جيل أورجانويد الجلد 3D من سلك المستمدة من الدم الناجم عن الخلايا الجذعية Pluripotent

Yena Kim; Ji Hyeon Ju

doi:10.3791/59297

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Summary

ونحن نقترح بروتوكول يوضح كيفية التفريق بين الخلايا الكيراتينيه المستمدة من الخلايا الجذعية المستحثة pluripotent والليفية وتوليد أورجانويد جلد 3D، استخدام هذه الخلايا الكيراتينيه والليفية. ويتضمن هذا البروتوكول خطوة إضافية لتوليد نموذج فئران أنسنة. هذه التقنية المقدمة هنا سيحسن البحوث الجلد.

Abstract

الجلد هو أكبر جهاز في الجسم، والعديد من الوظائف. الجلد ويعمل كحاجز مادي والحامي للجسم وينظم وظائف الجسم. بيوميميتيقا هو تقليد النماذج والنظم، وعناصر الطبيعة تهدف إلى حل المشاكل الإنسانية المعقدة¹. بيوميميتيقا الجلد أداة مفيدة للبحوث في مجال الأمراض في المختبر والمجراه في الطب التجديدي. وقد الخلايا الجذعية البشرية المستحثة pluripotent (إيبسكس) أن الخاصية غير محدود الانتشار وقدرة التمايز على الطبقات الجرثومية الثلاث. يتم إنشاء إيبسكس البشرية من الخلايا الأولية المختلفة، مثل خلايا الدم والخلايا الكيراتينيه والليفية وأكثر. فيما بينها، ظهرت الخلايا وحيدات النوى دم الحبل (كبمكس) كمصدر لخلايا بديلة من منظور الطب التجديدي متمكنة. كبمكس مفيدة في الطب التجديدي لكتابة (هلا) مستضد الكريات البيض البشرية ضروري للخلية النظام المصرفي. نحن نقدم طريقة للتفريق بين إيبسكس كبمك الكيراتينيه والليفية وجيل من أورجانويد الجلد 3D. المستمدة من اللجنة التوجيهية كبمك الكيراتينيه والليفية لها خصائص مماثلة لخط خلية الأولية. أورجانويدس 3D الجلد يتم إنشاؤها بواسطة تراكب طبقة البشرة على طبقة الجلد. بزرع أورجانويد الجلد ثلاثية الأبعاد هذه، يتم إنشاء نموذج فئران أنسنة. وتبين هذه الدراسة أن أورجانويد 3D جلد الإنسان المستمدة من اللجنة التوجيهية قد تكون أداة جديدة وبديلة لبحوث الجلد في المختبر والمجراه.

Introduction

الجلد يغطي سطح الأبعد من الجسم، ويحمي الأعضاء الداخلية. الجلد وظائف مختلفة، بما في ذلك حماية ضد العوامل الممرضة وامتصاص وتخزين المياه، وتنظيم درجة حرارة الجسم، والتغوط الجسم النفايات². ترقيع الجلد يمكن أن تصنف تبعاً لمصدر الجلد؛ وتسمى ترقيع الجلد من مانح آخر باستخدام اللوجرافتس، وترقيع الجلد للمريض باستخدام أوتوجرافتس. على الرغم من أن أوتوجرافت هو العلاج المفضل بسبب رفض منخفضة المخاطر، خزعات الجلد يصعب القيام به في المرضى الذين يعانون من آفات شديدة أو عدد غير كاف من خلايا الجلد. في المرضى الذين يعانون من حروق شديدة، ثلاث مرات عدد خلايا الجلد ضرورية لتغطية مساحات كبيرة. التوفر المحدود لخلايا الجلد من جسم المريض النتائج في الحالات التي يلزم فيها زرع اللوجينوس. Allograft يستخدم مؤقتاً حتى يمكن إجراء الزرع الذاتي حيث عادة ما رفضه من قبل النظام المناعي للمضيف بعد قرابة أسبوع واحد³. للتغلب على الرفض المناعي للمريض، يجب أن تأتي الطعوم من مصدر بنفس الهوية المناعية ك المريض⁴.

