sensilla. عندما تكون الحشرة الخاضعة ، مثل الخنفساء الخشبية ، كبيرة ، وجدار جسمها يحتوي على درجة كبيرة من التصلب ، لذلك قد لا تشبع المثبت أنسجة الأعضاء بالكامل داخل جسم الحشرة. Tween 20 يمكن أن تعزز قدرة التشتت والتعليق من الأوساخ. في هذه الدراسة ، تمت إضافة Tween 20 إلى المثبت لتعزيز تغلغل السوائل المثبت في جدار جسم الحشرات من الخنفساء الخشبية ، وتجنب تشوه وانهيار البشرة^11،12،13. وبالإضافة إلى ذلك، وذلك باستخدام تكنولوجيا تشريح العامة، فمن الصعب تحديد بدقة أنواع مختلفة من sensilla، ولا سيما بالنسبة لبعض sensilla الصغيرة¹⁵. استنادًا إلى إعداد عينة TEM التقليدية ، جمعت هذه الدراسة بين المجهر الفلوري وSEM لتحديد موقف سينسيلا الحشرات في الكتلة المضمنة ، وبالتالي تحسين دقة التقطيع.

Protocol

تنبيه: راجع أوراق بيانات سلامة المواد الخاصة بالكواشف قبل استخدامها. العديد من المواد الكيميائية المستخدمة أثناء إعداد العينة سامة، مطفرة، مسرطنة، و / أو سامة. استخدام معدات الحماية الشخصية (القفازات، معطف المختبر، والسراويل كامل الطول، والأحذية مغلقة إصبع القدم) والعمل تحت غطاء الدخان أثناء التعامل مع العينة.

1. SEM إعداد عينة والتصوير

1. عينة التثبيت والتنظيف
   1. العمل في منطقة حيث C. كاراغانا تحدث، وجذب البالغين إلى الفخاخ الحقل الطعم مع النباتات الجاذبة، مثل الإيسوفورون¹⁶. الحفاظ على الهيئات النظيفة من الكبار C. كاراغانا في 0.1 مول^{لتر -1} الفوسفات العازلة المالحة (PBS, درجة الحموضة 7.2), 2.5% (wt/vol) الجلوتارالدهيد (اللامائية EM غراد), و 0.06% (فول/فول) Tween 20. إصلاح العينة في 4 درجة مئوية خلال عطلة نهاية الأسبوع.
   2. إزالة الهيئات من السائل حفظ وشطف في عازلة الفوسفات. باستخدام المجسم، وإزالة الزوائد وتنظيفها بالموجات فوق الصوتية (40 كيلو هرتز) في 0.1 مول L^-1 الفوسفات العازلة المالحة (درجة الحموضة 7.2) مع 0.06٪ (فول / فول) Tween 20 (PBST). بعد التنظيف لمدة 100 s، نقل العينة إلى المجهر للتحقق مما إذا كان نظيفا. في ظل الظروف العادية، نظيفة لمدة 400s للتأكد من أن العينة كانت نظيفة بما يكفي لمراقبة وليس التالفة.
2. عينة الجفاف، وتركيب والتجفيف
   1. تجفيف العينات باستخدام 20 دقيقة علاجات متتالية في 50٪ ، 60 ٪ ، 70 ٪ ، 80 ٪ ، 85 ٪ ، 90 ٪ ، 95 ٪ ، 100 ٪ ، و 100 ٪ (جميع فول / فول) الإيثانول. تحت المجهر، استخدم شريط لاصق ثنائي الوجهين الكربون لإصلاح بشكل منفصل 3 أسطح المراقبة (الظهرية البطنية والجانبية) على كعوب. لاحظ أنه يجب الحفاظ على جميع أسطح المشاهدة نظيفة وخالية من التلوث. ضع مرحلة العينة في طبق بتري يحتوي على هلام السيليكا المجفف لمدة 48 ساعة.
3. سبوتر معطف وعينة الإدراج
   1. باستخدام هيتاشي كوكي (E-1010) أداة التحجر الأيون، تدوير الصمام الرئيسي إلى موقف مفتوح، وإزالة غطاء غرفة العينة، ووضع العينة في الغرفة. وضع مفتاح الطاقة على، وكان ضوء READY على. تعيين الوقت Sputtering كما 45 ثانية، وسمك الطلاء كما 70.875 Å. مرة واحدة الميكانيكية مضخة فراغ مؤشر الطلب انخفض إلى أقل من 7، اضغط على التفريغ والبدء في رش البلاتين. في نهاية التجربة، قم بإيقاف تشغيل مصدر الطاقة وأخذ العينة من الغرفة. رذاذ سمك الفيلم: د = KIVt ("د" هو سمك الفيلم في وحدة من " Å "; K" هو ثابت، اعتمادا على المعدن المبعثر والغاز. على سبيل المثال، K من الهواء هو 0.07; "I" هو وحدة mA من تدفق البلازما; "V" هو الجهد المطبق في وحدة "KV". "t" هو الوقت في ثوان.
   2. إدراج كعب الروتين الذي يحتوي على العينة على مرحلة SEM. تأكد من أن مرحلة العينة مع كعب العينة كان ارتفاع كاف للسماح صورة جيدة. افتح برنامج SEM وحدد جهد التشغيل المطلوب، بدءًا من 20 كيلو فولت.

