تحويل الخلايا الجذعية مستحث البشرية المستحثة (iPSCs) في العمود الفقري الوظيفي الشوكي والجمجمة الحركية باستخدام متجات البكالوريا

Summary

يسمح هذا البروتوكول بالتحويل السريع والفعال للخلايا الجذعية مستحث المستحثة إلى الخلايا العصبية الحركية ذات الهوية الشوكية أو الجمجمة ، عن طريق التعبير البعيد عن عوامل النسخ من ناقلات الحمل المحبله.

Abstract

ونحن نقدم هنا وصفا لطريقه للحصول علي الخلايا العصبية الحركية العمود الفقري والجمجمة الوظيفية من المستحث البشرية المستحثة (iPSCs). يتم الحصول علي التحويل المباشر إلى الخلايا العصبية الحركية عن طريق التعبير عن الوحدات البديلة لعوامل النسخ ، وهي Ngn2 ، Isl1 و Lhx3 (NIL) أو Ngn2 ، Isl1 و Phox2a (خطه البرامج الخاصة). وتحدد هذه الخطة ، علي التوالي ، هويه الخلايا العصبية للمحركات الشوكية والجمجمة. يبدا البروتوكول الخاص بنا بإنشاء خطوط iPSC المعدلة التي يتم فيها دمج الصفر أو النعناع البشري بشكل ثابت في الجينوم عن طريق ناقل ترانسباك. ثم يتم الحث علي التعبير عن الجينات عبر الدوكسيسيكلين ويؤدي ، في 5 أيام ، إلى تحويل iPSCs إلى المبتدئين MN. النضج اللاحق ، لمده 7 أيام ، يؤدي إلى السكان متجانسة من MNs الشوكي أو القحفيه. طريقتنا يحمل العديد من المزايا علي البروتوكولات السابقة: انها سريعة للغاية ومبسطه. انها لا تتطلب العدوى الفيروسية أو مزيد من العزلة MN; فانه يسمح توليد مختلف السكان الفرعيين MN (العمود الفقري والجمجمة) مع درجه ملحوظة من النضج ، كما يتضح من القدرة علي إطلاق النار القطارات من إمكانات العمل. وعلاوة علي ذلك ، يمكن الحصول علي عدد كبير من الخلايا العصبية الحركية دون تنقيه من السكان المختلطة. ويمكن استخدام الخلايا العصبية المستمدة من iPSC العمود الفقري والجمجمة الحركية في النمذجة في المختبر من التصلب الجانبي الضموري والامراض العصبية الأخرى من الخلايا العصبية الحركية. وقد تمثل الخلايا العصبية الحركية المتجانسة موردا هاما لفحوصات المخدرات الخاصة بنوع الخلية.

Introduction

العصبية الحركية (MN) انحطاط يلعب دورا مسببا في الامراض البشرية مثل التصلب الجانبي الضموري (ALS) وضمور العضلات الشوكي (SMA). ويعد إنشاء نظم نموذجيه للخلايا المختبرية المناسبة تلخص تعقيدات المليون البشري خطوه هامه نحو وضع نهج علاجيه جديده. الخلايا الجذعية مستحث المستحثة (ipscs) ، والتي هبت مع خصائص تمايز التعددية الرائعة ، قد تم اشتقاقها الآن من عدد من المرضي المصابين بامراض الخلايا العصبية الحركية^1،2. وقد تم توليد خطوط iPSC اضافيه تحمل طفرات المسببة للامراض المرتبطة بامراض MN عن طريق تحرير الجينات ، بدءا من السيطرة "صحية" مستحث الخلايا الجذعية³. وتمثل هذه الخطوط أدوات مفيده لنمذجة الامراض في المختبر وفحص المخدرات ، شريطه توافر الأساليب المناسبة لتمايز iPSC في MNs. والأساس المنطقي وراء تطوير هذه الطريقة هو تزويد المجتمع العلمي المهتم بامراض MN ببروتوكول تفاضلي سريع وفعال يؤدي إلى MNs وظيفية ناضجه. الميزة الاولي لهذا الأسلوب هو الإطار الزمني للتنفيذ. نقطه أخرى ذات صله من قوه ياتي من القضاء علي اي خطوه تنقيه. وأخيرا ، يمكن استخدام البروتوكول لتوليد اثنين من السكان متميزة من الخلايا العصبية الحركية.