إيبسكس البشرية مصدرا ناشئة من الخلايا للخلايا الجذعية العلاج⁵. يتم إنشاء إيبسكس البشرية من خلايا جسدية، باستخدام عوامل إعادة برمجة مثل OCT4، SOX2، Klf4، وحركة ج⁶. استخدام إيبسكس البشرية ويتغلب على المسائل الأخلاقية والمناعية للخلايا الجذعية الجنينية (بتوليدا)^،من⁷⁸. وقد بلوريبوتينسي إيبسكس البشرية ويمكن أن تفرق في الطبقات الجرثومية الثلاث⁹. وجود هلا، عاملاً حاسما في الطب التجديدي، يحدد الاستجابة المناعية، وإمكانية رفض¹⁰. استخدام إيبسكس المستمدة من المريض يحل مشاكل رفض نظام المناعة والحد من الخلية المصدر. وظهرت أيضا كمصدر لخلايا بديلة للطب التجديدي¹¹كبمكس. هلا إلزامية كتابة، الذي يحدث أثناء كبمك المصرفية، يمكن استخدامها بسهولة للبحوث، وزرع الأعضاء. يمكن تطبيق إيبسكس هلا من نوع متماثل، وكذلك على نطاق واسع لمختلف المرضى¹². وهو مصرف كبمك-اللجنة التوجيهية الرواية واستراتيجية فعالة لعلاج الخلايا والطب التجديدي allogenic¹²^،^،من¹³¹⁴. في هذه الدراسة، ونحن نستخدم كبمك-إيبسكس، متباينة في الخلايا الكيراتينيه والليفية، وتكوين طبقات الجلد 3D طبقية. نتائج هذه الدراسة تشير إلى أن أورجانويد المستمدة من اللجنة التوجيهية كبمك 3D جلد أداة جديدة للبحوث في المختبر والمجراه في الجلد.

Protocol

وأجريت جميع الإجراءات التي تنطوي على الحيوانات وفقا "قانون رعاية الحيوانات المختبرية"، دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية، والمبادئ التوجيهية والسياسات المتعلقة "التجريب القوارض" التي تقدمها إلى "رعاية الحيوان المؤسسية" و استخدام اللجنة (إياكوك) من كلية الطب في الجامعة الكاثوليكية في كوريا. وأقر البروتوكول دراسة "مجلس المراجعة المؤسسية" "الجامعة الكاثوليكية كوريا" (كومك-2018-0191-01). إياكوك وقسم من مختبر الحيوانات (مجانين) جامعة كوريا الكاثوليكية، حرم سونجيوي المعتمدة مرفق مختبر "الحيوان التميز كوريا" كوريا إدارة الأغذية والعقاقير في الرابطة 2017 والمكتسبة لتقييم و الاعتماد الاعتماد الكامل الدولي الدولي رعاية الحيوانات المختبرية (آآلاك) في عام 2018.

