دليل لبناء يميل درجة عالية اجتاحت بلاط المجهر لتصوير جزيء مفرد الحقل لعرض موسع

Summary

ويرد وصف تعليمات مفصلة حول كيفية بناء يميل درجة عالية اجتاحت مجهر بلاط (هيست) واستخدامها لتصوير جزيء واحد.

Abstract

تصوير جزيء واحد متقدمة إلى حد كبير فهمنا للآليات الجزيئية في الدراسات البيولوجية. ومع ذلك، لقد كان تحديا للحصول على صور كبيرة حقل من عرض، وعالية التباين في سميكة من الخلايا والأنسجة. هنا، نحن نقدم الفحص المجهري يميل شديدة اجتاحت بلاط (هيست) أن يتغلب على هذه المشكلة. ونفذ زوج من العدسات الاسطوانية لتوليد شعاع ممدود إثارة التي تم مسحها ضوئياً عبر منطقة تصوير كبيرة عبر مرآة جالفو بسرعة. تكوين 4و استخدمت لوضع المكونات البصرية. تم الكشف عن إشارة fluorescence كاميرا علمية تكميلية من أشباه الموصلات أكسيد المعدن ومنعت الخلفية خارج نطاق التركيز مع فتحه [كنفوكل] ديناميكية متزامنة مع أعمال التجريف شعاع. ونقدم لتعليمات خطوة بخطوة عن بناء المجهر هيست مع كافة المكونات الأساسية.

Introduction

تصوير fluorescence جزيء واحد دوراً هاما في العديد من الدراسات البيولوجية التي تكشف عن أولتراستروكتوريس وديناميات وكمية الجزيئات الحيوية^1،،من²³. ومع ذلك، قد تم تحدي لدراسة واحدة بين الجزيئات داخل الخلايا أو الأنسجة. بينما يوفر الفحص المجهري [كنفوكل] تقطيع ارتفاع قدرة⁴، أنها ليست مناسبة لتصوير جزيء واحد نظراً فوتوبليتشينج الشديد بكثافة عالية من الإثارة أو بطء سرعة التصوير. ويديفيلد المجهري يستخدم الإضاءة الضعيفة، لكنها تعاني من إشارة سيئة على خلفية نسبة (SBR)⁵. النور-ورقة الفحص المجهري، من ناحية أخرى، يمكن أن تظهر تمزيقها جيدة ومنخفضة فوتوبليتشينج⁶؛ ومع ذلك، إلى حد كبير محدودة الفتحة الرقمية المتاحة (غ) الشرط الوارد في الأهداف الموضوعة أورثوجونالي⁷. بدلاً من ذلك، فإنه يتطلب الأضواء الخاصة ونموذج الدوائر^8،9.

لهذه الأسباب، الفحص المجهري الورقة الضوئية عالية يميل ومغلفة (حلو) تستخدم على نطاق واسع للتصوير 3D جزيء واحد¹⁰. عندما يصادف شعاع يميل واجهة وسائط اثنين (الزجاج والمياه، على سبيل المثال)، هو يتخلله الشعاع وفقا لقانون سنيل. الأهم من ذلك، شعاع يتخلله يحصل أرق، ويوصف به سمك dz = R/tan(θ) حيث R قطر شعاع ميلا وهي θ زاوية الانكسار الحزم المرسلة. نتائج هذا التنفيذ بسيط في قدرة على تقطيع جيد. ومع ذلك، هذه العلاقة يشير إلى أن إضاءة رقيقة (أي قدرة تقطيع عالية) يتطلب R صغيرة و/أو θ كبيرة. على سبيل المثال، عندما ص = 20 ميكرومتر و θ = 72 درجة، يمكن للمرء الحصول على dz = 6.5 ميكرون. نظراً لوجود حد عملي لزيادة زاوية الانكسار لصورة عميقة داخل الخلايا وتجنب التفكير الداخلي الإجمالي، هناك اقتران قوية من قطر الإضاءة وسمك شعاع. ولهذا السبب، تصوير حلو يظهر صغيرة نسبيا ميدان-من-عرض (FOV) تقيد إلى حد كبير على تطبيقاتها في تصوير متعددة الخلايا.