2. TEM إعداد عينة والتصوير

1. الحصول على العينة وإصلاحها كما هو الحال في الخطوات 1.1.1 و 1.1.2.
2. التنظيف والتثبيت الثانوي والجفاف
   1. إزالة الكبار C. كاراغانا من السائل حفظ. باستخدام المجسم، وإزالة الزوائد، وغسل العينات في PBST لمدة 3 ح، ومن ثم بعد إصلاحها في 1٪ (wt/vol) الأوميوم tetroxide في PBS ل1h في 25 درجة مئوية. تجفيف العينات باستخدام 20 دقيقة علاجات متتالية في 50٪ ، 60 ٪ ، 70 ٪ ، 80 ٪ ، 85 ٪ ، 90 ٪ ، 95 ٪ ، 100 ٪ ، و 100 ٪ (جميع فول / فول) الإيثانول في درجة حرارة الغرفة.
3. تضمين الراتنج والبلمرة
   1. تضمين العينات في الراتنج في قوالب تضمين مسطحة. كانت العينة في الجزء السفلي من اللوحة وتم وضعها في أقرب وقت ممكن إلى حافة الأخدود الاستراحة. ضع الملصق في الفارغة ثم احتضن الطبق الذي يحتوي على العينة عند درجة حرارة 60 درجة مئوية لمدة 72 ساعة، قم بإزالة الكبسولة من الحاضنة وتحقق من أن الراتنج قد تمبلر.
4. عينة المقطعة وتلطيخ
   1. مرة واحدة تأكد من أن العينة قد تم ترسيخها، ضع كل كتلة الراتنج تحت المجهر الفلوري وتصويرها تحت الضوء الأزرق. حرك مصدر الضوء الفلوري للمجهر حتى يشع العينة من الأعلى. تمكين sensilla في كتلة الراتنج أن يلاحظ بوضوح. تصوير وقياس المسافات لاستهداف sensilla(الشكل 1).
   2. الرجوع إلى صورة SEM من palps(الشكل 2A)،وقطع ما يقرب من كتلة الراتنج مع شفرة حلاقة لإغلاق مستقبلات الهدف(الشكل 2B).
   3. بعد ذلك ، باستخدام المجهر الفلوري الأزرق الخفيف ، صور كتلة الراتنج المقطوعة تقريبًا ، وضبط مصدر الضوء من الأعلى بحيث لوحظ sensilla بوضوح. الضوء الأخضر متحمس من الضوء الأزرق خلق ملاحظة مواتية. عند التصوير ، تمت إضافة الميكرومتر الموضوعي (DIV 0.01mm) إلى مرحلة المجهر الفلوري ، ثم تم قياس مسافة الهدف بواسطة برنامج ImageJ (المعهد القومي للصحة في الولايات المتحدة)(الشكل 2C). وقدم مسطرة الصورة من قبل أدوبي فوتوشوب CS5 (أدوبي سيستمز ، وشركة ، سان خوسيه ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية). ثم، لتشريح ultramicrotome، تعيين مسافة القطع، وذلك باستخدام 50-60 نانومتر سمك شريحة، حتى تم التوصل إلى موقف الهدف. استخدام المجهر الفلوري لتحديد المستقبلات المستهدفة.
   4. قم بتركيب الأقسام على شبكات نحاسية مغلفة بـ Formvar و100 شبكة ، ملطخة بخلات أورانال وسترات الرصاص.
      1. أولا، إضافة 3.75 ز خلات أورانال إلى 50 مل من 50 ٪ الميثانول. شبكات البقع مع حقنة مصفاة (0.45 ميكرومتر) من محلول مشبع من خلات uranyl في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة. تغطية المقاطع أثناء تلطيخ لمنع الرواسب الناجمة عن الضوء. شطف 2x في 50 ٪ الميثانول؛ 2x المياه المصفاة degassed.
      2. ثانيا، إضافة 0.02 غرام من سترات الرصاص إلى 10 مل من المياه المقطرة المزيلة للالغازات في أنبوب الطرد المركزي. إضافة 0.1 مل من 10 ن هيدروكسيد الصوديوم، وختم ويهز لتذوب. شبكات وصمة عار مع حل من سترات الرصاص لمدة 8 دقائق. الطرد المركزي قبل الاستخدام. يجب أن يتم تلطيخ في بيئة خالية من ثاني أكسيد الكربون لمنع تشكيل رواسب كربونات الرصاص. ضع قطرات من البقع على مربعات من أطباق بيتري البلاستيكية. شطف في المياه المصفاة degassed والجافة^17. مراقبة لهم عن طريق TEM تعمل في 80 كيلو فولت.