1-الجلد تمايز خلية من الخلايا الجذعية المستحثة pluripotent

إعداد متوسطة
ملاحظة: تخزين جميع المتوسطة في 4 درجات مئوية في بيئة مظلمة لمدة تصل إلى 3 أشهر. تصفية جميع المتوسطة باستخدام نظام تصفية بولييثيرسولفوني 0.22 ميكرومتر قبل الاستخدام للتعقيم. جميع المتوسطة كانت متاحة في إجمالي حجم 500 مل.
1. إعداد KDM1 (keratinocyte التمايز متوسطة 1). المتوسطة (دميم تعديل النسر مزيج دولبيكو)/F12 المتوسطة (3:1) مع 2% مصل بقرى الجنين (FBS)، 0.3 حامض الأسكوربيك L ملمول/لتر، 5 ميكروغرام/مل الأنسولين و 24 ميكروغرام/مل الأدنين.
2. إعداد KDM2 (keratinocyte التمايز متوسطة 2). تعريف المزيج keratinocyte خالية من المصل المتوسط (انظر الجدول للمواد) مع 0.3 حامض الأسكوربيك L mmol/l و 5 ميكروغرام/مل الأنسولين الأدنين 10 ميكروغرام/مل.
  ملاحظة: keratinocyte محددة خالية من المصل المتوسط هو الأمثل لدعم النمو وتوسيع نطاق من الخلايا الكيراتينيه.
3. إعداد KDM3 (keratinocyte التمايز متوسطة 3). مزيج المعرفة المتوسطة خالية من المصل keratinocyte و keratinocyte خالية من المصل المتوسطة (1:1) انظر الجدول للمواد لمزيد من التفاصيل.
  ملاحظة: Keratinocyte خالية من المصل المتوسط هو الأمثل للنمو والحفاظ على الخلايا الكيراتينيه.
4. إعداد FDM1 (تنتجها الخلايا الليفية التمايز متوسطة 1). مزيج DMEM/F12 المتوسطة (3:1) مع 5% FBS، 5 ميكروغرام/مل الأنسولين، الأدنين 0.18 مم، وعامل نمو البشرة 10 نانوغرام/مليلتر (مماثلة).
5. إعداد FDM2 (تنتجها الخلايا الليفية التمايز متوسطة 2). مزيج DMEM/F12 المتوسطة (1:1) مع 5% FBS و 1% الأحماض الأمينية غير الأساسية.
6. إعداد EP1 (الظهارة المتوسطة 1). مزيج DMEM/F12 (3:1) مع 4 مم الجلوتامين ل 40 ميكرومتر الأدنين، 10 ميكروغرام/مل ترانسفيرين، الأنسولين 10 ميكروغرام/مل و 0.1% FBS.
7. إعداد EP2 (الظهارة المتوسطة 2). مزيج EP1 وكلوريد الكالسيوم 1.8 مم.
8. إعداد EP3 (الظهارة المتوسطة 3، كورنيفيكيشن المتوسطة). F12 ميكس المتوسطة مع 4 مم الجلوتامين ل 40 ميكرومتر الأدنين، 10 ميكروغرام/مل ترانسفيرين، الأنسولين 10 ميكروغرام/مل، 2% FBS وكلوريد الكالسيوم 1.8 مم.
جيل الجسم الجنيني
1. توليد كبمك-إيبسكس باستخدام البروتوكول هو موضح في دراسة سابقة¹².
2. معطف أطباق الثقافة، باستخدام فيترونيكتين. إعداد 5 مل معطف طبق 100 مم.
  1. ذوبان الجليد وريسوسبيند 50 ميكروليتر من فيترونيكتين 0.5 ملغ/مل (التركيز النهائي: 5 ميكروغرام/مل) مع 5 مل من المحلول الملحي المعقم مخزنة الفوسفات (PBS). إضافة الحل إلى الأطباق واحتضان في درجة حرارة الغرفة (RT) حاء 1 أسبيراتي مواد الطلاء قبل الاستخدام (عدم تجف).
3. الحفاظ على إيبسكس المستمدة من كبمك إلى 100 ملم المغلفة فيترونيكتين لوحة وتغيير المتوسطة اللجنة التوجيهية (E8) يوميا في 37 درجة مئوية مع شركة 10%₂.
4. إنشاء هيئات الجنينية (EBs) باستخدام البروتوكول هو مبين في دراسة سابقة¹⁵ (وصف بإيجاز على النحو التالي). قم بتوسيع إيبسكس عن طريق تغيير الوسيطة حتى وصلت الخلايا التقاء 80%. في التقاء 80%، إزالة المتوسطة ويغسل مع برنامج تلفزيوني.
5. علاج الخلايا مع 1 مل حامض الإيثيلين 1 مم (يدتا). احتضان عند 37 درجة مئوية مع 5% CO₂ ل 2 دقيقة وحصاد الخلايا باستخدام 3 مل متوسطة E8. الطرد المركزي الخلايا في 250 س ز 2 دقيقة.