في الآونة الأخيرة، لقد تغلبنا على هذه المشكلة بالفحص المجهري يميل شديدة اجتاحت بلاط (هيست) حيث يتم انفصلت فوف من سمك شعاع في طريقة بسيطة للغاية¹¹. أولاً، يتم إنشاء شعاع ممدود في اتجاه واحد عن طريق زوج من العدسات الاسطوانية. هذا الشعاع، توصف بأنها تجانب، تنتج إضاءة رقيقة مع dz ~ 4 ميكرومتر بينما به فوف هو 130 x 12 ميكرومتر². ثم، هو البلاط واجتاحت العينة باستخدام مرآة galvo الدورية. وفي الوقت نفسه، يتم تسجيل الصورة الفلورية على كاميرا علمية تكميلية من أشباه الموصلات أكسيد المعدن (سكموس) الذي يقوم بتصفية الخلفية خارج التركيز كفاءة عن طريق تشغيل في وضع مصراع متداول هو بمثابة كشف الشق [كنفوكل] الانضباطي. وبهذه الطريقة، تمكن مجهرية هيست تصوير جزيء واحد مع مجال رؤية أكبر (~ 130 x 130 ميكرون²) وإضاءة أرق من تصوير حلو. قمنا بتطبيق هذا التصوير الجديدة تقنية للكشف عن الحمض النووي الريبي النصوص مع تحقيق واحد في الخلايا أو مع تحقيقات قليلة في أنسجة المخ الماوس، التي تتمتع بإمكانات كبيرة لدراسة التعبير الجيني والأمراض. خلافا لغيرها من النهج، توظف فقط هدفا واحد فتحه عددية عالية دون إضاءة إضافية أو أهداف الكشف البعيد هيست ومتوافقة تماما مع المجهر المقلوب. سوف تجعل هذه المزايا إلى جانب كبير من فوف والتباين العالي هيست مجهرية أداة بارزة في علم الأحياء والطب. نقدم إرشادات مفصلة بشأن أجهزة المجهر هيست، وكيفية اختبار ومعايرة الأداء على النحو المبين أدناه.

Protocol

1. إعداد أدوات مجهر وأشعة الليزر والمحاذاة

1. قبل بناء المجهر، تعد جميع المكونات الضرورية بما في ذلك البصريات وأوبتوميتشانيكس والإلكترونيات كما هو موضح في الجدول للمواد.
2. تعد هيئة مجهر تتكون أساسا من جزأين: حائز موضوعية مع منفذ RMS-مترابطة ومرحلة بيزو شنت على كتلة ألومنيوم (الشكل 1أ).
   ملاحظة: يتم استخدام الجسم مجهر مصنوعة خصيصا لتوفير الراحة والمرونة للأجهزة¹². يمكن استخدام أي جسم المجهر المتاحة تجارياً للفحص المجهري هيست.
3. الجمع بين خطوط الليزر متعددة واقتران لهم لألياف وضع واحد
   1. تثبيت 405، 561، 638 نانومتر الليزر على البصرية الجدول والجمع بين الحزم عن طريق مقسم شعاع استقطاب ومرآة طويلة-تمرير مزدوج اللون كما هو مبين في الشكل 1ب. تأكد من أن جميع أشعة الليزر تمر عبر الثقوب على أداة المحاذاة. إدراج نصف لوحات موجه للتكيف السلطة.
      ملاحظة: ارتداء نظارات واقية لحماية العين واستخدام كتل شعاع لامتصاص أشعة الليزر غير المرغوب فيها.
   2. تثبيت عدسة اقتران ألياف (f = 4.5 مم) ومحول ألياف في محور ع مترجم مع نظام قفص.
   3. قم بتوصيل ألياف المتعدد (MMF، Ø 62.5 ميكرون) المحول الألياف. ضبط كل زوج من مرآة توجيهي وزي-المترجم حتى كفاءة اقتران كل الليزر أعلى من 95%. شعاع الإخراج لديه ملف على شكل ضبابي قريب مع أنماط البقع واللطخ.
   4. يسلب الألياف المتعدد وتوصيل ألياف وضع واحد (SMF). MMF، على غرار صقل وتعظيم كفاءة اقتران ثلاث أشعة الليزر.
4. تجميع مصدر ضوء وتحديدالمنطقه التي ستستخدم لمحاذاة شعاع في مسارات الإثارة والكشف. ويتكون هذا الجهاز من مصدر الضوء متماسك وقتيا (561 nm) متصل بصندوق التدابير الخاصة، محول الألياف، عدسة achromatic (و = 60 مم)، آيريس و Ø1 "أنبوب فاصل في قفص نظام (الشكل 1ج). ضبط المسافة بين محول الألياف والعدسة باستخدام السابر قص لضمان collimation.
5. إعداد أداة محاذاة شعاع (الشكل 1د). وهذا هو زوج من الوظائف الألومنيوم مع الثقوب في 2 "الارتفاع من على سطح المائدة البصرية، مما يسمح لمحاذاة شعاع سريعة ودقيقة.
6. تجميع نظام مزدوج ثقب الذي يتكون من اثنين Ø1 "Ø1 اثنين والزجاج الأرض المحاذاة الأقراص في نهاية كل" عدسة أنابيب (مشقوبة واحد أسفل) كما هو مبين في الشكل 1ه.