امكانيه توليد أنواع فرعيه مختلفه من MNs هي ذات الصلة بشكل خاص لنمذجة امراض MN. ليس كل الأنواع الفرعية MN عرضه بنفس القدر في ALS و SMA وظهور الاعراض في وحدات المحركات المختلفة يؤثر بشكل كبير علي التكهن. في ALS, بداية العمود الفقري مع اعراض بدءا من الأطراف العلوية والسفلية يؤدي إلى الموت في حوالي 3-5 سنوات⁴. علي العكس من ذلك ، بداية بولبار ، بدءا من انحطاط MNs القحفيه ، لديه اسوا تكهن. وعلاوة علي ذلك ، فان النسبة المئوية لبداية بولبار اعلي بكثير في المرضي الذين يعانون من طفرات في البروتينات الريبية النيبالية ملزمه TDP-43 من الافراد الذين يعانون من طفرات SOD1⁵. يعتمد تقريبا مجموع بروتوكولات التمايز MN البديلة علي نشاط حمض الريتينويك (RA) ، الذي يضفي علي الحرف الفقري التفريق بين ipscs^6،7،8. وهذا يحد من امكانيه دراسة العوامل الجوهرية ، التي يمكن ان تكون وقائية في الأنواع الفرعية المحددة من الملايين^9،10.

وتمشيا مع العمل السابق في الخلايا الجذعية الجنينية الفئران¹¹, وقد أظهرنا مؤخرا ان في الإنسان ipscs التعبير عن Ngn2, Isl1 و LHX3 (NIL) يدفع هويه العمود الفقري MN, في حين ان Ngn2 و Isl1 زائد Phox2a (الخطة الخاصة) تحديد الجمجمة MNs¹². التالي قمنا بتطوير بروتوكول فعال ، مما يؤدي إلى إنتاج MNs البشرية التي وهبها خصائص وظيفية في تحول 12 يوما. والغرض من هذه الطريقة هو الحصول ، في اطار زمني قصير ودون الحاجة إلى تنقيه (علي سبيل المثال ، من قبل FACS) ، والسكان الخلايا المخصبة للغاية ل MNs مع العمود الفقري أو الجمجمة الهوية.