6. نضح المادة طافية وتطبيق 5 مل من E8 المتوسطة للخلايا. عد الخلايا باستخدام هيموسيتوميتير ونقل 1 × 10⁶ خلايا لأنبوب مخروطي 15 مل جديدة. الطرد المركزي الخلايا في 250 س ز 2 دقيقة.
7. ريسوسبيند الخلايا المحولة مع 2.5 مل متوسطة تشكيل المجلس التنفيذي مع 10 ميكرومترات المرتبطة رو كيناز (روك) المانع. قطره 1 × 10⁴ خلايا (25 ميليلتر في إسقاط) على غطاء لوحة ثقافة نونكواتيد استخدام 10 – 100 ميكروليتر ماصة متعددة القنوات. نموذج 100 الحديدية من 1 × 10⁶ خلايا (1 × 10⁴ خلايا/1 EB). اقلب الطبق وتشبث الحبرية للغطاء.
  ملاحظة: هناك حاجة إلى مثبط روك خلال الخطوة مرفق في عملية الصيانة والتمايز. إضافة مثبطات روك فقط في مرحلة التجميع EB.
8. احتضان قطرات عند 37 درجة مئوية مع 5% CO₂ لمدة يوم واحد.
9. في اليوم التالي، الحصاد 100 الحديدية واستخدامها للتفرقة. تغسل غطاء لوحة مع اللجنة التوجيهية المتوسطة (المتوسطة E8) أو برنامج تلفزيوني والحصاد محتوياته إلى أنبوب مخروطي 50 مل. الحفاظ على الحديدية على RT لمدة 1 دقيقة ليستقر عليها. نضح المادة طافية، ريسوسبيند الحديدية مع المتوسطة E8، والمحافظة عليها في 90 مم طبق بيتري حتى التفريق بين.
التفريق بين إيبسكس كبمك في الخلايا الكيراتينيه
ملاحظة: لمخطط للتفريق بين keratinocyte من كبمك-إيبسكس، انظر الشكل 1ألف.
1. الحصاد 100 الحديدية إلى أنبوب مخروطي 50 مل مع اللجنة التوجيهية المتوسطة أو برنامج تلفزيوني. الحفاظ على RT لمدة 1 دقيقة ليستقر الحديدية. تأكد من أنها تسوية في الجزء السفلي من الأنبوبة المخروطية. نضح المادة طافية وريسوسبيند الحديدية مع E8 متوسطة مع العظم نانوغرام/مليلتر 1 بروتين morphogenetic 4 (BMP4). نقل الحديدية إلى 90 مم طبق بيتري والحفاظ عليها عند 37 درجة مئوية مع 5% CO₂ لمدة يوم واحد.
2. معطف أطباق الثقافة، باستخدام الكولاجين النوع الرابع. إعداد 5 مل من نوع الكولاجين الرابع معطف طبق 100 مم.
  1. ذوبان الجليد وريسوسبيند نوع الحل الكولاجين الرابع (التركيز النهائي: 50 ميكروغرام/مل) مع 0.05 N HCl. إضافة الحل إلى الأطباق واحتضان في RT حاء 1 نضح مواد الطلاء قبل الاستخدام (عدم تجف).
    ملاحظة: قبل استخدام اللوحات، غسل الأطباق 3 x مع برنامج تلفزيوني لإزالة أي حمض.
3. حصاد الحديدية (الخطوة 1.3.1) إلى أنبوب مخروطي 50 مل والمحافظة عليها في RT لمدة 1 دقيقة ليستقر عليها. تأكد من أنها تسوية في الجزء السفلي من الأنبوبة المخروطية ونضح المادة طافية وريسوسبيند الحديدية في 6 مل KDM1 مع 10 ميكرون روك المانع. نقل الحديدية للطبق المغلفة بالكولاجين 100 مم النوع الرابع.
  ملاحظة: إضافة مثبط روك فقط في مرحلة مرفق EB.
4. بين أيام 0 – 8، تغيير في المتوسط كل يوم إلى KDM1 مع 3 حمض الريتينويك ميكرومتر (RA) و 25 نانوغرام/مليلتر كل من BMP4 ولو. الحفاظ على الحديدية عند 37 درجة مئوية مع شركة 5%₂.
5. بين أيام 9-12، تغيير في المتوسط كل يوم إلى KDM2 مع 3 ميكرومتر را و 25 نانوغرام/مل BMP4 20 نانوغرام/مليلتر لو.
6. بين أيام 13 – 30، تغيير في المتوسط كل يوم إلى KDM3 مع 10 نانوغرام/مل BMP4 و 20 نانوغرام/مليلتر لو.
التفريق بين كبمك-اللجنة التوجيهية في الخلايا الليفية