2-إعداد مسار الكشف

1. تأخذ بها الهدف وتثبيت وتحديدالمنطقه مصدر الضوء. ضبط المقابض للمرأة (M1) تحت صاحب هدف حيث الشعاع الناتج من المجهر تقريبا موازية للجدول البصرية في الارتفاع والانحياز مع ثقوب الخيوط في الجدول. الرجوع إلى الرقم 2 لمواقف مفصلة لكل مكون بصري.
2. إدراج مرآة مزدوج اللون multiband (مارك ألماني) وتعكس الشعاع بمقدار 90 درجة. استخدام الحد الأقصى لحجم قزحية العين وتأكد من أن الشعاع يمر من خلال مركز المرأة مزدوج اللون من دون القطع.
3. استخدام راشح شعاع يمر عبر مرآة مزدوج اللون لتوجيه المحاذاة للكشف عن المسار. ضع كاميرا سكموس في الشعاع وتأكد من أن الشعاع عدد مرات تصفح الموقع وسط رقاقة الكاميرا باستخدام اثنين من المرايا (M2 و M3).
4. إدراج أنبوب عدسة (TL؛ و = 300 مم) حوالي 300 ملم بعيداً عن الكاميرا.
5. إزالة مصدر الضوء وتحديدالمنطقه وضبط المسافة النسبية بين أنبوب العدسة والكاميرا حتى يتم حل نمط على السقف الواضح بالكاميرا.
6. إدراج فرقة متعددة تمرير مرشح (BF) قبل أنبوب العدسة للتصوير متعدد الألوان الفلورية.