Protocol

1. صيانة iPSCs البشرية

1. اعداد لوحات مصفوفة مغلفه
   1. ذوبان واحد 5 مل قارورة من مصفوفة (انظر جدول المواد) في 4 °c بين عشيه وضحيها. المخزونات الاصليه مصفوفة تاتي في تركيزات الأسهم المختلفة ويتم اجراء الارصفه وفقا لعامل التخفيف المشار اليه في ورقه البيانات ، محدده للكثير الفردية. من المهم الحفاظ علي القارورة والأنابيب الباردة الجليد لمنع البيع المبكر للمصفوفة. الاستغناء عن مصفوفة في الارصفه في البرد قبل المبردة علي الجليد. تجميد الارصفه غير المستخدمة عند-20 درجه مئوية.
   2. ضعي واحده علي الثلج لمده 2 ساعة لأذابه الجليد.
   3. تمييع قسامه من مصفوفة مع 20 مل من dmem الباردة/F12 في أنبوب مخروطي 50 ml.
   4. تخلط جيدا والاستغناء 1 مل من مصفوفة المخفف في اطباق 35 مم (تعادل المبالغ لكل مساحة السطح من الاطباق الأخرى).
   5. حافظ علي الاطباق التي تحتوي علي مصفوفة مخففه لمده 1 ساعة في درجه حرارة الغرفة للسماح بالطلاء.
      ملاحظه: الاطباق ، مختومه مع parafilm ، يمكن تخزينها في 4 درجه مئوية لمده تصل إلى 2 أسابيع.
2. اعداد حل الأسهم (20 مل) و 1x العمل القسامات من كاشف التفكك الخلية لطيف (انظر جدول المواد).
   1. تذوب مسحوق إلى 10 ملغ/مل في الخدمات التلفزيونية (Ca^{2 +}/mg^{2 +} مجانا).
   2. تصفيه تعقيم من خلال غشاء فلتر 0.22 μm.
   3. اعداد 20 الارصفه (1 مل لكل منهما) وتخزين في-20 درجه مئوية.
   4. قبل الاستخدام ، تمييع قسامه واحده في الخدمات التلفزيونية (Ca^{2 +}/mg^{2 +} مجانا) إلى 1 ملغ/مل (1x العمل قسامه).
      ملاحظه: يمكن تخزين 1x العمل القسامات في 4 درجه مئوية لمده تصل إلى 2 أسابيع.
3. المرور iPSCs الإنسان.
   1. قبل البدء: إذا تم تخزينها في 4 درجه مئوية ، قبل الحارة مصفوفة المغلفة لوحات في الحاضنة في 37 درجه مئوية لمده 20-30 دقيقه. قبل الحارة في درجه حرارة الغرفة مقدار iPSC الإنسان المتوسطة (انظر جدول المواد) اللازمة. قبل الحارة DMEM/F12.
   2. شفط الثقافة المتوسطة.
   3. شطف iPSCs مع تلفزيوني (Ca^{2 +}/Mg^{2 +} مجانا).
   4. أضافه 1x حل التفكك لطيف (0.5 mL لطبق 35 مم). احتضان في 37 درجه مئوية حتى حواف المستعمرات تبدا في فصل من لوحه ، وعاده ما 3-5 دقيقه.
   5. يستنشق حل التفكك لطيف ، والحرص علي عدم فصل مستعمرات iPSC.
   6. غسل الخلايا مع DMEM/F12 (2 مل لطبق 35 مم) ويستنشق الحرص علي عدم فصل الخلايا. كرر هذه الخطوة مره أخرى.
   7. أضافه الإنسان iPSC المتوسطة (1 مل لصحن 35 mm).
   8. فصل بلطف المستعمرات قباله مع رافع الخلية ونقل إلى أنبوب 15 مل.
   9. كسر كتل الخلايا بلطف عن طريق التنضيد صعودا وهبوطا مع P1000 pipettor 3-4 مرات.
   10. يستنشق ماده طافي من لوحه (ق) مصفوفة المغلفة.
   11. بذره الخلايا في المناسبة ثقافة حجم من [أبسك] انسانيه متوسطه. يمكن ان تختلف نسبه تقسيم من خط إلى خط وحوالي 1:4-1:8. تغيير المتوسطة يوميا.