ملاحظة: لمخطط للتفريق بين تنتجها الخلايا الليفية من كبمك-إيبسكس، انظر الشكل 2أ.
1. معطف أطباق الثقافة، باستخدام مصفوفة غشاء الطابق السفلي. إعداد 5 مل معطف طبق 100 مم.
  1. ذوبان الغشاء مصفوفة (التركيز النهائي: 600 نانوغرام/مل) وتمييع مع المتوسطة DMEM/F12. إضافة الحل إلى الأطباق واحتضان في 37 درجة مئوية للحد الأدنى 30 Aspirate مواد الطلاء قبل الاستخدام (عدم تجف).
2. الحصاد 100 الحديدية إلى أنبوب مخروطي 50 مل باستخدام ماصة مع اللجنة التوجيهية المتوسطة أو برنامج تلفزيوني. الحفاظ على RT لمدة 1 دقيقة ليستقر الحديدية. ضمان يستوطنون في الجزء السفلي من الأنبوبة المخروطية. إزالة المادة طافية.
3. ريسوسبيند الحديدية استخدام ماصة ميليلتر 1,000 في 6 مل FDM1 مع 10 ميكرون روك المانع. نقل الحديدية (بالمتوسط) إلى طبق المغلفة بمصفوفة 100 ملم غشاء واحتضان في 37 درجة مئوية مع 5% CO₂. تحديث FDM1 كل يوم لمدة 3 أيام.
  ملاحظة: إضافة فقط المانع روك في مرحلة مرفق EB.
4. إضافة العظام نانومتر 0.5 البروتين morphogenetic 4 (BMP 4) إلى FDM1 بين 4 و 6 أيام.
5. في يوم 7، تغيير في المتوسط إلى FDM2 كل يوم لمدة أسبوع واحد.
6. في يوم 14، أضف 1 مل من 1 مم يدتا واحتضان في 37 درجة مئوية مع 5% CO₂ للحد الأدنى 2 حصاد الخلايا مع 3 مل من FDM2 وأجهزة الطرد المركزي في 250 س ز 2 دقيقة إزالة المادة طافية وريسوسبيند الخلايا في 5 مل FDM1.
7. عد الخلايا باستخدام هيموسيتوميتير، ريسوسبيند 2 × 10⁶ خلايا مع FDM1 المتوسطة، ونقل الخلايا إلى الطبق نونكواتيد. الحفاظ على الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5% CO₂ وتغيير في المتوسط كل يوم.
8. معطف ثقافة الأطباق، استخدام النوع الأول من الكولاجين. إعداد 5 مل معطف طبق 100 مم. تمييع الحل الكولاجين من النوع الأول (التركيز النهائي: 50 ميكروغرام/مل) في حامض الخليك N 0.02. إضافة الحل إلى الأطباق واحتضان في RT حاء 1 أسبيراتي مواد الطلاء قبل الاستخدام (عدم تجف).
  ملاحظة: قبل استخدام اللوحات، غسل الأطباق 3 x مع برنامج تلفزيوني لإزالة الحامض.
9. في يوم 21، أضف 1 مل من 1 مم يدتا واحتضان في 37 درجة مئوية مع 5% CO₂ للحد الأدنى 2 حصاد الخلايا مع 3 مل من FDM1 وأجهزة الطرد المركزي في 250 س ز 2 دقيقة إزالة المادة طافية وريسوسبيند الخلايا في 5 مل FDM1. عد الخلايا باستخدام هيموسيتوميتير ونقل 2 × 10⁶ خلايا للنوع أنا طبق المغلفة بالكولاجين 100 ملم مع المتوسطة FDM1. الحفاظ على الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5% CO₂ وتغيير في المتوسط كل يوم.
10. في يوم 28، أضف 1 مل من 1 مم يدتا واحتضان في 37 درجة مئوية مع 5% CO₂ للحد الأدنى 2 حصاد الخلايا مع 3 مل من FDM1 وأجهزة الطرد المركزي في 250 س ز 2 دقيقة إزالة المادة طافية وريسوسبيند الخلايا في 5 مل FDM1. عد الخلايا باستخدام هيموسيتوميتير ونقل 2 × 10⁶ خلايا لطبق نونكواتيد مع FDM1 المتوسطة. الحفاظ على الخلية عند 37 درجة مئوية مع 5% CO₂ وتغيير في المتوسط كل يوم.
  ملاحظة: تتكاثر الليفية المستمدة من اللجنة التوجيهية مثل خط الخلية تنتجها الخلايا الليفية الأولية والمرور ما يصل إلى 10 مقاطع. في هذه الدراسة، استخدمنا الليفية المستمدة من اللجنة التوجيهية من اثنين إلى خمسة ممرات لمزيد من التحليل.