3-إعداد طريق الإثارة

1. إعادة تثبيت مصدر الضوء وتحديدالمنطقه على صاحب الهدف. ضع مرآة حظيرة (M4) لإعادة توجيه الإخراج شعاع من المجهر بمقدار 90 درجة. ضبط المقابض مرآة مزدوج اللون وتجليد-المرأة تكراري حتى الشعاع يمر من خلال الثقوب في أداة المحاذاة الحزمة.
2. فصل مصدر الضوء وتحديدالمنطقه وتثبيته على الطاولة، والذي تشير فيه الشعاع نحو الجسم المجهر. قم بمحاذاة الحزمة باستخدام أداة محاذاة شعاع ونظام ثقب مزدوجة.
3. إدراج عدسة L4 (f = 400 مم؛ Ø = 2) إلى مسار بصري حوالي 400 ملم بعيداً عن صاحب الهدف. تثبيت العدسة الهدف وضبط موضع L4 على طول المحور البصري حتى يتم تشكيل نمط قرص جيدة التهوية مثالية على السقف.
   ملاحظة: عند إدراج العدسة، الموقف الشعاع الذي يمر من خلال العدسة ينبغي أن تظل دون تغيير. وقد العدسة L4 مؤشر ترابط SM2 التي تسمح لها بأن تعلق/فصل من 60 مم من لوحة القفص SM2-مترابطة بسهولة.
4. فك الهدف وإعادة تثبيت مصدر الضوء وتحديدالمنطقه مع قزحية مفتوحة. تتبع أسفل الإخراج شعاع من المجهر مع بطاقة تعريف المهنة. جبل مرآة M5 في مكان أصغر حجم الحزمة وحوالي 400 ملم بعيداً عن L4، التي هي طائرة صورة مترافق (cIP).
5. تثبيت مرآة M6 وتعكس الشعاع بمقدار 90 درجة. ضبط M5 و M6 تكراري باستخدام أداة المحاذاة الحزمة.
6. إدراج عدسة L3 (f = 150 مم) حوالي 150 ملم بعيداً عن M5. استخدام السابر قص لضمان collimation الشعاع الناتج.
7. مؤقتاً يسلب L4 وتتبع أسفل الشعاع العثور على موضع تركيز L3. وضع مرآة جالفو محور واحد في هذه المرحلة، وهي المستوى البؤري إلى الوراء مترافق (كبفب). إمداد فولت 0 للمرأة جالفو وتدوير حامل مرآة جالفو ذلك لأنه يعكس الشعاع بمقدار 90 درجة.
8. مكان M7 إضعاف-مرآة. بشكل صحيح وضع L2 (f = 100 مم) بنفس الطريقة كخطوة 3.6.
9. إزالة مصدر الضوء وتحديدالمنطقه من مالك الكائن. تثبيت عدسة collimation L1 (f = 100 ملم)، محول الألياف وقزحية العين. الاتصال ألياف بصرية واحدة وضع المحول وإرسال الحزم من خلال نظام التصوير.
10. أعد إدخال L4 وتهذيب النظام حتى يظهر نمط قرص جيدة التهوية مثالية على السقف.

4-إعداد العدسات الاسطوانية

1. إدراج عدسة أسطوانية (CL1، f = 400 ملم) بعد L1 وتأكد من أن تركز العدسة الاسطوانية شعاع على طول المحور س.
2. إدراج آخر العدسة الاسطوانية (CL2, f = 50 مم) إلى مسار الشعاع. استخدام السابر قص لضمان شعاع الإخراج هو وتحديدالمنطقه.
   ملاحظة: المسافة بين اثنين من العدسات الاسطوانية 450 مم. شعاع إخراج نسبة ضغط من 8 ويتم تشكيل نمط ممدود قرص المشرقة على شكل بيضاوي على السقف.

5-اختبار تصوير البلاط

1. إعداد نموذج 3D المائية. ميكس 20 نانومتر قرمزي الخرز مع حل المائية، التي تتألف من 12% acrylamide:bisacrylamide (فيها)، 0.2% (v/v) تيميد وفوق كبريتات الأمونيوم 0.2% (w/v) في المخزن المؤقت x TAE 0.75. حقن 50 ميليلتر من الحل المختلط في حجرة تدفق كما هو موضح في مكان آخر من¹¹. بعد 10 دقيقة، تكون العينة المائية 3D جاهزة للتصوير.
2. وضع العينة على صاحب العينة. بدوره على 638 نانومتر ليزر وضبط السلطة < 1 ميغاواط للإثارة عينة.
3. قم بتشغيل برنامج مراقبة الكاميرا. في لوحة الإعداد اقتناء الكاميرا، حدد الداخلية في وضع الزناد وثم انقر فوق أخذ فيديو مجاناً تشغيل وضع.
4. ضبط موضع الكاميرا قليلاً بحيث الصورة يقع في مركز الكاميرا عندما يتم تطبيق 0 فولت للمرأة جالفو.
5. قم بتدوير مقبض الأفقي من مرآة M5 لتحقيق إضاءة العالية تميل.
   ملاحظة: مع زيادة زاوية الإضاءة، الصورة المائية يصبح أكثر وضوحاً من أن الصورة برنامج التحصين الموسع كالشعاع يحصل أرق. ومع ذلك، تبقى الصورة تقريبا نفس الموقف.
6. سجل تجانب الصورة. حساب عرض الإضاءة الفعالة¹¹. ويبين الشكل 3 على سبيل المثال، عرض الإضاءة الفعالة 12 ميكرومتر.

6-هيست التصوير

1. إعداد لوحة اقتناء بيانات المرتبطة بكتلة المحطة طرفية. قم بتوصيل موصل BNC المستخدم 1 مع P0.0 عن طريق أسلاك كهربائية. استخدم 1 المستخدم كإخراج رقمي لتحريك خارجي للكاميرا سكموس. الاتصال تناظرية الإنتاج AO0 إلى برنامج تشغيل متطابقة جالفو.
2. توليد TTL نبض القطارات من P0.0 باستخدام برنامج مصنوعة خصيصا (الشكل 4أ) وتعيين وقت الفترة = 400 مللي ثانية و t_ON = 2 السيدة التحقق من البقول التي تم إنشاؤها من المستخدم 1 BNC المحطة الطرفية بالذبذبات رقمية ثم قم بتوصيل الكابل BNC للكاميرا منفذ خارجي الزناد.
   ملاحظة: البرنامج التحكم المستخدمة في هذه الورقة متاح عند الطلب. عند التصوير بالكاميرا مختلف معدلات الإطار، ينبغي تعديل وقت الفترة تبعاً لذلك.
3. بدء تجتاح مرآة جالفو عن طريق برنامج مصنوعة خصيصا. ضبط الخامس_دقيقة للسيارات-500 والخامس_{كحد أقصى} إلى 500 أم للتصوير فوف بالكامل. ويلاحظ أن ضمن هذه العملية، عينات 3D المائية لا تزال تبين خلفية عالية مشابهة لبرنامج التحصين الموسع الإضاءة.
4. تغيير إعداد اقتناء كاميرا.
   1. حدد خارجي في وضع الزناد و أسفل (تسلسلي) في القائمة المنسدلة زائد لايتسكان كما هو موضح في الشكل 4ب.
      ملاحظة: هذا الإعداد، الكاميرا لا يأخذ الصور ما لم يتم تشغيل إشارة الزناد.
   2. انقر فوق التحكم في سرعة المسح الضوئي لنافذة وقت التعرض الطول وخط السيطرة وتعيين القيم صفوف 180 و 28 مللي ثانية، على التوالي.
      ملاحظة: عند عرض تجانب (W_eff) هو 180 الصفوف (12 ميكرومتر) ووقت إدماج كل سطر (تي_int) هو 28 مرض التصلب العصبي المتعدد، وقت تأخير بين الأسطر (تي_د) يتحدد تي_د = T_intث_eff = 0.156 السيدة للتصوير 2,048 x 2,048 بكسل، هو وقت الامتلاك الكلية 2,048 س ر_د + T_int = 346 مرض التصلب العصبي المتعدد، تقابل ~2.9 في الثانية.
5. ضبط قليلاً الخامس_{كحد أقصى} و الخامس_دقيقة للحصول على صور أكثر وضوحاً.
6. الحصول على الصور مكدس ثلاثي الأبعاد باستخدام برنامج مصنوعة خصيصا بتبديل على مكدس ثلاثي الأبعاد وتحديد عدد المكدسات وحجم الخطوة.

النتائج

على سبيل مثال، كان تصويرها واحد-الذين تقطعت بهم السبل الحمض النووي المسمى مع Atto647N مع الطول موجي إثارة 638 نانومتر في هيدروجيل 3D. كانت رأسية الحمض النووي بالشبكة المائية عن طريق مجموعة أكريديتي خلال البلمرة هلام. الصور أخذت في 5 ميكرون فوق السطح كما هو مبين في الشكل 5. وأظهرت صورة هيست الخلفية أقل بكثير مقارنة بالصورة برنامج التحصين الموسع، والتي حسبت إشارة إلى نسبة الخلفية لتكون 1.9 ± 0.7 للصورة هيست في حين أن معظم البقع جزيء واحد يمكن بالكاد يمكن كشفها بواسطة برنامج التحصين الموسع.

وأجرى واحد جزيء الحمض النووي الريبي fluorescence في الموقع التهجين (سمفيش) مع 4 تحقيقات الأسماك. الشكل 5 ب يعرض الصور سمفيش من EEF2 (ترجمة حقيقية النواة استطالة معامل 2) المسمى مع 647 اليكسافلور عن خلايا A549 في مخزن مؤقت لتصوير (الرجوع إلى أعمالنا السابقة فيما يتعلق ب إعداد نموذج¹¹). تم إجراء إسقاطات أقصى شدتها على 20 z-مداخن الموافق 5 ميكرون سمك. وأظهرت صورة هيست سبر تحسنت كثيرا ليس فقط ولكن أيضا أكثر إضاءة موحدة بالمقارنة مع الصورة برنامج التحصين الموسع. لتصوير برنامج التحصين الموسع، كان وقت التعرض 400 مللي ثانية بينما الوقت كل سطر هيست التصوير الإدماج 32 مللي ثانية، كان كل منها نفس قوة الإضاءة 7.5 ميجاوات يقاس قبل الهدف. وكانت بسرعة التصوير لبرنامج التحصين الموسع وهيست 2.5 fps.

الشكل 1 . أدوات الجسم وأشعة الليزر والمحاذاة المجهر. (أ) الهدف وحامل عينة. (ب) صور لنظم الليزر. ليرة لبنانية، منذ فترة طويلة-تمرير مرآة مزدوج اللون؛ لوحات λ/2، ونصف الموجه؛ برنامج تلفزيوني، beamsplitter الاستقطاب. (ج) مصدر الضوء كوليماتيد. (د) أداة المحاذاة الحزم مع اثنين من الثقوب insertable. (ﻫ) نظام الثقب مزدوجة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 2 . الإعداد التفصيلية للفحص المجهري يميل شديدة اجتاحت بلاط (هيست). الصورة (أ) والتخطيطي (ب) نظام المجهر هيست. فرنك بلجيكي، مرشح تمرير النطاق متعددة؛ عدسات CL1-2، أسطواني؛ مارك ألماني، ومرآة مزدوج اللون؛ جنرال موتورز، مرآة galvo؛ فرنك بلجيكي، مرشح تمرير النطاق؛ M1--7، مرايا؛ المستوى 1-4، العدسات؛ صندوق التدابير الخاصة، واحدة وضع الألياف؛ ليرة تركية، أنبوب العدسة؛ المركز الدولي للبطاطا، صورة مترافق الطائرة؛ كبفب، مترافق البؤري مرة أخرى. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 3 . تجانب الإضاءة مع نسبة ضغط 8- (أ) صورة Fluorescence من 20 نانومتر الخرز في هيدروجيل 3D. مقياس بار، 20 ميكرومتر. (ب) الانحراف المعياري الإسقاط على طول اتجاه y A، ممهدة بالبيانات 10 نقاط. يشير السهم الأحمر إلى عرض إضاءة فعالة 12 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 4 . مراقبة وتصوير البرامج الأمامية الألواح. يتحكم برنامج LabView مصنوعة خصيصا (A) بشكل متزامن فحص مرآة galvo، انطلاق اقتناء كاميرا سكموس وحركة مرحلة بيزو. (ب) وضع الكاميرا اقتناء لوحة التحكم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 5. (أ) تسمية الصور Atto647N الحمض النووي في هيدروجيل ثلاثي الأبعاد مع إضاءة هيست وبرنامج التحصين الموسع. (ب) سمفيش الصور من EEF2 باستخدام 4 الأسماك تحقيقات عن خلايا A549 بالفحص المجهري هيست وبرنامج التحصين الموسع. ويرد DAPI وصمة عار باللون الأزرق. تغيير حجم أشرطة، 20 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Discussion

هناك اثنين من الخطوات الحاسمة في هذا البروتوكول. الأول هو وضع L4 المناسب في الخطوة 3، 3، ضمان أن شعاع الحادث يمر من خلال مركز العدسة ويتم تشكيل نمط قرص جيدة التهوية مثالية على السقف. يحدد موضع L4 تنسيب جميع البصرية المكونات الأخرى، بما في ذلك M5 والآلية العالمية و L3 L2. الخطوة الهامة الثانية هي عملية المزامنة. لرفض الخروج الخلفية التركيز، النشط بكسل عرض الكشف الفعال الذي يساوي عرض التجانب ينبغي أن يتزامن مع أعمال التجريف شعاع. ولذلك، من الضروري قياس عرض الإضاءة الفعالة لشعاع بلاط (الخطوة 5، 6) والكاميرا تعيين المعلمات تبعاً لذلك في الخطوة 6، 4.

عند التصوير مع فوف كبيرة جداً، تظهر طريقة عرض خلفية زيادة في جانب واحد بالمقارنة مع الجانب الآخر. ويعزى هذا إلى زوايا مختلفة قليلاً من الإضاءة في مواقع التصوير المختلفة. تنفيذ مرآة galvo ثانية بدلاً من M5 يخفف من هذه المشكلة كما هو موضح من قبل بشكل متزامن ضبط الموقف و زاوية المسح¹¹. بدلاً من دوبليتس الجاهزة متعامي، telecentric عدسة المسح الضوئي سوف تكون أيضا مفيدة. ولكن لتصوير منطقة < 8,080 مكم²، جالفو واحدة كنس مرآة كان كافياً. هيست مجهرية قد حد من عمق التصوير، بيد أنها قادرة على الحصول على من سبر جيدة عند التصوير يصل إلى 15 ~ ميكرومتر مع شعاع بلاط 12 ميكرون و 1.45 غ نفط غمر عدسة الهدف¹¹.

في هذا البروتوكول، استخدمنا نسبة ضغط شعاع من 8 جعل شعاع بلاط. يمكن استخدامها إضاءة أرق في الفحص المجهري هيست لتحقيق أعلى سبر، التي قد تكون قوية للأنسجة جزيء واحد التصوير¹¹. ومع ذلك، في هذه الحالة، أثر فوتوبليتشينج ينبغي النظر بشدة زيادة إثارة بينما نسبة ضغط الحزمة الحالية أظهرت انخفاض فوتوبليتشينج في تصوير ثلاثي الأبعاد بالمقارنة مع¹¹من برنامج التحصين الموسع. مقابل مجاهر الورقة الضوء بهدفين أورثوجونالي الموضوعة، مجهرية هيست بسيطة لتنفيذ ومتوافقة مع الاستعدادات عينة التقليدية. سبر المحسنة وكبير فوف من الفحص المجهري هيست مناسبة لدراسة التفاعلات وديناميات الجزيئات الحيوية الوحيدة في خلايا متعددة ويمكن استخدامها كذلك في تصوير القرار فائقة وتتبع جزيء واحد.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1" Achromatic doublet	Thorlabs	AC254-060-A-ML	Collimator
1" Achromatic doublet	Thorlabs	AC254-100-A-ML	L1,L2
1" Achromatic doublet	Thorlabs	AC254-300-A-ML	TL
1" Broadband Dielectric Mirrors	Thorlabs	BB1-E02-10	M1~M7
1" Cylindrical Lenses	Thorlabs	LJ1363RM-A	CL1
1" Cylindrical Lenses	Thorlabs	LJ1695RM-A	CL2
1" square kinematic mount	Edmund Optics	58-857	For dichroic mirror mounting
1" Threaded Cage Plate	Thorlabs	CP02	For holding other lenses
2" Achromatic doublet	Thorlabs	AC508-150-A-ML	L3
2" Achromatic doublet	Thorlabs	AC508-400-A-ML	L4
2" Threaded Cage Plate	Thorlabs	LCP01	For holding L4
2" Threaded Cage Plate	Thorlabs	LCP01T	For holding L3
2% Bis Solution	Bio Rad	64085292	hydrogel component
20 nm fluorescent beads	Thermo Fisher	F8782	For testing imaging
30 mm Cage Right-Angle Kinematic Mirror Mount	Thorlabs	KCB1	For objective & camera mounting
30mm Cage System Iris	Thorlabs	CP20S
3-Axis NanoMax Stage	Thorlabs	MAX311D
40% Acrylamide Solution	Bio Rad	64148001	hydrogel component
405 nm laser	Cobolt	Cobolt 06-MLD
50x TAE buffer	Bio-Rad	161-0743	hydrogel component
561 nm laser	Cobolt	Cobolt 06-DPL
638 nm laser	Cobolt	Cobolt 06-MLD
Ammonium persulfate	Sigma	A3678-25G	hydrogel component
Beam alignment tool	custom made
BNC terminal blocks	Natural Instruments	BNC-2110
Cage plate with M9 x 0.5 internal threads	Thorlabs	CP1TM09	For holding aspheric lens
Cage System Rods	Thorlabs	SR series
Cell culture & smFISH			See a reference [11]
Double side tape	Scotch	515182	Flow chamber
Epoxy	Devcon	14250	Flow chamber
Galvo mirror	Thorlabs	GVS211	GM
Galvo System Linear Power Supply	Thorlabs	GPS011
Half wave plate	Thorlabs	WPH10M-405/561/633	Power adjustment
long-pass dichroic mirror	Chroma	T550lpxr	For combining lasers
Microscope slides	Fisherbrand	12549-3	Flow chamber
Mikroskopische Deckglaser	Hecht Assistent	990/5024	Flow chamber
Mounted Frosted Glass Alignment Disk	Thorlabs	DG10-1500-H1-MD	For double pinhole system
Mounted rochester aspheric lens	Thorlabs	A230TM-A
Multi-band dichroic mirror	Semrock	Di03-R405/488/561/635-t3	DM; 3 mm thickness
Multi-band filter	Semrock	FF01-446/523/600/677-25	BF
Multimode fiber	Thorlabs	M31L02	MMF
N,N,N',N'-tetramethyl ethylenediamine	Sigma	T7024-25ML	hydrogel component
NI-DAQ board	Natural Instruments	PCI-6733
Ø1" Kinematic Mirror Mount	Thorlabs	KM100	For holding mirrors
Objective lens	Olympus	PLANAPO N 60X	60X 1.45NA oil
Pedestal Base Clamping Forks	Newport	9916
Pedestal Pillar Posts	Thorlabs	RS1P8E
Piezo controller	Thorlabs	BPC303
Polarized beam splitter	Thorlabs	PBS251	For combining lasers
RMS-SM1 adapter	Thorlabs	SM1A3TS	For objective lens
Rod holder	custom made
Rotation cage mount	Thorlabs	RSP1/CRM1/CRM1P	For HWP & cylindrical lens mounting
sCMOS camera	Andor	Zyla-4.2P-CL10
Shearing interferometer	Thorlabs	SI100	Beam collimation test
Single mode fiber	Thorlabs	P5-405BPM-FC-2	SMF
SM1 Lens Tubes	Thorlabs	SM1S25	For double pinhole system
SM1 Slotted Lens Tube	Thorlabs	SM1L30C	For double pinhole system
Stage mount	custom made
threaded fiber adapter	Thorlabs	SM1FC
Z-Axis Translation Mount	Thorlabs	SM1Z	Fiber coupling