2-توليد خطوط iPSC المحفزة لنيل الصفر والنعناع الخاص

1. الخلية الناقلة.
   1. شطف الخلايا مع الخدمات التلفزيونية (Ca^{2 +}/Mg^{2 +} مجانا).
   2. أضافه كاشف التفكك الخلية (انظر جدول المواد) (0.35 mL لطبق 35 مم) واحتضان في 37 درجه مئوية حتى يتم فصل الخلايا المفردة (5-10 دقيقه).
   3. بلطف إكمال فصل الخلايا عن طريق التعبئة صعودا وهبوطا مع P1000 pipettor 3-4 مرات.
   4. جمع في أنبوب 15 مل وأضافه تلفزيوني (Ca^{2 +}/Mg^{2 +} مجانا) إلى 10 مل. عد الخلايا.
   5. بيليه 10⁶ خلايا وأعاده التعليق في 100 ميكرولتر من R العازلة (المدرجة في الخلية الكهربائية عده ، انظر جدول المواد).
   6. أضافه الحمض النووي البلازميد للتنميل: 4.5 ميكروغرام من ناقلات ترانسسيابل (epb-bsd-tt-النيل أو epb-bsd-tt-الخطة الخاصة¹²) و 0.5 ميكروغرام من الحشرات ترانسميد البلازما¹³.
   7. Transfect مع نظام الكهرباء الخلية (انظر جدول المواد) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة وكما هو موضح سابقا³ مع المعلمات التالية: 1,200 V الجهد ، 30 مللي عرض ، 1 نبض. بذره الخلايا في الإنسان iPSC المتوسطة تستكمل مع 10 μM Y-27632 (المانع روك ، انظر جدول المواد) في طبق المغلفة مصفوفة 6 مم.
2. اختيار مع المضادات الحيوية.
   1. بعد يومين من التحويل ، أضف 5 ميكروغرام/مل من بلاستيديبين إلى الوسط الثقافي.
   2. معظم الخلايا غير المتحولة سوف يموت في غضون 48 h من الاختيار بلتكيدبين. الحفاظ علي الخلايا في بلاستيديبين لمده لا تقل عن 7-10 يوما لمكافحه-تحديد الخلايا التي لم تدمج الجينات المتحولة في الجينوم.
   3. الحفاظ علي الخلايا المقسمة بشكل ثابت كمجموعه سكانية مختلطة ، تتكون من خلايا ذات عدد مختلف من الجينات المتحولة ومواقع التكامل المختلفة ، أو تعزل المستنسخات المفردة.
   4. اعداد طبق إضافي للتحقق من التعبير الفعال عن الجينات ، علي 1 ميكروغرام/مل دوكسيسيكلين التعريفي ، بواسطة RT-PCR مع الإشعال الخاصة transgenes لNgn2 (إلى الامام: TATGCACCTCACCTCCCCATAG ؛ العكس: GAAGGGAGGAGGGCTACT) ، كما هو موضح سابقا¹².
   5. في هذه المرحلة ، تجميد المخزون من الرواية الصفرية وخطوط النعناع الكتروني في تجميد المتوسطة لل Ipsc البشرية (انظر جدول المواد).

3. الحركية العصبية التمايز

1. انفصال الخلايا مع كاشف تفكك الخلية كما هو موضح (الخطوات 2-1-1.-2-1-3.). جمع الخلايا المنفصلة في أنبوب 15 مل وتمييع مع 5 مجلدات من DMEM/F12. بيليه الخلايا وأعاده التعليق في الإنسان iPSC المتوسطة تستكمل مع مثبطات الصخور 10 μM. عد الخلايا والبذور علي الاطباق المغلفة مصفوفة في كثافة 62,500 الخلايا/سم².
2. في اليوم التالي, استبدال المتوسطة مع DMEM/F12, تكمله 1x مستقره L-الجلوتامين التناظرية, 1x الأحماض الامينيه غير الاساسيه (NEAA) الملحق ثقافة الخلية و 0.5 x البنسلين/ستربتومايسين, وتحتوي علي 1 ميكروغرام/مل دوكسيسيكلين. هذا اعتبرت بما ان يوم 0 من تمييز. في اليوم 1 ، وتحديث المتوسطة ودوكسيسيكلين.
3. في اليوم 2 ، تغيير المتوسطة إلى Neurobasal/B27 المتوسطة (المتوسطة العصبية تستكمل مع 1x B27 ، 1x مستقره L-الجلوتامين التناظرية ، 1x NEAA و 0.5 x البنسلين/ستربتومايسين) ، التي تحتوي علي 5 μM DAPT ، 4 μM SU5402 و 1 ميكروغرام/مل دوكسيسيكلين (انظر جدول المواد ). تحديث المتوسطة ودوكسيسيكلين كل يوم حتى اليوم 5.
4. اليوم الخامس: تفكك الخلايا مع كاشف تفكك الخلية (انظر جدول المواد).
   1. شطف الخلايا مع الخدمات التلفزيونية (Ca^{2 +}/Mg^{2 +} مجانا).
   2. أضافه كاشف التفكك الخلية (0.35 mL لطبق 35 مم) واحتضان في 37 درجه مئوية حتى يفصل الخلية بأكملها أحاديه الطبقة من الطبق. لاحظ انه لن يتم فصل الخلايا المفردة اثناء الحضانة.
   3. أضافه 1 مل من DMEM/F12 وجمع الخلايا في أنبوب 15 مل.
   4. بلطف إكمال فصل الخلايا عن طريق التعبئة صعودا وهبوطا مع P1000 pipettor 10-15 مرات.
   5. أضف 4 مل من DMEM/F12 وعد الخلايا.
   6. في هذه المرحلة ، وتجميد الحركية العصبية المولدات في خليه تجميد المتوسطة (انظر جدول المواد) ، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
   7. بيليه الخلايا وأعاده التعليق في المتوسطة العصبية (Neurobasal/B27 المتوسطة تستكمل مع 20 نانوغرام/مل BDNF ، 10 نانوغرام/مل GDNF و 200 ng/mL حمض L-الاسكوربيك ، انظر جدول الموادs) تستكمل مع مثبطات الصخور 10 μM.
   8. بذره الخلايا علي [بولي-اورنيثين]/laminin-أو بدلا من ذلك علي [ماتريكس-كتد] دعامات في الكثافة من 100,000 خلايا/سم². استخدام μ الشرائح البلاستيكية يدعم مع كوفيرسليب البوليمر (انظر جدول المواد) للتحليل المناعي.
5. في اليوم 6 ، تغيير المتوسطة مع الخلايا العصبية الطازجة المتوسطة خاليه من المثبط روك. في الأيام التالية ، وتحديث نصف المتوسطة كل 3 أيام. ثقافة متوسطه ينبغي كنت غيرت بعناية جدا [أين وردر تو] منعت مفرزه من السطح.