2-تطبيق الخلايا المتمايزة المستمدة من هيبسك

جيل من الجلد 3D أورجانويد
1. إعداد نوع معادلتها أنا الكولاجين على الجليد، واتباع توصيات الشركة المصنعة. كالتركيز النهائي، استخدام 3 مغ/مل للنوع الأول من الكولاجين (تركيز المخزون من النوع الأول الكولاجين 3.47 مغ/مل)، والتأكد من حجم الخليط النهائي 5 مل. حساب حجم 10 x PBS (الحجم النهائي/10 = 0.5 مل). حساب الحجم من النوع الأول من الكولاجين لاستخدامها (الحجم النهائي × تركيز الكولاجين النهائي/الأسهم تركيز الكولاجين = 5 مل × 3 مغ/مل/3.47 مغ/مل = 4.32 مل). حساب حجم هيدروكسيد الصوديوم N 1 (حجم الكولاجين تستخدم x 0.023 مل = 0.1 مل). حساب حجم dH₂س (الحجم النهائي-الحجم الكولاجين-حجم برنامج تلفزيوني 10 x-حجم هيدروكسيد الصوديوم ن 1 = 5 مل-مل 4.32-مل 0.5-0.1 مل = 0.08 مل). خلط محتويات الأنبوبة وإبقائه على الجليد حتى جاهزة للاستخدام.
2. إضافة 1 مل أدتا إلى الليفية المستمدة من اللجنة التوجيهية من الخطوة 1.4.10 واحتضان في 37 درجة مئوية مع 5% CO₂ دقيقة 2 حصاد الخلايا المنفصلة، عد الخلايا باستخدام هيموسيتوميتير، ونقل 2 × 10⁵ خلايا لأنبوب مخروطي 15 مل جديدة. الطرد المركزي في 250 س ز 2 دقيقة وإزالة المادة طافية. ريسوسبيند الخلايا الليفية المستمدة من اللجنة التوجيهية في 1.5 مل FDM1 وتحييد النوع أنا الحل الكولاجين (1:1).
  ملاحظة: مزيج الحل برفق لتجنب الفقاعات.
3. مكان إدراج غشاء على ميكروسكوبية 6-جيدا ونقل الخليط إلى الإدراج واحتضان في RT لمدة 30 دقيقة.
  ملاحظة: لا تقم بتحريك اللوحات.
4. بعد التأكد من جيلاتيون، إضافة 2 مل متوسطة إلى الجزء العلوي من إدراج و 3 مل إلى أسفل البئر. احتضان مصفوفة الليفية والكولاجين في 37 درجة مئوية مع 5% CO₂ 5-7 أيام، حتى تكتمل جيليشن، ولم تعد العقود.
5. وبعد جيلاتيون كاملة، فصل الخلايا الكيراتينيه المستمدة من اللجنة التوجيهية (من الخطوة 1.3.6) باستخدام يدتا. أضف 1 مل يدتا واحتضان في 37 درجة مئوية مع 5% CO₂ دقيقة 2 حصاد الخلايا المنفصلة، يعول عليها باستخدام هيموسيتوميتير، ونقل 1 × 10⁶ خلايا لأنبوب مخروطي 15 مل جديدة. أجهزة الطرد المركزي في 250 x ز لمدة 2 دقيقة.
6. إزالة المادة طافية وريسوسبيند 1 × 10⁶ خلايا في 50-100 ميليلتر من الكالسيوم منخفضة الظهارة المتوسطة 1 (EP1).
7. نضح المتوسطة كافة في المصفوفة (راجع الخطوة 2.1.5) والبذور 1 × 10⁶ خلايا من الخلايا الكيراتينيه المستمدة من اللجنة التوجيهية على كل طبقة تنتجها الخلايا الليفية. احتضان لوحة عند 37 درجة مئوية مع 5% CO₂ لمدة 30 دقيقة.
  ملاحظة: لا تقم بتحريك اللوحة ولا تقم بإضافة أي وسيلة لإلحاق keratinocyte.
8. إضافة 2 مل EP1 إلى الجزء العلوي من إدراج و 3 مل من EP1 إلى أسفل البئر.
9. بعد يومين، نضح المتوسطة كافة في لوحة إدراج غشاء وتغيير المتوسطة للكالسيوم العادي EP2 لمدة يومين.
10. وبعد يومين، نضح المتوسطة جميع وأضف 3 مل الوسط كورنيفيكيشن فقط لأسفل لإنشاء واجهة الهواء السائل.
11. الحفاظ على أورجانويد 3D الجلد لمدة تصل إلى 14 يوما في 37 درجة مئوية مع 5% CO₂ وتغيير في المتوسط كل يوم. حصاد أورجانويد 3D الجلد بقطع حافة الإدراج، واستخدامه لدراسة أخرى لتلطيخ والاختلاس الجلد.
الاختلاس الجلد
1. إجراء التخدير استنشاق على الإيماءة/مشمولان الفئران (ذكور، 6 أسابيع من العمر)، واستخدام طريقة قياسية من الناحية المؤسسية المعتمدة. للاختلاس الجلد، يحلق فرو الجلد الظهرية كل الماوس.
2. قم بإزالة مقطع 1 × 2 سم من الجلد للماوس، باستخدام مقص منحنى بالملقط.
3. مكان أورجانويد المستمدة من اللجنة التوجيهية كبمك الجلد 3D على موقع الخلل وخياطة باستخدام أسلوب خلع ملابس أكثر من التعادل مع خيوط الحرير.
4. مراقبة الفئران لمدة أسبوعين والتضحية بهم للتحليل النسيجي. تم التحقق من البروتوكول المصبوغة في الدراسات السابقة¹⁶.

النتائج

ويتألف الجلد، معظمها، من البشرة والأدمة. الكيراتينيه هي الخلية الرئيسية نوع البشرة والليفية نوع الخلية الرئيسية الأدمة. مخطط keratinocyte التمايز يظهر في الشكل 1ألف. وأبقى على إيبكسك كبمك في صحن فيترونيكتين المغلفة (الشكل 1ب). في هذه الدراسة، و?...

Discussion

إيبسكس البشرية وقد اقترحت كبديل جديد للطب التجديدي شخصية¹⁷. وتعكس المستمدة من المريض إيبسكس شخصية المريض من الخصائص التي يمكن استخدامها للنمذجة المرض وفحص المخدرات والزرع الذاتي¹⁸^،¹⁹. كما يمكن استخدام إيبسكس المستمدة من المريض من التغلب على الم...

