استخدام تلطيخ الفلورة المناعية للوجه لمراقبة الخلايا البطانية الوعائية مباشرة

Summary

هنا، نقدم بروتوكول او تلطيخ مناعة لمراقبة الخلايا البطانية للأبهر الفأر مباشرة. هذه التقنية مفيدة عند دراسة النمط الظاهري الخلوي والجزيئي للخلايا البطانية في أنماط تدفق مختلفة وفي تطوير تصلب الشرايين.

Abstract

تعتبر التغيرات الشاذة في النمط الظاهري البطانية والمورفولوجيا أن تكون الأحداث الأولية في مسببات الأمراض من تصلب الشرايين. المراقبة المباشرة للبطانة سليمة سوف توفر معلومات قيمة لفهم الأحداث الخلوية والجزيئية في الخلايا البطانية المختلة وظيفيا. هنا، ونحن نصف تعديل en الوجه تقنية تلطيخ المناعة التي تمكن العلماء من الحصول على صور واضحة للسطح البطانية سليمة وتحليل أنماط التعبير جزيء في الموقع. الطريقة بسيطة وموثوق بها لمراقبة أحادية بطانة كامل في مواقع مختلفة من الأبهر. قد تكون هذه التقنية أداة واعدة لفهم الفيزيولوجيا المرضية لتصلب الشرايين، وخاصة في مرحلة مبكرة.

Introduction

التغيرات المبكرة في الأوعية الدموية تبدأ في المقام الأول في البطانة ، والتي تعمل كحاجز انتقائي بين الدم وجدار السفينة مع المجمعات التقاطعية الضيقة بين الخلايا¹. تشير الأدلة الجوهرية إلى دور حاسم للآثار الميكانيكية لتدفق الدمفي تحوير وظيفة بطانة الرحم 2. السائل القص الإجهاد، وهي قوة الاحتكاك الناجمة عن تدفق الدم، والأشكال بشكل تفاضلي مورفولوجيا الخلايا البطانية وظيفة، اعتمادا على نماذج تدفق محددة في مواقع الأوعية الدموية المختلفة^2،3. تحدث الآفات التصلب الشرايين بشكل تفضيلي في مواقع تدفق الدم المضطرب (d-flow)، مثل انحناءات الأوعية الدموية، وفواصل التدفق، ونقاط الفرع، مقارنة بمناطق التدفق المطرد (التدفق s)، مثل الجزء المستقيم من الشريان. ولذلك، فإن المراقبة المباشرة لمورفولوجيا البطانية وأنماط التعبير الجزيءينبغي أن توفر رؤى هامة في الأنماط الظاهرية الهيكلية والوظيفية للخلايا البطانية في إطار نماذج تدفق متفاوتة.

قد لا تعبر الخلايا البطانية المستزرعة عن النمط الظاهري الفعلي كما تفعل في الجسم الحي ويرجع ذلك جزئياإلى فقدان تأثير الإجهاد القص السائل، السيتوكينات المحيطة، وتفاعلات الخلايا الخلوية أو الخلايا خارج الخلية مصفوفة خارج الخلية. للمساعدة في ذلك، يمكن دراسة أحادية الخلية البطانية سليمة على المقاطع العرضية باستخدام الكيمياء المناعية الكلاسيكية. ومع ذلك، فإن الطبقة الأحادية البطانية رقيقة وهشة لدرجة أنه لا يمكن ملاحظتها بوضوح. وقد استخدمت في الوجه الكيمياء المناعية لمراقبة السطح الداخلي للبطانة ولكن إما معقدة أو غير منتظمة في نتائجها لأن البطانة يتم تجريدها بسهولة من الأنسجة الكامنة، أو مجرد جزء من الجدار الشرياني للفئران أو الأرانب، التي هي سميكة الجدران، وشنت^4،5.

نماذج الماوس لها مزايا كبيرة على الحيوانات الأخرى في العديد من النواحي. هنا، ونحن نستخدم تعديل في مواجهة تقنية الفلورة المناعية لتحليل الخلايا البطانية من القوس الأبهري والأبهر الصدري في الماوس C57BL/6. وقد استخدمت هذه التقنية على نطاق واسع لدراسة الفيزيولوجيا المرضية البطانية في أنماط تدفق مختلفة وفي تطوير تصلب الشرايين^6و7و^8و9و10. تسمح هذه الطريقة للعلماء بمراقبة كامل سطح البطانة بوضوح ومقارنة أنماط التعبير لبروتين معين في المناطق التي تخضع لإجهاد القص السوائل المختلفة.

Protocol

وقد أجريت جميع التجارب الحيوانية وفقا للبروتوكولات التجريبية التي وافقت عليها لجنة الموارد الحيوانية في جامعة جياو تونغ في شنغهاي.

1. التسريب من الأبهر الماوس

1. باختصار، التخدير 12 أسبوعا من العمر C57BL/6 الفئران مع الحقن داخل الستابية من البنتوباربيتال الصوديوم (50 ملغ / كغ من وزن الجسم). تأكيد التخدير السليم عن طريق قرصة بلطف الذيل.
   ملاحظة: إذا لم يتم ملاحظة أي حركة، يتم التخدير الحيوان بما فيه الكفاية لبدء التجارب.
2. شريط الكفوف الماوس إلى كومة من المناشف الورقية مع أشرطة لاصقة.
3. عقد الجلد من الماوس مع ملقط وقطع الجلد مع زوج من مقص من البطن إلى الجزء العلوي من الصدر.
4. فتح تجويف البطن تحت القفص الصدري مع زوج حاد من مقص.
5. رفع القص مع ملقط وقطع الحجاب الحاجز. ثم، وقطع بعيدا القفص الصدري لفضح تجويف الصدر.
6. قطع الوريد اجوفا فقط فوق الكبد، مع مقص.
7. الضغط perfuse (100 mmHg) الشجرة الشريانية لمدة 5 دقائق مع المالحة طبيعية prechilled تحتوي على 40 وحدة / مل الهيبارين من خلال البطين الأيسر حتى تصبح الرئتين والكبد شاحب. ثم، يُسكب مع بارافورمالهايد 4% من البارافورمالهايد المعبّر في ملح الفوسفات المخزن (PBS، pH 7.4) لمدة 3 دقائق.
8. إزالة جميع العضلات والأعضاء والدهون حتى يتعرض الأبهر.
9. ضع الماوس تحت مجهر تشريح.

2. تشريح وفتح طولية من الأبهر

1. كشف الأبهر بوضوح تحت المجهر تشريح وإزالة الأنسجة الضامة على طول الأبهر نظيفة قدر الإمكان، مع ملقطحساسة وزوج من مقص حساسة (الشكل 1).
2. تشريح الأبهر الصدري من القلب إلى الجذع الاضطرابات الهضمية مع زوج من مقص حساسة ووضع الأبهر في طبق ثقافة الخلية 6 سم مع PBS. قطع فتح الأبهر طوليا، على طول منحنى أقل، وعلى طول منحنى أكبر حتى يتم الوفاء الجزء على التوالي. قطع فتح الفروع الثلاثة للقوس الأبهري، بما في ذلك innominat، اليسار السباتي المشترك والشريان تحت الترقوة الأيسر، مع مقص صغير، كما هو مبين في الشكل 2.

3. المعالجة المسبقة وتلطيخ المناعة من الأبهر

1. Permeabilize الأبهر مع 0.1٪ البولي أوكسي إيثيلين أوكتان الفينيل الأثير في PBS لمدة 10 دقيقة ومنعه مع 10٪ مصل الماعز العادي في تريس المخزنة المالحة (TBS) تحتوي على 2.5٪ بوليسوربات 20 لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة في لوحة ثقافة الخلية 12 جيدا.
2. بعد ذلك، احتضان الأبهر مع 5 غرام / مل أرنب المضادة لVCAM-1 و 5 غرام / مل الفئران المضادة للVE-كادرين في العازلة حجب، بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية.
3. بعد الرينالعينة 3X مع محلول الغسيل (TBS تحتوي على 2.5٪ بوليسوربات 20)، وتطبيق الأجسام المضادة الثانوية المترافقة الفلورية (1:1000 التخفيف، اليكسا فلور 555 المسمى المضادة للأرنب IgG واليكسا فلور 488 المسمى المضادة للفئران IgG) لمدة 1 ساعة في الغرفة درجه الحراره. شطف 3X في محلول الغسيل.
4. مضاد البقع الأبهر مع 4',6-دياميديينو-2-فينيليندول (DAPI) (1 ميكروغرام / مل) لمدة 10 دقائق وشطفه 3X في محلول الغسيل.

4. تركيب الأبهر على الشريحة الزجاجية

1. ضع الأبهر على غطاء مع سطح الإنارة إلى الأسفل وحركه ببطء إلى محلول التركيب المضاد للتلاشي الذي تم إسقاطه من قبل على غطاء الغلاف. تمتد بلطف الأبهر للحفاظ على عينة مسطحة.
2. معكوس غطاء ووضعها على الزجاج الشريحة. يجب الحرص على عدم السماح لأي فقاعات الهواء أن تبقى بين العينة والزجاج.

5- مراقبة الأبهر

1. فحص الأبهر باستخدام مجهر بؤري للمسح بالليزر.
2. تحليل كثافة اللون من قنوات مختلفة من المنطقة المطلوبة في الصور الوجه en مع برنامج Image-Pro Plus.

النتائج

تم قتل فأر C57BL/6 البالغ من العمر 12 أسبوعًا وملئه بمحلول ملحي عادي يحتوي على 40 وحدة/مليلترين، ثم يكون مثلالبارامالديهايد المبرد بنسبة 4%. تم الكشف عن الأبهر الماوس تحت المجهر تشريح (الشكل1) ، تشريح ، وقطع فتح طوليا (الشكل 2). تم تنفيذ تلطيخ الفلو...

Discussion

يتعرض البطانة للعديد من العوامل المسببة للإصابة، بما في ذلكالدهون، والوسطاء الالتهابيين، والإجهاد القص السائل 1،^11،12. توفر المراقبة المباشرة للخلايا البطانية في الموقع مزايا خاصة لتحليل التغيرات في مورفولوجيا الخلايا، والتقاطعات بين ا...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antifade mountant	Servicebio	G1401
Delicate Forceps	RWD Life Science	F11001-11
Delicate Scissors	RWD Life Science	S12003-09
Dissecting Forceps	RWD Life Science	F12005-10
Mciro Spring Scissors	RWD Life Science	S11001-08
Polyoxyethylene octyl phenyl ether (Triton X-100)	Amresco	M143
Polysorbate 20 (Tween 20)	Amresco	0777
VCAM-1 antibody	Abcam	ab134047
VE-Cadherin antibody	BD Biosciences	555289
Alexa Fluor 555 labeled anti-rabbit IgG	invitrogen	A-31572
Alexa Fluor 488 labeled anti-rat IgG	invitrogen	A-21208
Laser Scanning Microscope	Carl Zeiss