4. تحليل المناعة

1. تثبيت الخلية. شطف الخلايا مع تلفزيوني (مع Ca^{2 +}/Mg^{2 +}) واحتضان لمده 15 دقيقه في 4 ٪ بارافورمالدهيد في الخدمات التلفزيونية العامة (مع Ca^{2 +}/Mg^{2 +}) في درجه حرارة الغرفة.
   تحذير: بارافورمالدهيد هو السامة ويشتبه في ان يسبب السرطان. تجنب ملامسه الجلد والعينين والتعامل تحت غطاء الدخان الكيميائي.
2. بيركابايز مع تلفزيوني (مع Ca^{2 +}/Mg^{2 +}) التي تحتوي علي 0.1 ٪ تريتون X-100 لمده 5 دقائق في درجه حرارة الغرفة.
3. احتضان لمده 30 دقيقه في درجه حرارة الغرفة في حل حظر الأجسام المضادة (ABS: 3 ٪ جيش الصرب البوسنيين في الخدمات التلفزيونية مع Ca^{2 +}/Mg^{2 +}).
4. احتضان لمده 1 ساعة في درجه حرارة الغرفة مع الأجسام المضادة الاوليه في ABS: المضادة لTUJ1 (1:1000 ، الأرنب) والمضادة لOct4 (1:200 ؛ الماوس) أو المضادة للدردشة (المضادة للالكولين اسيتيل ؛ 1:150 ؛ الماعز). انظر جدول المواد.
5. احتضان لمده 45 دقيقه في درجه حرارة الغرفة مع المناسبة الحمار الجسم المضادات الثانوية الزوج في ABS: مكافحه الماوس اليكسا فلور 647 (1:250) ، المضادة لأرنب اليكسا فلور 594 (1:250) ومكافحه الماعز اليكسا فلور 488 (1:250). انظر جدول المواد.
6. احتضان في 0.4 ميكروغرام/مل DAPI لمده 5 دقائق في درجه حرارة الغرفة لتسميه نوى.
7. جبل الخلايا مع تصاعد المتوسطة (انظر جدول المواد) للتصوير في المجهر مضان.

5. توصيف وظيفية عن طريق التصحيح-تسجيلات المشبك

1. اعداد الحل الخارجي معايرتها (NES) علي النحو التالي: 140 mM كلوريد الصوديوم ، 2.8 mM KCl ، 2 مم CaCl₂، 2 مم mgcl₂، 10 ملم hepes ، و 10 ملم الجلوكوز. تعيين الاسموليه بين 290-300 mω. ضبط درجه الحموضة إلى 7.3 باستخدام 1N NaOH وتخزين الحل في 4 ° c.
2. اعداد الحل الداخلي: 140 mM K-غلوكونات ، 2 مم كلوريد الصوديوم ، 5 مم بابتا ، 2 مم MgCl₂، 10 مم hepes ، 2 مم MG-ATP ، 0.3 mm NA-gtp. ضبط درجه الحموضة إلى 7.3 مع 1m كوة وتحقق من ان يتم تعيين الاسموليه في حوالي 290 mω. تجميد الحل في-20 درجه مئوية في الارصفه الصغيرة.
3. قبل تشغيل التجارب ، قبل الحارة حل NES في حمام مائي إلى حوالي 28-30 درجه مئوية.
4. سحب بعض الأنابيب المجهرية البورسيليكات (ID 0.86 mm; OD 1.5 mm) تحمل المقاومة غيض: 5-6 MΩ وملء مع محلول داخل الخلايا قبل المتصاعدة في حامل ماصه.
   ملاحظه: تذكر لأسلاك الفضة كلوريد من القطب الكهربائي والمرجعي التسجيل في التبييض لمده لا تقل عن 30 دقيقه من أجل تشكيل طبقه موحده من AgCl علي سطح السلك.
5. نقل طبق بيتري في غرفه التسجيل والسماح للغرفة مع حل NES في 1-2 mL/min. السماح للتدفق يمر عبر سخان مضمنه تعيين في درجه حرارة 30 درجه مئوية من أجل الحفاظ علي الحل الدافئة.
6. مكان غرفه تسجيل إلكتروفيزيولوجي تحت المجهر تستقيم. سجل تيارات الغشاء مع مكبر للصوت التصحيح المشبك والحصول علي البيانات مع البرامج المناسبة.
7. فتح برنامج التحكم مكبر للصوت ، وتعيين كسب اشاره في القيمة 1 وتصفيه بسل في 10 كيلوهرتز. تاكد من ان فلتر بسل هو 2.5 مرات اقل من تردد أخذ العينات.
8. تعيين البروتوكولات التجريبية للجهد المشبك والتجارب الحالية المشبك في برنامج التسجيل.
9. في اعداد البروتوكول ، حدد وضع التحفيز العرضي واضبط تردد أخذ العينات عند kHz 25. ثم ، انتقل إلى علامة التبويب الموجي واكتب الجهد أو السعه الحالية الخطوة وطول علي النحو التالي.
10. لتيارات الصوديوم الجهد بوابات, استخدام 15 خطوات الجهد (50 ms مده كل منها) من-100 mV إلى + 40 mV (10 mV الزيادة). تشغيل البروتوكول بعد فرض إلى الخلية مصححه امكانيه عقد من-60 mV من خلال مكبر للصوت. المثل ، يتم اثار تيارات البوتاسيوم الجهد بوابات بخطوات الجهد (250 مللي ثانيه مده كل منهما) من-30 mV إلى + 50 mV (10 mV زيادة) عقد الخلية المسجلة إلى-40 mV.
11. للتحقيق في خصائص إطلاق النار من الجمجمة المستمدة iPSC والعمود الفقري MNs ، المشبك الخلايا ، في وضع المشبك الحالي ، في قدره الغشاء من-70 mV واستخدام النبضات الحالية 4 (1 s مده كل منها) من زيادة السعه (من + 20 باسكال إلى + 80 pA ؛ 20 pA الزيادة).
12. الحصول علي كل خليه التيارات النشطة الجهد ، اثار إطلاق النار النشاط وثلاثه خصائص السلبي والسعه الخلية الكاملة (سم) ، ومقاومه غشاء الخلية (Rm) ويستريح غشاء المحتملة (مبردات).

النتائج

ويرد في الشكل 1وصف تخطيطي لطريقه التفريق. تم نقل iPSCs البشرية (WT I خط³) مع Epb-BSD-tt-النيل أو Epb-BSD-tt-النعناع الخاص ، وتوليد ، بناء علي الاختيار بلاستيبين ، ومستقره والخلايا القابلة للتحويل¹²، يشار اليها فيما بعد باسم ipscs-NIL و IPSCS-النعناع ، علي التوالي. ميزت خل...

Discussion

يسمح هذا البروتوكول بتحويل iPSCs البشرية بكفاءة إلى الخلايا العصبية الحركية في العمود الفقري والجمجمة بفضل التعبير المنتبائي لعوامل النسخ الخاصة بالنسب. هذه الجينات هي محفزه من قبل الدوكسيسيكلين ومتكاملة بشكل ثابت في الجينوم بفضل ناقلات المستندة إلى ترانسباك. في المجموعات السكانية المخت?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-Bapta	Sigma-Aldrich	A4926-1G	chemicals for electrophysiological solutions
Accutase	Sigma-Aldrich	A6964-100ML	Cell dissociation reagent
anti-CHAT	EMD Millipore	AB144P	Anti-Choline Acetyltransferase. Primary antibody used in immunostaining assays. RRID: AB_2079751; Lot number: 2971003
anti-goat Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A11055	Secondary antibody used for immonofluorescence assays. RRID: AB_2534102; Lot number: 1915848
anti-mouse Alexa Fluor 647	Thermo Fisher Scientific	A31571	Secondary antibody used for immonofluorescence assays. RRID: AB_162542; Lot number: 1757130
anti-Oct4	BD Biosciences	611202	Primary antibody used in immunostaining assays. RRID: AB_398736; Lot number: 5233722
anti-Phox2b	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	sc-376997	Primary antibody used in immunostaining assays. Lot number: E0117
anti-rabbit Alexa Fluor 594	Immunological Sciences	IS-20152-1	Secondary antibody used for immonofluorescence assays
anti-TUJ1	Sigma-Aldrich	T2200	Primary antibody used in immunostaining assays. RRID: AB_262133
B27	Miltenyi Biotec	130-093-566	Serum free supplement for neuronal cell maintenance
Bambanker	Nippon Genetics	NGE-BB02	Cell freezing medium, used here for motor neuron progenitors
BDNF	PreproTech	450-02	Brain-Derived Neurotrophic Factor
Blasticidin	Sigma-Aldrich	203350	Nucleoside antibiotic that inhibits protein synthesis in prokaryotes and eukaryotes
BSA	Sigma-Aldrich	A2153	Bovine Serum Albumin. Blocking agent to prevent non-specific binding of antibodies in immunostaining assays
CaCl2	Sigma-Aldrich	C3881	chemicals for electrophysiological solutions
Clampex 10 software	Molecular Devices	Clampex 10	Membrane currents recording system
Corning Matrigel hESC-qualified Matrix	Corning	354277	Reconstituted basement membrane preparation from the Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma. Used for adhesion of iPSC to plastic and glass supports
CRYOSTEM ACF FREEZING MEDIA	Biological Industries	05-710-1E	Freezing medium for human iPSCs
D-Glucose	Sigma-Aldrich	G5146	chemicals for electrophysiological solutions
DAPI powder	Roche	10236276001	4′,6-diamidino-2-phenylindole. Fluorescent stain that binds to adenine–thymine rich regions in DNA used for nuclei staining in immonofluorescence assays
DAPT	AdipoGen	AG-CR1-0016-M005	Gamma secretase inhibitor
Dispase	Gibco	17105-041	Reagent for gentle dissociation of human iPSCs
DMEM/F12	Sigma-Aldrich	D6421-500ML	Basal medium for cell culture
Doxycycline	Sigma-Aldrich	D9891-1G	Used to induce expression of transgenes from epB-Bsd-TT-NIL and epB-Bsd-TT-NIP vectors
DS2U	WiCell	UWWC1-DS2U	Commercial human iPSC line
E.Z.N.A Total RNA Kit	Omega bio-tek	R6834-02	Kit for total extraction of RNA from cultured eukaryotic cells
GDNF	PreproTech	450-10	Glial-Derived Neurotrophic Factor
Gibco Episomal hiPSC Line	Thermo Fisher Scientific	A18945	Commercial human iPSC line
Glutamax	Thermo Fisher Scientific	35050038	An alternative to L-glutamine with increased stability. Improves cell health.
Hepes	Sigma-Aldrich	H4034	chemicals for electrophysiological solutions
iScript Reverse Transcription Supermix for RT-qPCR	Bio-Rad	1708841	Kit for gene expression analysis using real-time qPCR
iTaqTM Universal SYBR Green Supermix	Bio-Rad	172-5121	Ready-to-use reaction master mix optimized for dye-based quantitative PCR (qPCR) on any real-time PCR instrument
K-Gluconate	Sigma-Aldrich	G4500	chemicals for electrophysiological solutions
KCl	Sigma-Aldrich	P9333	chemicals for electrophysiological solutions
L-ascorbic acid	LKT Laboratories	A7210	Used in cell culture as an antioxidant
Laminin	Sigma-Aldrich	11243217001	Promotes attachment and growth of neural cells in vitro
Laser scanning confocal microscope	Olympus	iX83 FluoView1200	Confocal microscope for acquisition of immunostaining images
Mg-ATP	Sigma-Aldrich	A9187	chemicals for electrophysiological solutions
MgCl2	Sigma-Aldrich	M8266	chemicals for electrophysiological solutions
Mounting Medium	Ibidi	50001	Mounting solution used for confocal microscopy and immunofluorescence assays
Multiclamp patch-clamp amplifier	Molecular Devices	700B	Membrane currents recording system
Na-GTP	Sigma-Aldrich	G8877	chemicals for electrophysiological solutions
NaCl	Sigma-Aldrich	71376	chemicals for electrophysiological solutions
NEAA	Thermo Fisher Scientific	11140035	Non-Essential Amino Acids. Used as a supplement for cell culture medium, to increase cell growth and viability.
Neon 100 μL Kit	Thermo Fisher Scientific	MPK10096	Cell electroporation kit
Neon Transfection System	Thermo Fisher Scientific	MPK5000	Cell electroporation system
Neurobasal Medium	Thermo Fisher Scientific	21103049	Basal medium designed for long-term maintenance and maturation of neuronal cell populations without the need for an astrocyte feeder layer
NutriStem-XF/FF	Biological Industries	05-100-1A	Human iPSC culture medium
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	157-8	Used for cell fixation in immunostaining assays
PBS	Sigma-Aldrich	D8662-500ML	Dulbecco's Phosphate Buffer Saline, with Calcium, with Magnesium
PBS Ca2+/Mg2+ free	Sigma-Aldrich	D8537-500ML	Dulbecco's Phosphate Buffer Saline, w/o Calcium, w/o Magnesium
Penicillin/Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333-100ML	Penicillin/Streptomicin solution used to prevent cell culture contamination from bacteria.
poly-ornithine	Sigma-Aldrich	P4957	Promotes attachment and growth of neural cells in vitro
SU5402	Sigma-Aldrich	SML0443-5MG	Selective inhibitor of vascular endothelial growth factor receptor 2 (VEGFR-2)
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol, t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether. Used for cell permeabilization in immunostaining assays
Upright microscope	Olympus	BX51VI	Microscope for electrophysiological recording equipped with CoolSnap Myo camera
Y-27632  (ROCK inhibitor)	Enzo Life Sciences	ALX-270-333-M005	Cell-permeable selective inhibitor of Rho-associated, coiled-coil containing protein kinase (ROCK). Increases iPSC survival
μ-Slide 8 Well	Ibidi	80826	Support for high–end microscopic analysis of fixed cells