الشكل 1: مجهر الفلورسنت تصوير كتلة الراتنج مرفقة ملحق كاراغانا الكلوروبوهوروس. (أ)كتلة راتنج الهوائي؛ (ب)كتلة الراتنج في نهاية ovipositor. وأشار السهم إلى حافة كتلة الراتنج. الدائرة المنقطة تشير إلى sensilla الهدف. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: إجراءات طريقة موقع sensilla الدقيقة. (أ)الجزء الفرعي 4 من palp الفك العلوي من الكلوروبورورس كاراغانا, وأظهرت الدائرة منقط sensilla المستهدفة من قبل SEM. (B) الجزء الفرعي 4 من palp الفك العلوي من C. كاراغانا ينظر إليها المجهر الفلوري. أظهر السهم الأبيض الحافة المقطوعة تقريبًا لكتلة الراتنج وأظهرت الدائرة المنقط ة الموقع الدقيق. (C)المسافة الملحوظة من حافة كتلة الراتنج إلى موقع الهدف العلوي (28 ميكرومتر في هذه العينة). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

النتائج

باستخدام التنظيف والحل المثبت مع Tween 20 ، لوحظت صورة SEM أنظف من ذلك بدون Tween 20(الشكل 3). Tween 20 حل تحديد اخترقت حل تحديد glutaraldehyde في الأنسجة. وشوهد هيكل Microtubule بوضوح. صورة TEM للهيكل الداخلي للعينة كانت غير واضحة دون Tween 20(الشكل 4).

Discussion

في هذه المقالة ، قدمنا مخطط إعداد عينة للمسح الضوئي والمجهر الإلكتروني لنقل هينخة مملة الخشب. باستخدام ملحق الحشرات كموضوع دراسة تمثيلي ، أظهرنا العديد من التحسينات على طرق إعداد العينة التقليدية.

يتم استحلاب الزيت السائل المنفصل عن السطح الصلب إلى قطرات صغيرة ، والتي يمك?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anatomical lens	Chongqing Auto Optical limited liability company	1425277
Carbon adhesive tape	SPI Supplies, Division of Structure Probes, Inc.	7311
Carbon tetrachloride	Sigma	56-23-5
Copper grids	GilderGrids	G300
Disodium hydrogen phosphate	Sinopharm group chemical reagent co., LTD	10039-32-4
Ethanol	J.T. Baker	64-17-5
Flat embedding molds	Hyde Venture (Beijing) Biotechnology Co., Ltd.	70900
Fluorescence microscope	LEICA	DM2500
Glutaraldehyde	Sigma-Aldrich	111-30-8	Anhydrous EM Grade
Isophorone	Sigma	78-59-1
Lead citrate	Sigma	512-26-5
Methanol	Sigma	67-56-1
Monobasic sodium phosphate	Its group chemical reagent co., LTD	7558-80-7
Objective micrometer	Olympus	0-001-034
Osmium tetroxide	Sigma	541-09-3
Petri dish	Aldrich	1998
Razor blade	Gillette
Resin	Spurr	ERL4221
Scalpel	Lianhui	GB/T19001-2008
SEM	Hitachi	S-3400
Silica gel desiccant	Suzhou Longhui Desiccant Co., Ltd.	112926-00-8
Small brush	Martol	G1220
Sodium hydroxide	Sigma	1310-73-2
Sputter ion instrument	Hitachi Koki Co. Ltd., Tokyo, Japan	E-1010
Stereo microscope	Leica	EZ4 HD
TEM	Hitachi	H-7500
Tween 20	Tianjin Damao Chemical Reagent	9005-64-5
Ultramicrotome	Leica	UC6
Ultrasonic cleaner	GT Sonic	GT-X1
Uranyl acetate	Sigma	6159-44-0