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

وأيد هذا العمل بمنحه من كوريا الرعاية الصحية تكنولوجيا البحث والتطوير المشروع د، وزارة الصحة والرعاية الاجتماعية و "شؤون الأسرة"، جمهورية كوريا (H16C2177، H18C1178).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adenine	Sigma	A2786	Component of differentiation medium for fibroblast
AggreWell Medium (EB formation medium)	STEMCELL	05893	EB formation
Anti-Fibronectin antibody	abcam	ab23750	Fibroblast marker
Anti-KRT14 antibody	abcam	ab7800	Keratinocyte marker
Anti-Loricrin antibody	abcam	ab85679	Stratum corneum marker
Anti-p63 antibody	abcam	ab124762	Keratinocyte marker
Anti-Vimentin antibody	Santa cruz	sc-7558	Fibroblast marker
BAND AID FLEXIBLE FABRIC	Johnson & Johnson	-	Bandage
Basement membrane matrix (Matrigel)	BD	354277	Component of differentiation medium for fibroblast
BLACK SILK suture	AILEEE	SK617	Skin graft
CaCl2	Sigma	C5670	Component of epithelial medium for 3D skin organoid
Collagen type I	BD	354236	3D skin organoid
Collagen type IV	Santa-cruz	sc-29010	Component of differentiation medium for keratinocyte
Defined keratinocyte-Serum Free Medium	Gibco	10744-019	Component of differentiation medium for keratinocyte
DMEM, high glucose	Gibco	11995065	Component of differentiation medium
DMEM/F12 Medium	Gibco	11330-032	Component of differentiation medium
Essential 8 medium	Gibco	A1517001	iPSC medium
FBS, Qualified	Corning	35-015-CV	Component of differentiation medium for fibroblast and keratinocyte
Glutamax Supplement	Gibco	35050061	Component of differentiation medium for fibroblast
Insulin	Invtrogen	12585-014	Component of differentiation medium for fibroblast and keratinocyte
Iris standard curved scissor	Professional	PC-02.10	Surgical instrument
Keratinocyte Serum Free Medium	Gibco	17005-042	Component of differentiation medium for keratinocyte
L-ascorbic acid 2-phosphata sesquimagnesium salt hydrate	Sigma	A8960	Component of differentiation medium for keratinocyte
MEM Non-Essential Amino Acid	Gibco	1140050	Component of differentiation medium for fibroblast
Meriam Forceps Thumb 16 cm	HIROSE	HC 2265-1	Surgical instrument
NOD.CB17-Prkdc SCID/J	The Jackson Laboratory	001303	Mice strain for skin graft
Petri dish 90 mm	Hyundai Micro	H10090	Plastic ware
Recombinant Human BMP-4	R&D	314-BP	Component of differentiation medium for keratinocyte
Recombinant human EGF protein	R&D	236-EG	Component of differentiation medium for keratinocyte
Retinoic acid	Sigma	R2625	Component of differentiation medium for keratinocyte
T/C Petridish 100 mm, 240/bx	TPP	93100	Plastic ware
Transferrin	Sigma	T3705	Component of epithelial medium for 3D skin organoid
Transwell-COL collagen-coated membrane inserts	Corning	CLS3492	Plastic ware for 3D skin organoid
Vitronectin	Life technologies	A14700	iPSC culture
Y-27632 Dihydrochloride	peprotech	1293823	iPSC culture

References

Vincent, J. F., Bogatyreva, O. A., Bogatyrev, N. R., Bowyer, A., Pahl, A. K. Biomimetics: its practice and theory. Journal of The Royal Society Interface. 3 (9), 471-482 (2006).
Madison, K. C. Barrier function of the skin: "la raison d'etre" of the epidermis. Journal of Investigative Dermatology. 121 (2), 231-241 (2003).
Chen, M., Przyborowski, M., Berthiaume, F. Stem cells for skin tissue engineering and wound healing. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 37 (4-5), 399-421 (2009).
Dixit, S., et al. Immunological challenges associated with artificial skin grafts: available solutions and stem cells in future design of synthetic skin. Journal of Biological Engineering. 11, 49 (2017).
Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cells: past, present, and future. Cell Stem Cell. 10 (6), 678-684 (2012).
Yamanaka, S. Pluripotency and nuclear reprogramming. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 363 (1500), 2079-2087 (2008).
Scheiner, Z. S., Talib, S., Feigal, E. G. The potential for immunogenicity of autologous induced pluripotent stem cell-derived therapies. Journal of Biological Chemistry. 289 (8), 4571-4577 (2014).
Zimmermann, A., Preynat-Seauve, O., Tiercy, J. M., Krause, K. H., Villard, J. Haplotype-based banking of human pluripotent stem cells for transplantation: potential and limitations. Stem Cells and Development. 21 (13), 2364-2373 (2012).
Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
Terasaki, P. I. A brief history of HLA. Immunologic Research. 38 (1-3), 139-148 (2007).
Haase, A., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human cord blood. Cell Stem Cell. 5 (4), 434-441 (2009).
Rim, Y. A., et al. Recent progress of national banking project on homozygous HLA-typed induced pluripotent stem cells in South Korea. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (3), 1531-1536 (2018).
Nakatsuji, N., Nakajima, F., Tokunaga, K. HLA-haplotype banking and iPS cells. Nature Biotechnology. 26 (7), 739-740 (2008).
Pappas, D. J., et al. Proceedings: human leukocyte antigen haplo-homozygous induced pluripotent stem cell haplobank modeled after the california population: evaluating matching in a multiethnic and admixed population. Stem Cells Translational Medicine. 4 (5), 413-418 (2015).
Embryoid body formation from human pluripotent stem cells in chemically defined E8 media. StemBook Available from: https://www.stembook.org/node/6632 (2008)
Kim, Y., et al. Establishment of a complex skin structure via layered co-culture of keratinocytes and fibroblasts derived from induced pluripotent stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 217 (2018).
Diecke, S., Jung, S. M., Lee, J., Ju, J. H. Recent technological updates and clinical applications of induced pluripotent stem cells. The Korean Journal of Internal Medicine. 29 (5), 547-557 (2014).
Shi, Y., Inoue, H., Wu, J. C., Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cell technology: a decade of progress. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (2), 115-130 (2017).
Yoshida, Y., Yamanaka, S. Recent stem cell advances: induced pluripotent stem cells for disease modeling and stem cell-based regeneration. Circulation. 122 (1), 80-87 (2010).
Pham, T. L., Nguyen, T. T., Van Bui, A., Nguyen, M. T., Van Pham, P. Fetal heart extract facilitates the differentiation of human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells into heart muscle precursor cells. Cytotechnology. 68 (4), 645-658 (2016).
Stecklum, M., et al. Cell differentiation mediated by co-culture of human umbilical cord blood stem cells with murine hepatic cells. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 51 (2), 183-191 (2015).
Nam, Y., Rim, Y. A., Ju, J. H. Chondrogenic Pellet Formation from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. (124), e55988 (2017).
Rim, Y. A., Nam, Y., Ju, J. H. Application of Cord Blood and Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells for Cartilage Regeneration. Cell Transplantation. , (2018).
Shevde, N. K., Mael, A. A. Techniques in embryoid body formation from human pluripotent stem cells. Methods in Molecular Biology. 946, 535-546 (2013).
Shamis, Y., et al. iPSC-derived fibroblasts demonstrate augmented production and assembly of extracellular matrix proteins. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 48 (2), 112-122 (2012).
Bikle, D. D., Xie, Z., Tu, C. L. Calcium regulation of keratinocyte differentiation. Expert Review of Endocrinology & Metabolism. 7 (4), 461-472 (2012).
Bernstam, L. I., Vaughan, F. L., Bernstein, I. A. Keratinocytes grown at the air-liquid interface. In Vitro Cellular & Developmental Biology. 22 (12), 695-705 (1986).
Prunieras, M., Regnier, M., Woodley, D. Methods for cultivation of keratinocytes with an air-liquid interface. Journal of Investigative Dermatology. 81, 28-33 (1983).
Steven, A. C., Bisher, M. E., Roop, D. R., Steinert, P. M. Biosynthetic pathways of filaggrin and loricrin--two major proteins expressed by terminally differentiated epidermal keratinocytes. Journal of Structural Biology. 104 (1-3), 150-162 (1990).
Hohl, D., et al. Characterization of human loricrin. Structure and function of a new class of epidermal cell envelope proteins. Journal of Biological Chemistry. 266 (10), 6626-6636 (1991).
Bern, R., et al. Original and modified technique of tie-over dressing: Method and application in burn patients. Burns. 44 (5), 1357-1360 (2018).
Joyce, C. W., Joyce, K. M., Kennedy, A. M., Kelly, J. L. The Running Barbed Tie-over Dressing. Plastic and Reconstructive Surgery - Global Open. 2 (4), 137 (2014).
Wang, C. K., Nelson, C. F., Brinkman, A. M., Miller, A. C., Hoeffler, W. K. Spontaneous cell sorting of fibroblasts and keratinocytes creates an organotypic human skin equivalent. Journal of Investigative Dermatology. 114 (4), 674-680 (2000).
Yang, R., et al. Generation of folliculogenic human epithelial stem cells from induced pluripotent stem cells. Nature Communications. 5, 3071 (2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

146 pluripotent keratinocyte 3D

This article has been published

Video Coming Soon

Keep me updated: