JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يقدم هذا البروتوكول طريقة موحدة لزراعة خلايا VX2 في الثقافة وإنشاء نموذج VX2 تقويم العظام من سرطان بطانة الرحم مع الانبثاث العقدة الليمفاوية خلف الحالب في الأرانب. نماذج سرطان بطانة الرحم تقويم العظام مهمة للدراسة قبل السريرية لطرائق التصوير الجديدة لتشخيص الانبثاث العقدة الليمفاوية.

Abstract

سرطان بطانة الرحم هو الأورام الخبيثة النسائية الأكثر شيوعا في أمريكا الشمالية والإصابة آخذة في الارتفاع في جميع أنحاء العالم. يتكون العلاج من جراحة مع أو بدون العلاج العجيدي اعتمادا على مشاركة العقدة الليمفاوية كما يحددها استئصال العقد الليمفاوية. استئصال العقد الليمفاوية هو إجراء المهووسين، والتي لم يثبت أن لها فائدة علاجية في العديد من المرضى، وبالتالي هناك حاجة إلى طريقة جديدة لتشخيص الانبثاث العقدة الليمفاوية. لاختبار عوامل التصوير الجديدة، هناك حاجة إلى نموذج موثوق به من سرطان بطانة الرحم مع الانبثاث العقدة الليمفاوية خلف الحالب. وقد تم وصف نموذج سرطان بطانة الرحم VX2 في كثير من الأحيان في الأدب; ومع ذلك، يوجد تباين كبير فيما يتعلق بطريقة إنشاء النموذج. وعلاوة على ذلك، لم تبلغ أي دراسات عن استخدام خلايا VX2 المستزرعة لإنشاء هذا النموذج حيث أن الخلايا التي يتم نشرها في الجسم الحي هي فقط التي استخدمت في السابق. هنا، نقدم طريقة جراحية موحدة وطريقة رصد ما بعد الجراحة لإنشاء نموذج سرطان بطانة الرحم VX2 وتقديم تقرير عن الاستخدام الأول لخلايا VX2 المستزرعة لإنشاء هذا النموذج.

Introduction

سرطان بطانة الرحم، أو سرطان بطانة الرحم، هو ثاني أكثر الأورام الخبيثة النسائية شيوعا في جميع أنحاء العالم والأورام الخبيثة الأكثر شيوعا في الدول المتقدمةالنمو 1. وقد ازداد معدل الإصابة بسرطان بطانة الرحم بشكل مطرد، حيث ارتفع بنسبة 2.3 في المائة سنوياً بين عامي 2005 و2013 مع زيادة مقابلة بنسبة 2.2 في المائة في الوفيات1و2و3. تشخيص الانبثاث العقدة الليمفاوية هو أمر بالغ الأهمية كما وجود العقد الليمفاوية الإيجابية هو توقع سلبي قوي من البقاء على قيد الحياة4،5،6،7 ويمكن أن توجه إدارة العلاج8،9،10،11،12،13. يتم تشخيص الانبثاث العقدة الليمفاوية حاليا عن طريق إزالة الأنسجة اللمفاوية جراحيا فوق الأوعية الدموية الرئيسية في الحوض والبطن. هذا الإجراء، المعروف باسم استئصال العقد الليمفاوية، هو مثير للجدل بسبب بيانات البقاء على قيد الحياة المتضاربة من اثنين من التجارب الكبيرة14،15،16،17،18 والمعروف خطر الإصابة بالأمراضداخل العملية15و19و20 وما بعد العملية الجراحية21و22و23. وبما أن طرائق التصوير الحالية غير الغازية لا تحتوي على الحساسية والخصوصية المطلوبة لاستبدال تشريح العقدة الليمفاوية24،فقد كان هناك دفع لتطوير تقنيات تصوير تشخيصية جديدة. لاختبار هذه التقنيات الجديدة في بيئة ما قبل السريرية، مطلوب نموذج موثوق به من سرطان بطانة الرحم مع الانبثاث العقدة الليمفاوية خلف الحالب.

نموذج الورم VX2 الأرنب هو نموذج راسخة التي تم استخدامها على نطاق واسع لدراسة أورام الجهاز الصلب البشري متعددة25 بما في ذلك الرئة26, الرأس والرقبة27,28, الكبد29, الكلى30, العظم31،32، الدماغ33، البنكرياس34 والرحم35،36،37. تم تطوير نموذج VX2 في الأصل في عام 1940 من قبل كيد وروس38 من خلال زرع بنجاح فيروس الورم الحليمي أرنب ذيل القطن اكتشفت من قبل شوب في 193339. ومنذ ذلك الوقت، تم الحفاظ على نموذج VX2 في الجسم الحي، مما يتطلب مرور تسلسلي في العضلات الرباعية من الأرانب نيوزيلندا البيضاء40. في الآونة الأخيرة ومع ذلك، نمت مجموعات متعددة بنجاح خلايا VX2 في المختبر40،41،42 وأظهرت الورم المحتفظ بها من خط الخلية المستزرعة31، 42،43. يتم تعريف أورام VX2 من الناحية النسيجية على أنها سرطان الخلايا الحرشفية اللاتنسوية44 وتحتوي على ميزات غدية تشبه سرطان الغدةالدرقية 26. تتميز الأورام بسهولة الزرع والنمو السريع وفرط الأوعية الدموية44و45 وميتاالحجم بشكل موثوق به، والأكثر شيوعا إلى العقد الليمفاوية الإقليمية والبعيدة45. أوجه التشابه في الأوعية الدموية الرحمية والتشريح اللمفاوي46 وكذلك موقع النمو التقويمي ضمان أن النمط النقيلي لسرطان الأرانب VX2 يحاكي ذلك من سرطان بطانة الرحم البشرية، مما يجعل نموذج VX2 نموذجا موثوقا به لدراسة الإنسان مرض النقيلي. وعلاوة على ذلك، فإن السمات النسيجية مثل انتشار الأوعية الدموية الدقيقة غير الطبيعية47 ، وكذلك المناعة48 وأوجه التشابه الوراثية49،50 بين البشر والأرانب تشير إلى أن الورم قد تعكس البيئة الدقيقة سرطان بطانة الرحم البشري.

وقد أبلغت مجموعات متعددة عن استخدام VX2 لإنشاء نموذج من سرطان بطانة الرحم مع الانبثاث خلف الحالب مع ارتفاع معدل النجاح المبلغعنها 36,51,52; ومع ذلك، يوجد تباين كبير داخل المؤلفات الحالية فيما يتعلق بطريقة خلق النموذج. جرعات تعليق الخلية منخفضة يصل إلى 4 × 105 خلايا / قرن الرحم51 وعالية يصل إلى 5 × 109 خلايا / الرحم القرن37،53 تم الإبلاغ عنها مع عدم وجود توافق قياسي في الآراء على الجرعة الخلوية VX2 المطلوبة. كذلك، تم الإبلاغ عن مجموعة متنوعة من طرق التلقيح بما في ذلك زرع الجراحة الدقيقة للورم في عضلة القلب الرحم36، حقن VX2 تعليق الخلية37،44،52 , 53 وفي بعض الحالات ، إضافة قرن الرحم خياطة قبل التلقيح52. وأخيراً، لم يتم الإبلاغ عن أية مجموعات استخدام خلايا VX2 المستزرعة لإنشاء هذا الطراز. وبالتالي، فإن الغرض من هذه الدراسة هو إظهار طريقة موحدة ناجحة لخلق نموذج VX2 والإبلاغ عن أول استخدام لخلايا VX2 المستزرعة لإنشاء نموذج من سرطان بطانة الرحم مع الانبثاث خلف الستينات في أرنب.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

إغلاق جدار البطن العميق: تحديد قمة الشق العبي وفهم العضد، والعضلات المستقيمة واللفافة مع ملقط الأنسجة. وقد أجريت جميع الدراسات الحيوانية في المرافق المعتمدة من مركز الموارد الحيوانية (ARC) التابعة للشبكة الصحية الجامعية ووفقا ً لبروتوكولات الاستخدام ورعاية الحيوانات المعتمدة (AUP #3994/#4299). تم الحصول على خط الخلية VX2 من مختبر الدكتور أكين في الشبكة الصحية الجامعية.

1. إنشاء في المختبر VX2 خط الخلية

  1. حصاد الورم VX2 من العضلات رباعية الأرنب والنمو في الجناح الماوس.
    1. إذابة كتل الورم VX2 المجمدة (1 سم × 1 سم)، mince على لوحة الثقافة باستخدام شفرة مشرط وسلالة من خلال مرشح 70 ميكرومتر عن طريق إضافة كميات صغيرة من حل الملح المتوازن هانكس (HBSS) بالتتابع لضمان توتر جميع الخلايا لحجم نهائي من 1 مل.
    2. عد الخلايا والمخفف مع 0.9٪ الفوسفات المخزنة محلول ملحي إلى تركيز 1 × 107/ مل ووضعها على الجليد في أنبوب معقم.
      ملاحظة: تم الحصول على كتل الورم من متعاون مختبر من الانتشار السابق لأورام VX2 في عضلات الأرانب الرباعية.
    3. التخدير أرنب نيوزيلندا بيضاء الإناث (الوزن 2.5-3.5 كجم) مع 2-5٪ اينحلا isoflurane، وإزالة الفراء فوق موقع الحقن وتطهير موقع الحقن مع محلول اليود البوفيدون. حقن 500 ميكرولتر من تعليق الخلية VX2 المعدة (5 × 106 خلايا / مل) في العضلات الرباعية للأرنب. مراقبة الأرنب سريريا لنمو الورم بدءا من اليوم 10.
    4. قتل الأرانب بعد الأورام تصل إلى 1-1.5 سم في القطر (تقاس خارجيا مع الفرجار) باستخدام طريقة وافق الطبيب البيطري. تأكد من القتل الرحيم عن طريق التحقق من العلامات الحيوية بما في ذلك معدل ضربات القلب ومعدل التنفس. استئصال الورم باستخدام أدوات معقمة بعد تنظيف المنطقة مع محلول البيتادين.
    5. في خزانة السلامة البيولوجية باستخدام أدوات معقمة، يُقطّع الورم إلى قطع صغيرة (0.2 سم) على طبق زراعة الأنسجة بحجم 10 سم باستخدام شفرة مشرط. تمرير شظايا الورم من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر باستخدام 1 مل من HBSS كما هو موضح في الخطوة 1.1.1. عد الخلايا وتمييع باستخدام محلول ملحي 0.9٪ للحصول على 7.5 × 105 خلايا في 200 ميكرولتر.
    6. تخدير الذكور NOD scid الفئران غاما (الوزن 25 غرام) باستخدام 4٪ isoflurane في 1 لتر / دقيقة والحفاظ على التخدير باستخدام 2٪ isoflurane. مرة واحدة يتم تخدير الفئران، حقن 200 ميكرولتر من الحل من الخطوة 1.1.5 في الأنسجة تحت الجلد من الجناح الماوس باستخدام إبرة قياس 27.
  2. حصاد وتمرير خلايا VX2 في المختبر
    1. مراقبة نمو xenograft سريريا مرتين أسبوعيا حتى تصل الأورام 1 سم في القطر باستخدام الفرجار.
    2. قتل الفئران عن طريق وضع في غرفة CO2 أو إجراء خلع عنق الرحم بعد التخدير مع 4٪ غاز الإيسوفيلوران. أورام المكوس في ظروف معقمة في خزانة السلامة البيولوجية.
    3. أورام مينس مع مشرط إلى قطع 1-2 ملم في طبق زراعة الأنسجة 6 سم يحتوي على 3 مل من دولبكو تعديل النسر المتوسط (DMEM) / لحم الخنزير F12 + 10٪ مصل البقر الجنيني (FBS) وسائل الإعلام.
    4. ترك شظايا الورم دون عائق في حاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 لمدة يومين حتى تبدأ الخلايا في النمو من قطع الورم. في وقت لاحق، تحقق لوحات المستزرعة يوميا عن طريق الفحص المجهري الخفيفة لالتواء الخلية. عند الوصول إلى 70٪ من الملاءمة، ومحاولة الخلايا عن طريق إضافة 1 مل من 0.05٪ تريبسين إلى قارورة ووضع مرة أخرى في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
    5. تحييد التربسين مع 6 مل من DMEM / هام F12 + 10٪ FBS المتوسطة، وجمع الخلايا والطرد المركزي في 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق في 300 × ز. إزالة supernatant وإعادة تعليق بيليه في 3.5 مل من F12 DMEM / هام F12 جديدة + 10٪ FBS وسائل الإعلام. بذور جديدة 6 سم الكولاجين أنا لوحات المغلفة مع 1.6 × 106 خلايا لكل لوحة لتحقيق ما يقرب من 50٪ كثافة البذر الخلية.
      ملاحظة: تشير كثافة الخلية بنسبة 50% إلى الخلايا التي تتناول 50% من المساحة السطحية للصفيحة عند إرفاقها.
    6. تمرير في وقت مبكر: كرر العملية المذكورة أعلاه (التطفل، البذر) حتى يتم مرور الخلايا 5 مرات ثم تقييم نقاء خط الخلية مع PCR باستخدام اختبار PCR كمي للتمييز بين الحمض النووي الجينومي للأرنب والحمض النووي الجينومي للماوس (انظر الخطوة 1.3.1-1.3.4).
      ملاحظة: بعد 8 مقاطع، يمكن نشر الخلايا على لوحات ثقافة الأنسجة العادية غير الكولاجين المغلفة.
    7. مرور، trypsinize وتجميد aliquots من الخلايا في DMEM / HAM F12 + 30٪ FBS + 10٪ DMSO بتركيز 2 × 106 لكل قارورة. تخزين الخلايا في النيتروجين السائل حتى المطلوبة للتجارب.
  3. تأكيد أصل VX2 من الخلايا الباقية على قيد الحياة:
    1. إنشاء علاج قياسي من الماوس الجينوم النقي والحمض النووي الأرنب (الخطوة 1.3.2 والخطوة 1.3.3). استخدم المواد التمهيدية التي تستهدف التسلسلات الخاصة بالأنواع ضمن إطار القراءة المفتوح الثاني لعنصر LINE-1 retrotransposon.
      ملاحظة: تسلسل التمهيدي لCRPV E6 هي: 5 '- GATCCTGGACCCAACCAGTGand 5 '-CCTGCCGGTCCCTGATTTAT. تم استخدام عناصر ريتروترانسبوسون LINE-1. تسلسل التمهيدي للأرنب خط-1 هي: 5 '-TCAGGAACCCCAGAAAGTATGC و 5 '-TTTGATTTCTTGTGTACCCAGTGT التمهيدي تسلسل للماوس الخط-1 هي: 5'-AATGGAAAGCCAACATTCACG و 5'-CCTTCCTTGAGAAGGTATTTG
    2. لإنشاء منحنى قياسي لCRPV E6، تنقية VX2 خلية الورم lysate (الخطوة 1.1.1) باستخدام مجموعة تجارية بعد بروتوكول الشركة المصنعة. قياس هذا الحمض النووي باستخدام فحص تجاري. إجراء 6 تخفيفات تسلسلية من 225 بيكوغرام/ميكرولتر إلى 0.925 بيكوغرام/ميكرولتر في المخزن الاحتياطي EDTA-TE المنخفض. لإنشاء منحنى قياسي للحمض النووي الجينومي للماوس، تمييع 100 ميكروغرام من الحمض النووي الجيني للماوس التجاري في المخزن الاحتياطي EDTA-TE المنخفض في 5 تخفيفات من 125 pg/μL وصولاً إلى 0.0125 pg/μL.
    3. ضع 4 ميكرولتر من كل حل مخفف من العينات من الخطوة 1.3.2 في الآبار وتشغيل العينات في دراجة حرارية PCR. استخدم قيم Cq من كل تشغيل مع كميات الحمض النووي لكل بئر لحساب منحنى قياسي باستخدام إعدادات عتبة تلقائية لبرنامج الدراجات الحرارية.
    4. استخدم إجراءات qPCR القياسية لتنفيذ PCR مع 40 دورة من ركوب الدراجات بخطوتين (98 درجة مئوية و60 درجة مئوية) على دراجة حرارية. قم بإنشاء قيم العتبة، وتعيين قيم دلتا Ct في >35 لضمان وجود الحد الأدنى من تلوث الماوس في خط خلية VX2 الأرنب. وكان الحجم الإجمالي لكل رد فعل 10 درجة مئوية، تتكون من 5 ميكرولتر من 2X ماسترميكس، 1 ميكرولتر من الأمام + التمهيديات العكسية مع تركيز التمهيدي النهائي في رد فعل في 250 nM، و 4 ميكرولتر من عينة الحمض النووي.
      ملاحظة: الرجاء مراجعة المراجع54و55 للحصول على تفاصيل حول تنفيذ PCR. يتم تحديد قيم العتبة، ويتم تعيين قيم دلتا Ct في >35 لضمان وجود الحد الأدنى من تلوث الماوس في خط خلية VX2 الأرنب. المستوى الموصى به من الحمض النووي VX2 للكشف موثوق بها من قبل qPCR هو 1-10 pg.

2. VX2 ثقافة الخلية وخلق تعليق الخلية

  1. قارورة ذوبان تحتوي على خلايا VX2 (المجمدة في الخطوة 1.2.7) في حمام مائي في 37 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة ونقل الخلايا إلى أنبوب الطرد المركزي مخروطي مع 10 مل من وسط الثقافة (1:1 DMEM /F-12 + 10٪ FBS و 1٪ البنسلين-ستربيتوميسين). الطرد المركزي لمدة 8 دقائق في 107 × ز،وتجاهل supernatant وإعادة تعليق بيليه الخلية في 9 مل من وسائل الإعلام.
  2. نقل الخلايا المعاد تعليقها إلى قارورة ثقافة كبيرة. حضانة الخلايا دون هز عند 37 درجة مئوية. تحقق من الخلايا يوميًا للتقاء التقاء باستخدام الفحص المجهري الخفيف وتغيير وسائل الإعلام الثقافية كل ثلاثة أيام.
  3. إنشاء تعليق الخلايا VX2 المستزرعة للحقن
    1. جرب الخلايا عن طريق إضافة 3 مل من 0.25٪ تريبسين إلى قارورة مرة واحدة وصلت الخلايا 80٪ التقاء. ضع قارورة في حاضنة (37 درجة مئوية) لمدة 5 دقائق.
    2. غسل الكريات الخلية 3 مرات مع 9 مل من الفوسفات المخزنة المالحة، الطرد المركزي وإزالة supernatant كما هو موضح أعلاه. عد الخلايا وتمييع مع 0.9٪ الفوسفات المخزنة محلول ملحي إلى تركيز 4 × 107 خلايا / مل ووضعها في أنبوب الطرد المركزي مخروطي معقمة على الجليد.
  4. إنشاء في الجسم الحي نشر تعليق الخلية VX2 للحقن
    1. إذابة كتل الورم VX2 المجمدة (1 سم × 1 سم)، mince على لوحة الثقافة باستخدام شفرة مشرط وسلالة من خلال مرشح 70 ميكرومتر كما هو الحال في الخطوة 1.1.1. إضافة كميات صغيرة من HBSS بالتتابع لضمان توتر جميع الخلايا لحجم نهائي من 1 مل. عد الخلايا والمخفف مع 0.9٪ الفوسفات المخزنة المالحة إلى تركيز 1 × 107/ مل ووضعها على الجليد في أنبوب معقم.
      ملاحظة: تم الحصول على كتل الورم من متعاون مختبر من الانتشار السابق لأورام VX2 في عضلات الأرانب الرباعية.

3. مؤسسة النماذج الجراحية

  1. إنشاء التخدير الجراحي والإعداد قبل الجراحة
    1. قبل العلاج الإناث الأرانب نيوزيلندا البيضاء (2.5-3.5 كجم) 1 ساعة قبل العملية الجراحية المخطط لها باستخدام حقن acepromazine (1 ملغ / كغ IM) وميلوكسيكام (0.2 ملغ / كغ SQ). التخدير أرنب نيوزيلندا بيضاء الإناث (الوزن 2.5-3.5 كجم) مع 2-5٪ اينحلا isoflurane، وإزالة الفراء فوق موقع الحقن وتطهير موقع الحقن مع محلول اليود البوفيدون.
    2. تنبيب الأرانب مخدر باستخدام مجرى الهواء قناع الحنجرة (LMA) وآمنة في مكان مع الشريط، والحفاظ على التخدير العميق عن طريق معايرة جرعة الإيسوفيروران المستنشق بين 2-5٪. مراقبة التخدير الجراحي بانتظام طوال العملية عن طريق فحص العلامات الحيوية (معدل التنفس، إعادة ملء الشعرية، تشبع الأكسجين إذا كان متوفرا) ورصد علامات تشير إلى الألم (الحركة، الانسحاب من المحفزات، الضوضاء) أو الضوء التخدير (الحركة، مضغ على أنبوب LMA).
      ملاحظة: يجب أن يتم ذلك من قبل شخص لديه خبرة في مراقبة التخدير الجراحي.
    3. ضع قسطرة و٠صال أذن قياس ٢٢ مقياسفي الوريد في الوريد الظهري الهامشي. إدارة سيفازولين (20 ملغ / كغ) عن طريق الوريد 10 دقيقة قبل شق الجلد الجراحية.
    4. قص الشعر فوق الحوض والبطن قبل وضع الأرنب على طاولة العمليات، ثم وضع الأرانب في وضع الظهرعلى طاولة العمليات. تنظيف المجال الجراحي باستخدام الإعدادية الجلد الجراحية 3 خطوات (صابون البيتادين، حل الكلورهيكسيدين، حل البيتادين). الستائر المجال الجراحي مع الستائر استئصال البطن بعد الأرض وضع علامة على الجزء العلوي من عظم العانة، وترك مساحة 5 سم × 5 سم من أسفل البطن يتعرض.
  2. إنشاء شق استئصال البطن وتحديد قرون الرحم
    1. ضع غطاء جراحي وقناع للوجه فرك اليدين باستخدام الكلورهيكسيدين أو بيتادين حل فرك الجراحية. باستخدام تقنية معقمة، وضعت على ثوب معقمة وقفازات جراحية معقمة.
    2. باستخدام مشرط # 11 شفرة، وجعل شق طويل 2.5 سم 1 سم الجمجمة إلى العانة symphysis من خلال الجلد والأنسجة تحت الجلد من بطن الأرنب. يُشكّل اللفافة المستقيمة ويُجزّط عضلات المستقيم أفقياً لفضح الحولية الكامنة. أدخل البريتوم بشكل حاد بعد التأكد من أن السطح السفلي واضح من الأمعاء أو الأعضاء البطنية الأخرى.
    3. حدد موقع قرون الرحم التي تحدد المثانة البولية وتجتاح إصبع القفاز متفوقا، لاحقًا وأفقياً فوق قمة المثانة.
      ملاحظة: إذا لزم الأمر، يمكن إفراغ المثانة الكاملة باستخدام الضغط الرقمي. بمجرد تحديد موقعه، أحضر قرون الرحم من خلال شق البطن للراحة على جدار البطن.
    4. باستخدام خياطة مضفر 3-0 مضفر، إجراء ربط خياطة واحد من كل قرن الرحم ما يقرب من 1.5-2.0 سم القاصي إلى عنق الرحم. وضع خياطة مجرد وسيطة إلى الشرايين الرحمية، والتي تعمل على طول الجانب الجانبي من كل قرن. ربط الغرز بشكل مريح لocclude قرون الرحم البعيدة(الشكل 1).
  3. تلقيح مُمي ة غاز VX2
    1. باستخدام إبرة قياس 27، حقن 0.5 مل من تعليق الخلية VX2 التي تم إعدادها سابقا من أي خطوة 2.3.2 (لنموذج VX2 المستزرع) أو 2.4 (لفي الجسم الحي نشر نموذج VX2) في myometrium من كل قرن الرحم القريب إلى موقع خياطة (بين موقع خياطة وعنق الرحم). حقن أكثر من 1 دقيقة وضمان عدم حقن الخلايا في تجويف الرحم الكامنة. تخدير الحيوانات باستخدام الإيسوفيلوران المستنشق (2-5٪) وآلة مخدرمع دائرة بين.
    2. تطبيق الضغط على موقع حقن عضلة العضلة الماميلمدة لمدة 30 ق بعد الحقن للحد من تسرب الخلايا. فحص مواقع الحقن والخياطة لhemostasis ووضع قرون الرحم مرة أخرى في البطن.
  4. إغلاق الشق الجراحي
    1. إغلاق جدار البطن العميق: تحديد قمة الشق العبي وفهم العضد، والعضلات المستقيمة واللفافة مع ملقط الأنسجة.
      1. للقيام بذلك، مرساة خياطة في قمة واحدة من الشق عن طريق خياطة سطحية إلى عمق على جانب واحد من الشق وعميقة لسطحية من جهة أخرى. ربط عقدة. باستخدام الغرز المرفقة، جعل تشغيل غرز عمودي على شق من خلال طبقات جدار البطن العمل خطوة الحكمة على طول شق من جانب إلى آخر. ربط خياطة وقطع.
    2. إغلاق جدار البطن السطحي: تحديد قمة شق الجلد وخياطة الجلد البطني باستخدام دفن تشغيل تحت الجلد 3-0 خياطة متعددة خيوط قابلة للامتصاص. تطبيق الغراء الجراحية إلى شق مغلق لمعارضة حواف الجلد.
      1. للقيام بذلك، مرساة خياطة في قمة واحدة من الشق، عن طريق خياطة عميقة إلى سطحية على جانب واحد من الشق والسطحية إلى عمق من جهة أخرى. ربط عقدة. باستخدام الغرز المرفقة، جعل غرز تشغيل في طبقة الجلد موازية للشق العمل خطوة الحكمة على طول شق من جانب إلى آخر. ربط خياطة وقطع.
  5. الرعاية بعد العملية الجراحية
    1. الصحوة من التخدير: إيقاف isoflurane بمجرد إغلاق الشق والسماح للأرنب التنفس الأكسجين عن طريق القناع أثناء رصد لعلامات الصحوة (على سبيل المثال، الحركات العفوية، وفتح العين وحركات المضغ على مجرى الهواء قناع الحنجرة). Extubate الأرنب مرة واحدة يتم ملاحظة هذه العلامات وتوفير الأكسجين عن طريق قناع وبطانية دافئة حتى الأرانب في حالة تأهب وقادرة على الجلوس بشكل مستقل.
    2. الرصد بعد العملية الجراحية: مراقبة الأرانب مرتين في اليوم لمدة 4 أيام ويوميا لمدة 10 أيام إضافية بعد العملية الجراحية. لمراقبة وتقييم حالتهم العامة، وطعامهم والمياه، والبول والبراز الناتج، وتقييم الألم، والوزن، وعلامات حيوية (معدل ضربات القلب، ومعدل التنفس) وموقعهم الجراحي بحثا عن تورم، حمامي، التفريغ أو التخلص.
    3. التحكم في الألم بعد الجراحة: إدارة ميلوكسيكام يوميا (0.2 ملغ / كغ SQ) لمدة 48 ساعة بعد الجراحة ومن ثم حسب الحاجة على أساس تقييم الألم. إدارة البوبرينورفين مباشرة بعد الجراحة وكل 12 ساعة (0.01-0.05 ملغ /كغ SQ) لمدة 24 ساعة ثم حسب الحاجة على أساس تقييم الألم
    4. يمكن إعطاء المضادات الحيوية (enrofloxacin 5mg/kg IM) يوميًا لمدة سبعة أيام بعد الجراحة لمنع عدوى الجروح على النحو الموصى به من قبل الطبيب البيطري. إدارة السوائل تحت الجلد (15 مل من SQ) مرتين في اليوم حسب الحاجة للجفاف ويتم توفير الأطعمة اللينة أو غيرها من المكملات الغذائية يوميا حسب الحاجة لفقدان الوزن.

4. رصد نمو الورم

  1. المراقبة السريرية: مراقبة الأرانب كل يومين للعلامات السريرية لنمو الورم بدءا من اليوم التالي للعملية الجراحية 14. يمكن أن تشمل العلامات السريرية لنمو الورم انخفاض تناول الفم، والخمول، والرقة في البطن، وكتلة البطن الملموسة وفقدان ضمور الدماغ.
  2. التصوير والمراقبة الغازية
    1. التصوير المقطعي المحوسب: في اليوم التالي للعملية 21-28، ما قبل العلاج، والتخدير، والتنبيب الأرانب كما هو موضح سابقا في 3.1.1-3.1.2. وضع الأرانب في وضع الظهرفي الماسح الضوئي CT قبل السريرية والحصول على صور من الحوض والبطن بعد إعطاء 10 مل من عامل التباين iohexol عن طريق الوريد.
    2. المراقبة الجراحية: نقل الأرانب إلى غرفة العمليات بعد التصوير بينما لا تزال تحت التخدير العام. وضع، وإعداد والارانب كما هو موضح سابقا في الخطوة 3.1.4 وإجراء شق استئصال البطن تكرار ما يقرب من 1.5 سم في الطول من خلال شق السابقة. تحديد وقرون الرحم وفحص بعناية للورم. أغلق الشق ووفر الرعاية بعد العملية الجراحية كما سبق وصفها في الخطوة 3.5.2-3.5.4.
    3. استخدام نموذج الأرنب: إذا تم العثور على الأرانب لديها أورام في وقت الرصد الجراحي، واستخدام نماذج سرطان بطانة الرحم الأرنب للتجارب المخطط لها. استخدام الأرانب التي تم إنشاؤها من في الخلايا المنشورة في الجسم الحي لإجراء تجارب إضافية في 4 أسابيع بعد التلقيح واستخدام نماذج الأرانب التي تم إنشاؤها من خلايا VX2 المستزرعة في حوالي 5-6 أسابيع بعد التلقيح لحساب نمو الورم أبطأ. قتل الأرانب بعد الأورام تصل إلى 1-1.5 سم في القطر (تقاس خارجيا مع الفرجار) باستخدام طريقة وافق الطبيب البيطري. تأكد من القتل الرحيم عن طريق التحقق من العلامات الحيوية بما في ذلك معدل ضربات القلب ومعدل التنفس. استئصال الورم باستخدام أدوات معقمة بعد تنظيف المنطقة مع محلول البيتادين.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

تم استخدام 28 أرنبًا لإنشاء نموذج سرطان بطانة الرحم. وكان متوسط وزن الأرانب 2.83 كغم (2.71-3.58 كغم) وقت التجربة. نمت أورام الرحم بنجاح في 21 الأرانب لمعدل نجاح نموذج عام من 75٪. قبل إدراج خياطة الرحم في البروتوكول، كان معدل النجاح 57٪ مقارنة مع 81٪ بعد إضافة خياطة الرحم. تمت إضافة خيا?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

هنا, وقد أبلغنا عن طريقة جراحية موحدة لإنشاء نموذج سرطان بطانة الرحم VX2 وأبلغنا عن أول استخدام لخلايا VX2 المستزرعة لإنشاء هذا النموذج. معدل أخذ الورم من 75٪ هو أقل من معدل 100٪ التي سبق الإبلاغ عنها في الأدب35،37،53،56؛ ومع ذلك...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

تم تمويل هذه الدراسة من قبل معهد تيري فوكس للبحوث (PPG#1075)، والمعهد الكندي للبحوث الصحية (مؤسسة منحة #154326)، والمعهد الكندي لبحوث جمعية السرطان (704718)، والعلوم الطبيعية ومجلس البحوث الهندسية في كندا، مؤسسة Сanada للابتكار ومؤسسة الأميرة مارغريت للسرطان.

وأود أن أشكر الدكتورمارغريت أكنز لتوفير الخلايا VX2 الأولية لإنشاء نموذج VX2 الأولي وكتل الورم VX2 المجمدة. أود أن أشكر ماركو ديغرابا للمساعدة في إجراء التجارب الأولية لثقافة الخلايا VX2 وليلي ديينغ للمساعدة في ثقافة الخلايا VX2.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
11-blade scalpel, Sterile, DisposibleAspen Surgical (VWR)80094-086
22-gague ear vein catheterCDMV14332
3-0 absorbable poly-filament suture (Polysorb)Covidien356718
3-0 braided absorbable suture (Polysorb)Covidien356718
70uM cell strainer, Individually wrapped, NylonFalcon352350
Acepromazine (Atravet)CDMV1047
Betadine soap (Poviodone iodine 7.5%)CDMV4363
Betadine solution (Poviodone iodine 10%)UHN Stores457955
BuprenorphineMcGill University
CefazolinUHN in-patient pharmacyNo Cat # Needed
Chlorhexidine solutionCDMV119872
Corning BioCoatCellware, Collagen Type I, 100mm dishesCorning354450brand not important
Corning BioCoatCellware, Collagen Type I, 24-well platesCorning354408brand not important
Corning BioCoatCellware, Collagen Type I, 6-well platesCorning354400brand not important
Corning Matrigel Basement Membrane Matrix, *LDEV-free, 10 mLCorning354234
DMEM/HAM F12 1:1Life Technologies11320brand not important
DMSOCaledon Lab Chem1/10/4100
Enrofloxacin (Baytril injectable)CDMV11242
Falcon TubeCorning Centri-Star430828
Fetal Bovine Serum, Qualified, Canadian Origin, 500mlLife Technologies12483020brand/source not important
IsofluraneUHN in-patient pharmacyNo Cat # Needed
Isohexol contrastGE Healthcare407141210
Meloxicam (Metacam 0.5%)CDMV104674
Normal SalineHouse Brand (UofT Medstore)1011
PBSMulticell or Sigma331-010-CL or D8537-500mL
Penicillin/Streptomycin (100mL; 10000U Penicillin, 10000ug Streptomycin)Corning-CellgroCA45000-652
Sterile Hanks Balanced Salt Solution (-Ca++, -Mg++, -Phenol Red)T.C.M.F (Dr Bristow)28-Jan-11
Surgical Glue (Tissue Adhesive)3M Vetbond14695B
Trypsin (0.25%), Proteomics GradeSigmaT-6567-5X20UG
Trypsin-EDTA, 0.05%, 100mlWisent Inc325-542-ELbrand not important

References

  1. Ferlay, J., et al. Cancer incidence and mortality worldwide: Sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012. International Journal of Cancer. 136, E359-E386 (2015).
  2. Canada, S. Canadian Cancer Statistics Special topic: Pancreatic cancer. , (2017).
  3. Siegel, R. Cáncer Statistics. Cáncer Journal. 67, 7-30 (2017).
  4. Creasman, W. T., et al. Surgical pathologic spread patterns of endometrial cancer. A Gynecologic Oncology Group Study. Cancer. 60, 2035-2041 (1987).
  5. Morrow, C. P., et al. Relationship between surgical-pathological risk factors and outcome in clinical stage I and II carcinoma of the endometrium: A gynecologic oncology group study. Gynecologic Oncology. 40, 55-65 (1991).
  6. Hicks, M., et al. The National Cancer Data Base report on Endometrial carcinoma in African-American women. Cancer. 83, 2629-2637 (1998).
  7. Barrena Medel, N. I., et al. Comparison of the prognostic significance of uterine factors and nodal status for endometrial cancer. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 204, 1-7 (2011).
  8. Randall, M. E., et al. Randomized phase III trial of whole-abdominal irradiation versus doxorubicin and cisplatin chemotherapy in advanced endometrial carcinoma: A gynecologic oncology group study. Journal of Clinical Oncology. 24, 36-44 (2006).
  9. Galaal, K., Al Moundhri, M., Bryant, A., Lopes, A. D., Lawrie, T. A. Adjuvant chemotherapy for advanced endometrial cancer. Cochrane Database of Systematic Reviews. 2014, 2-4 (2014).
  10. Orr, J. W., Holimon, J. L., Orr, P. F. Stage I corpus cancer: is teletherapy necessary? American Journal of Obstetrics and Gynecology. 176, discussion 788-789 777-788 (1997).
  11. Ng, T. Y., Perrin, L. C., Nicklin, J. L., Cheuk, R., Crandon, A. J. Local recurrence in high-risk node-negative stage I endometrial carcinoma treated with postoperative vaginal vault brachytherapy. Gynecologic Oncology. 79, 490-494 (2000).
  12. Mohan, D. S., et al. Long-term outcomes of therapeutic pelvic lymphadenectomy for stage I endometrial adenocarcinoma. Gynecologic Oncology. 70, 165-171 (1998).
  13. Straughn, J. M., et al. Stage IC adenocarcinoma of the endometrium: Survival comparisons of surgically staged patients with and without adjuvant radiation therapy. Gynecologic Oncology. 89, 295-300 (2003).
  14. Panici, P. B., et al. Systematic pelvic lymphadenectomy vs no lymphadenectomy in early-stage endometrial carcinoma: Randomized clinical trial. Journal of the National Cancer Institute. 100, 1707-1716 (2008).
  15. ASTEC study group,, et al. Efficacy of systematic pelvic lymphadenectomy in endometrial cancer (MRC ASTEC trial): a randomised study. The Lancet. 373, 125-126 (2009).
  16. Kilgore, L., et al. Adenocarcinoma of the Endometrium: Survival comparisons of patients with and without pelvic node sampling. Gynecologic Oncology. 56, 29-33 (1995).
  17. Trimble, E. L., Kosary, C., Park, R. C. Lymph node sampling and survival in endometrial cancer. Gynecologic Oncology. 71, 340-343 (1998).
  18. Chan, J. K., et al. The outcomes of 27,063 women with unstaged endometrioid uterine cancer. Gynecologic Oncology. 106, 282-288 (2007).
  19. Cragun, J. M., et al. Retrospective analysis of selective lymphadenectomy in apparent early-stage endometrial cancer. Journal of Clinical Oncology. 23, 3668-3675 (2005).
  20. Piovano, E., et al. Complications after the treatment of endometrial cancer: A prospective study using the French-Italian glossary. International Journal of Gynecological Cancer. 24, 418-426 (2014).
  21. Abu-Rustum, N. R., et al. The incidence of symptomatic lower-extremity lymphedema following treatment of uterine corpus malignancies: A 12-year experience at Memorial Sloan-Kettering Cancer Center. Gynecologic Oncology. , 714-718 (2006).
  22. Todo, Y., et al. Risk factors for postoperative lower-extremity lymphedema in endometrial cancer survivors who had treatment including lymphadenectomy. Gynecologic Oncology. 119, 60-64 (2010).
  23. Beesley, V., Janda, M., Eakin, E., Obermair, A., Battistutta, D. Lymphedema after gynecological cancer treatment: Prevalence, correlates, and supportive care needs. Cancer. 109, 2607-2614 (2007).
  24. Haldorsen, I. S., Salvesen, H. B. What Is the Best Preoperative Imaging for Endometrial Cancer? Current Oncology Reports. 18, 1-11 (2016).
  25. Aravalli, R., Cressman, E. Relevance of Rabbit VX2 Tumor Model for Studies on Human Hepatocellular Carcinoma: A MicroRNA-Based Study. Journal of Clinical Medicine. 4, 1989-1997 (2015).
  26. Kreuter, K. A., et al. Development of a rabbit pleural cancer model by using VX2 tumors. Comparative Medicine. 58, 287-293 (2008).
  27. Li, S., Ren, G., Jin, W., Guo, W. Establishment and characterization of a rabbit oral squamous cell carcinoma cell line as a model for in vivo studies. Oral Oncology. 47, 39-44 (2011).
  28. Muhanna, N., et al. Multimodal Nanoparticle for Primary Tumor Delineation and Lymphatic Metastasis Mapping in a Head-and-Neck Cancer Rabbit Model. Advanced Healthcare Materials. 4, 2164-2169 (2015).
  29. Tong, H., Duan, L., Zhou, H., Feng, S. Modification of the method to establish a hepatic VX2 carcinoma model in rabbits. Oncology Letters. 15, 22-23 (2018).
  30. Bimonte, S., et al. Induction of VX2 para-renal carcinoma in rabbits: generation of animal model for loco-regional treatments of solid tumors. Infectious Agents and Cancer. 11, 1-8 (2016).
  31. Handal, J. A., et al. Creation of rabbit bone and soft tissue tumor using cultured VX2 cells. Journal of Surgical Research. 179, e127-e132 (2013).
  32. Pezeshki, P. S., et al. Bone targeted bipolar cooled radiofrequency ablation in a VX-2 rabbit femoral carcinoma model. Clinical and Experimental Metastasis. 32, 279-288 (2015).
  33. Wang, Y., et al. Magnetic resonance imaging-navigated argon-helium cryoablation therapy against a rabbit VX2 brain tumor. Experimental and Therapeutic. 9, 2229-2234 (2015).
  34. Zhang, W., et al. Laparotomy cryoablation in rabbit VX2 pancreatic carcinoma. Pancreas. 46, 288-295 (2017).
  35. Xu, L. -Q., Huang, Y. -W., Luo, R. -Z., Zhang, Y. -N. Establishment of the retroperitoneal lymph node metastasis model of endometrial VX2 carcinoma in rabbits and observation of its metastatic features. World Journal of Surgical Oncology. 13, 109(2015).
  36. Duan, P., Lü, J. Q., Tu, Q. M., Yu, Z. K. Magnetic resonance evaluation of transplanted endometrial carcinoma and its lymph node metastasis in rabbits. Chinese Journal of Cancer Research. 19, 201-205 (2007).
  37. Huang, Y. -W., et al. VEGF-c expression in an in vivo model of orthotopic endometrial cancer and retroperitoneal lymph node metastasis. Reproductive Biology and Endocrinology. 11, 49(2013).
  38. Kidd, J. G., Rous, P. A transplantable rabbit carcinoma originating in a virus-induced papilloma and containing the virus in masked or altered form. J Exp Med. 71 (6), 813-838 (1940).
  39. Shope, B. R. E., Hurst, B. E. W. Infectious papillomatosis of rabbits. , (1933).
  40. Galasko, C. S. B., Haynes, D. W. Survival of VX2 carcinoma cells in vitro. European Journal of Cancer. 12 (1965), 1025-1026 (1965).
  41. Osato, B. Y. T., Ito, Y. In vitro Cultivation And Immunofluorescent Studies Of Transplantable Carcinomas Vx2 And Vx7. , Laboratory of Viral Oncology, Research Institute, Aichi Cancer Center. Nagoya, Japan. (1967).
  42. Easty, D. M., Easty, G. C. Establishment of an in vitro cell line from the rabbit VX2 carcinoma. Virchows Archiv B Cell Pathology Including Molecular Pathology. 39, 333-337 (1982).
  43. Liu, X., et al. Establishment and characterization of a rabbit tumor cell line VX2. Zhonghua bing li xue za zhi Chinese Journal of Pathology. 34, 661-663 (2005).
  44. Parvinian, A., Casadaban, L. C., Gaba, R. C. Development, growth, propagation, and angiographic utilization of the rabbit VX2 model of liver cancer: a pictorial primer and “how to” guide. Diagnostic and Interventional Radiology. 20, 335-340 (2014).
  45. Pascale, F., et al. Modified model of VX2 tumor overexpressing vascular endothelial growth factor. Journal of Vascular and Interventional Radiology. 23, 809-817 (2012).
  46. Oshiro, H. The role of the lymphatic system in rabbit models for cancer metastasis research a perspective from comparative anatomy. Okajimas Folia Anatomica Japonica. , 6-7 (2014).
  47. Guan, L., Xu, G. Destructive effect of HIFU on rabbit embedded endometrial carcinoma tissues and their vascularities. Oncotarget. 8, 19577-19591 (2017).
  48. Oshiro, H., et al. Establishment of successively transplantable rabbit VX2 cancer cells that express enhanced green fluorescent protein. Medical Molecular Morphology. 48, 13-23 (2015).
  49. Graur, D., Duret, L., Gouyt, M. Phylogenetic position of the order Lagomorpha (rabbits, hares and allies). Nature. 379, 333-335 (1996).
  50. Bõsze, Z., Houdebine, L. M. Application of rabbits in biomedical research: A review. World Rabbit Science. 14, 1-14 (2006).
  51. Kyotani, S., et al. A study of cis-diamminedichloroplatinum(II) suppositories for the treatment of rabbit uterine endometrial carcinoma. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 16, 55-58 (1993).
  52. Harima, Y., Harima, K., Hasegawa, T., Shikata, N., Tanaka, Y. Histopathological changes in rabbit uterus carcinoma alter transcatheter arterial embolization using cisplatin. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 38, 317-322 (1996).
  53. Huang, Y. W., et al. Tumor-induced VEGF-C overexpression in retroperitoneal lymph nodes in VX2 carcinoma-bearing rabbits. Drug Design, Development and Therapy. 9, 5949-5956 (2015).
  54. Bio-Rad. Real-Time PCR Applications Guide. , Bulletin 5279 (2006).
  55. Taylor, S., et al. A practical approach to RT-qPCR—publishing data that conform to the MIQE guidelines. BioRad Bulletin. , 5859(2009).
  56. Rhee, T. K., et al. Rabbit VX2 Tumors as an Animal Model of Uterine Fibroids and for Uterine Artery Embolization. Journal of Vascular and Interventional Radiology. 18, 411-418 (2007).
  57. Takahashi, K., et al. Development of a mouse model for lymph node metastasis with endometrial cancer. Cancer Science. 102, 2272-2277 (2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

151VX2

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved