التصوير ثلاثي الأبعاد عالي الدقة للعدوى بفيروس داء الكلب في أنسجة الدماغ التي تم تطهيرها من المذيبات

Summary

تسمح تقنيات إزالة الأنسجة الجديدة المتوافقة مع التلطيخ المناعي مثل التصوير ثلاثي الأبعاد النهائي للأعضاء التي يتم تطهيرها بالمذيبات بالتصور ثلاثي الأبعاد للعدوى الدماغية بفيروس داء الكلب وبيئته الخلوية المعقدة. يتم جعل شرائح أنسجة الدماغ السميكة التي تحمل اسم الأجسام المضادة شفافة بصرياً لزيادة عمق التصوير وتمكين التحليل ثلاثي الأبعاد عن طريق الفحص المجهري للمسح الضوئي بالليزر.

Abstract

التصور لعمليات العدوى في الأنسجة والأعضاء عن طريق وضع العلامات المناعية هو وسيلة رئيسية في علم الأحياء العدوى الحديثة. القدرة على مراقبة ودراسة توزيع، التروبيسم، ووفرة مسببات الأمراض داخل أنسجة الأعضاء يوفر بيانات محورية عن تطور المرض والتقدم. باستخدام أساليب الفحص المجهري التقليدية، يقتصر وضع العلامات المناعية في الغالب على المقاطع الرقيقة التي يتم الحصول عليها من عينات جزءا لا يتجزأ من البارافين أو المجمدة. ومع ذلك، فإن مستوى الصورة ثنائي الأبعاد المحدود لهذه الأقسام الرقيقة قد يؤدي إلى فقدان معلومات حاسمة عن البنية المعقدة للجهاز المصاب والسياق الخلوي للعدوى. توفر تقنيات إزالة الأنسجة الحديثة متعددة الألوان والمتوافقة مع تلطيخ المناعة الآن طريقة سريعة وغير مكلفة نسبياً لدراسة أكوام الصور ثلاثية الأبعاد ذات الحجم الكبير من أنسجة الأعضاء المصابة بالفيروس. من خلال تعريض الأنسجة للمذيبات العضوية، فإنه يصبح شفافا بصريا. وهذا يطابق مؤشرات الانكسار للعينة ويؤدي في نهاية المطاف إلى انخفاض كبير في تشتت الضوء. وهكذا، جنبا إلى جنب مع أهداف مسافة العمل الحرة لمسافات طويلة، يمكن تصوير أقسام الأنسجة الكبيرة تصل إلى 1 ملم في الحجم بواسطة الفحص المجهري الضوئي بالليزر البؤري التقليدي (CLSM) بدقة عالية. هنا، ونحن نصف بروتوكول لتطبيق التصوير الأنسجة العميقة بعد تطهير الأنسجة لتصور توزيع فيروس داء الكلب في العقول المصابة من أجل دراسة مواضيع مثل مسببات الأمراض الفيروس، وانتشار، التروبيسم، والغزو العصبي.

Introduction

تعتمد تقنيات علم الأنسجة التقليدية في الغالب على أجزاء رقيقة من أنسجة الأعضاء، والتي يمكن أن توفر بطبيعتها رؤى 2D فقط في بيئة 3D معقدة. على الرغم من أن من الممكن من حيث المبدأ، إعادة الإعمار 3D من أقسام رقيقة المسلسل يتطلب خطوط أنابيب التقنية الصعبة لكل من تشريح واللاحقة في محاذاة silico من الصور المكتسبة¹. وعلاوة على ذلك، إعادة الإعمار السلس من z-volumes بعد تشريح microtome أمر بالغ الأهمية كما يمكن أن تبقى على حد سواء القطع الأثرية الميكانيكية والحسابية بسبب تسجيل صورة دون المستوى الأمثل الناجمة عن طائرات الصورة غير المتداخلة، والاختلافات تلطيخ، والمادية تدمير الأنسجة من قبل، على سبيل المثال، شفرة microtome. وعلى النقيض من ذلك، فإن التقطيع البصري النقي لعينات الأنسجة السميكة السليمة يسمح باقتناء طائرات صور متداخلة (الإفراط في أخذ العينات)، وبالتالي يسهل إعادة البناء ثلاثي الأبعاد. وهذا بدوره مفيد للغاية لتحليل عمليات العدوى في مجموعات الخلايا المعقدة (مثل الشبكات العصبية في سياق الخلايا الدبقية والمناعية المحيطة). ومع ذلك، تشمل العقبات الكامنة في أقسام الأنسجة السميكة التشتت الخفيف واختراق الأجسام المضادة محدودة في الأنسجة. في السنوات الأخيرة، تم تطوير مجموعة متنوعة منالتقنيات وتحسينها للتغلب على هذه القضايا 2،^{3،4،5،6،7،8 , 9 , 10 سنوات , 11 , 12 , 13.}أساسا، يتم تحويل الأنسجة المستهدفة شفافةبصريا عن طريق العلاج مع إما مائي 2،^{3،4،5،6،7 ،8،9} أو العضوية المذيبات القائمة^{على 10،11،12،13} الحلول. إدخال 3DISCO (التصوير 3D من الأجهزة المذيبات تطهيرها)^11،12 وuDISCO خليفتها (في نهاية المطاف التصوير 3D من الأجهزة المذيبات تطهيرها)¹³ وفرت أداة سريعة نسبيا، بسيطة، وغير مكلفة مع قدرات ممتازة المقاصة. والمكونات الرئيسية لبروتوكول المقاصة هي المذيبات العضوية tert-butanol (TBA)، والكحول البنزيل (BA)، وبنزوات البنزيل (BB)، والإيثر الثنائي الفينيل (DPE). تطوير وإضافة iDISCO (التصوير 3D تمكين وضع العلامات المناعية من الأجهزة المذيبات تطهيرها)^14،بروتوكول متوافق للبقع المناعية، شكلت ميزة أخرى على الأساليب القائمة وتمكين وضع العلامات الأنسجة العميقة من المستضدات من الفائدة، فضلا عن التخزين على المدى الطويل من العينات الملطخة بالمناعة. وهكذا، فإن الجمع بين iDISCO¹⁴ و uDISCO¹³ يسمح للتصوير عالية الدقة من البروتينات التي تحمل اسم الأجسام المضادة في أقسام الأنسجة الكبيرة (تصل إلى 1 ملم) باستخدام CLSM التقليدية.

الحفاظ على بنية الجهاز المعقدة في جميع الأبعاد الثلاثة مهم بشكل خاص لأنسجة الدماغ. الخلايا العصبية تشكل شبه السكان الخلوية غير متجانسة جدا مع مورفولوجيات 3D متنوعة للغاية على أساس التوقعات النيورايت (استعرض من قبل ماسلاند¹⁵). وعلاوة على ذلك، يتكون الدماغ من عدد من المقصورات والمقصورات الفرعية، يتكون كل منها من مجموعات فرعية خلوية مختلفة ونسب منها، بما في ذلك الخلايا الغليفية والخلايا العصبية (التي استعرضها فون بارتالد وآخرون¹⁶). كفيروس عصبي، فإن فيروس داء الكلب (RABV، الذي استعرضه Fooks et al.¹⁷⁾يصيب الخلايا العصبية في المقام الأول، وذلك باستخدام آلات النقل الخاصة بهم للسفر في اتجاه رجعي على طول المحاور من الموقع الرئيسي للعدوى إلى الجهاز العصبي المركزي (CNS). يسمح البروتوكول الموضح هنا (الشكل1A)بالكشف بمساعدة المناعة والتصور للخلايا المصابة بـ RABV وRABV في أكوام صور كبيرة ومتماسكة تم الحصول عليها من أنسجة الدماغ المصابة. وهذا يمكّن من إجراء تقييم غير متحيز وثلاثي الدقة لبيئة العدوى. وهو ينطبق على أنسجة الدماغ من مجموعة متنوعة من الأنواع، ويمكن القيام به مباشرة بعد التثبيت أو بعد التخزين الطويل الأجل للعينات في البارافورمالهايد (PFA)، ويسمح بتخزين وإعادة تصوير العينات الملونة وتطهيرها لعدة أشهر.

Protocol

تم استخدام مواد الدماغ المحفوظة الثابتة بـ PFV. تم تقييم الدراسات التجريبية الحيوانية ذات الصلة من قبل لجنة الرعاية الحيوانية المسؤولة، واستخدام، والأخلاقيات التابعة لمكتب الدولة للزراعة والسلامة الغذائية وصيد الأسماك في مكلنبورغ بوميرانيا الغربية (LALFF M-V) وحصلت على الموافقة بإذن 7221.3-2.1-002/11 (الفئران) و 7221.3-1-068/16 (النمس). وقد أجريت الرعاية العامة والأساليب المستخدمة في التجارب الحيوانية وفقا للمبادئ التوجيهية المعتمدة.

تحذير: يستخدم هذا البروتوكول مواد سامة و/أو ضارة مختلفة، بما في ذلك PFA، الميثانول (MeOH)، بيروكسيد الهيدروجين (H₂O_2)،أزيد الصوديوم (NaN_3)،TBA، BA، BB، وDPE. MeOH وTBA قابلة للاشتعال للغاية. تجنب التعرض عن طريق ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة (معطف المختبر، والقفازات، وحماية العين) وإجراء التجارب في غطاء الدخان. جمع النفايات بشكل منفصل في الحاويات المناسبة والتخلص منها وفقا للوائح المحلية. ويصنف فيروس داء الكلب على أنه ممرض على مستوى السلامة الأحيائية (BSL)-2، وبالتالي يمكن التعامل معه عموماً في ظل ظروف BSL-2. وقد تتطلب بعض الأنشطة، بما في ذلك الإجراءات التي قد تولد الهباء الجوي، أو العمل بتركيزات عالية من الفيروسات، أو العمل مع فيروسات الليسا الجديدة، تصنيف BSL-3. يوصى بالوقاية قبل التعرض للموظفين المعرضين لمخاطر عالية، بمن فيهم القائمون على رعاية الحيوانات وعمال المختبرات^18،19. الرجوع إلى لوائح السلطة المحلية.

1. تثبيت أنسجة الدماغ والقسم

1. إصلاح عينات الدماغ في حجم مناسب من 4٪ PFA في محلول الفوسفات المخزنة المالحة (PBS [درجة الحموضة 7.4]) لمدة 48 ساعة على الأقل في 4 درجة مئوية (مع نسبة الأنسجة إلى المثبتة التقريبية من 1:10 [V/v]).
2. غسل عينات الأنسجة 3X في PBS لمدة 30 دقيقة على الأقل كل غسل وتخزينها في 0.02٪ NaN₃/ PBS في 4 درجة مئوية حتى استخدامها.
3. قسم الأنسجة إلى 1 مم سميكة باستخدام الاهتزاز (معدل تغذية شفرة: 0.3-0.5 مم / ثانية، السعة: 1 ملم، سمك شريحة: 1000 م).
4. للاحتفاظ بتسلسل الشريحة الصحيح، قم بتخزين كل مقطع من الأنسجة بشكل منفصل في بئر لوحة ثقافة الخلية متعددة الآبار. إضافة 0.02٪ NaN₃/ PBS وتخزين أقسام الأنسجة في 4 درجة مئوية حتى الاستخدام.

2. عينة المعالجة المسبقة مع الميثانول

ملاحظة: تنفيذ جميع خطوات الحضانة مع التذبذب لطيف، وإذا لم يذكر خلاف ذلك، في درجة حرارة الغرفة. حماية العينات من الضوء. وتخدم المعالجة المسبقة للعينة الغرض العام المتمثل في تحسين انتشار الأجسام المضادة والحد من الفلورة الذاتية للأنسجة عن طريق التعرض لـ MeOH و H₂O_2،على التوالي^14.

1. إعداد 20٪ (V / V)، 40٪، 60٪، و 80٪ حلول MeOH في الماء المقطر. على سبيل المثال، ل20٪ MeOH، إضافة 10 مل من 100٪ MeOH إلى 40 مل من الماء المقطر في وعاء قابل للغلق المناسب ومزيج عن طريق عكس ذلك.
2. نقل العينات إلى أوعية ذات حجم معقول (على سبيل المثال، 5 أنابيب رد فعل مل). الحرص على استخدام المواد المقاومة كيميائيا للكواشف المستخدمة في هذا البروتوكول. على سبيل المثال، لاحظ أنه في حين أن البولي بروبلين هو مناسب، والبوليسترين ليست كذلك.
   ملاحظة: تشير مواصفات وحدة التخزين في هذا البروتوكول إلى أنابيب التفاعل 5 مل. إذا تم استخدام وعاء مختلف، ضبط وحدات التخزين وفقا لذلك.
3. احتضان العينات في 4 مل من كل تركيز من سلسلة أعدت من حلول MeOH في ترتيب تصاعدي لمدة ساعة واحدة لكل منهما.
4. احتضان العينات 2X لمدة ساعة واحدة كل في نقية (100٪) حسناً، حسناً، حسناً، حسناً
5. تبريد العينات إلى 4 درجة مئوية (على سبيل المثال، في ثلاجة آمنة مختبر).
6. إعداد محلول التبييض (5٪ H₂O₂ في MeOH) عن طريق، على سبيل المثال، تخفيف 30٪ H₂O₂ حل الأسهم في 1:6 في نقية (100٪) MeOH، والبرد في 4 درجة مئوية.
7. إزالة MeOH 100٪ من العينات المبردة وإضافة 4 مل من محلول التبييض prechilled (5٪ H₂O₂ في MeOH). الحضانة بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية.
8. تبادل محلول التبييض لمدة 4 مل من 80٪ MeOH والحضانة لمدة 1 ح. مواصلة استخدام سلسلة أعدت من حلول MeOH في ترتيب تنازلي لمدة ساعة واحدة لكل حتى يتم احتضان العينات لمدة 1 ساعة في 4 مل من 20٪ MeOH.
9. غسل العينات 1X لمدة ساعة مع 4 مل من PBS.

3. تلطيخ المناعة

ملاحظة: تنفيذ جميع خطوات الحضانة مع التذبذب لطيف، وإذا لم يذكر خلاف ذلك، في درجة حرارة الغرفة. حماية العينات من الضوء. لمنع نمو الميكروبات، أضف NaN₃ إلى التركيز النهائي بنسبة 0.02% إلى الحلول في هذا القسم. عينات الأنسجة هي أكثر نفاذية عن طريق العلاج مع المنظفات nonionic تريتون X-100 وتوين 20. يتم استخدام المصل العادي لمنع ربط الأجسام المضادة غير محددة. يتم إضافة الجلايسين والهيبارين للحد من خلفية الوسم المناعي¹⁴.

1. غسل العينات 2X لمدة 1 ساعة كل في 4 مل من 0.2٪ تريتون X-100/PBS.
2. Permeabilize العينات لمدة 2 أيام في 37 درجة مئوية مع 4 مل من 0.2٪ تريتون X-100/20٪ DMSO / 0.3 M غليسين / PBS.
3. منع الربط غير محددة من الأجسام المضادة عن طريق احتضان العينات لمدة 2 أيام في 37 درجة مئوية في 4 مل من 0.2٪ تريتون X-100/10٪ DMSO / 6٪ المصل العادي / PBS.
   ملاحظة: استخدم المصل الطبيعي من نفس النوع الذي تم رفع الجسم المضاد الثانوي فيه لتحقيق نتائج حظر مثالية.
4. احتضان العينات في 2 مل من محلول الأجسام المضادة الأولية (3٪ المصل العادي / 5٪ DMSO / PTwH [PBS-توين 20 مع الهيبارين] + الأجسام المضادة الأولية / الأجسام المضادة) لمدة 5 أيام في 37 درجة مئوية. قم بتحديث محلول الأجسام المضادة الأساسي بعد 2.5 يوم.
   1. لPTwH، إعادة تشكيل ملح الصوديوم الهيبارين في الماء المقطر لجعل 10 ملغ / مل حل الأوراق المالية (تخزين هذا الحل، aliquoted، في 4 درجة مئوية). إضافة محلول الأسهم إلى 0.2٪ توين 20 /PBS إلى تركيز نهائي من 10 ميكروغرام / مل.
      ملاحظة: قد يتطلب اختيار تخفيف الأجسام المضادة الصحيح التحسين. بشكل عام، تركيزات الكيمياء المناعية القياسية هي نقطة انطلاق جيدة.
5. اغسل العينات لمدة يوم واحد في 4 مل من PTwH، وتبادل المخزن المؤقت للغسيل على الأقل 4x-5x خلال اليوم وترك الغسيل النهائي في ليلة وضحاها.
6. احتضان العينات في 2 مل من محلول الأجسام المضادة الثانوية (3٪ المصل العادي / PTwH + الأجسام المضادة الثانوية / الأجسام المضادة) لمدة 5 أيام في 37 درجة مئوية. قم بتحديث محلول الأجسام المضادة الثانوي بعد 2.5 يوم.
   1. تخفيف الأجسام المضادة الثانوية / الأجسام المضادة في 1:500 في محلول الأجسام المضادة الثانوية (أي، 4 ميكرولتر في 2 مل).
7. اغسل العينات لمدة يوم واحد كما هو موضح في الخطوة 3.5، وترك الغسيل النهائي في ليلة وضحاها.

4 - التلطيخ النووي

ملاحظة: تنفيذ جميع خطوات الحضانة مع التذبذب لطيف، وإذا لم يذكر خلاف ذلك، في درجة حرارة الغرفة. حماية العينات من الضوء. وإذا لم تكن هناك حاجة إلى تلطيخ نووي أو إذا كان الطول الموجي/الانبعاث للموجة من TO-PRO-3 مطلوباً للإثارة أو الكشف عن فلوروفور آخر، تخطي هذه الخطوة.

1. تخفيف وصمة عار حمض نووي TO-PRO-3 في 1:1,000 في PTwH واحتضان العينات في 4 مل من محلول تلطيخ النووية لمدة 5 ساعة.
2. اغسل العينات لمدة يوم واحد كما هو موضح في الخطوة 3.5، وترك الغسيل النهائي في ليلة وضحاها.
   ملاحظة: بعد السهي، يمكن تخزين العينات في PBS في 4 درجة مئوية حتى مسح البصرية.

5. إزالة الأنسجة

ملاحظة: تنفيذ جميع خطوات الحضانة مع التذبذب لطيف، وإذا لم يذكر خلاف ذلك، في درجة حرارة الغرفة. حماية العينات من الضوء. يتم تجفيف عينات الأنسجة في سلسلة متدرجة من حلول TBA. وبما أن تلطيخ المناعة يتطلب حلولاً مائية، يجب الانتهاء من جميع إجراءات التلطيخ قبل تطهير الأنسجة. يتم تحقيق التخليص البصري ومطابقة مؤشر الانكسار عن طريق العلاج مع خليط من BA، BB، وDPE. يتم استكمال حل المقاصة مع DL-α-توكوفيرول كمضاد للأكسدة¹³.

1. إعداد 30٪ (V / V)، 50٪، 70٪، 80٪، 90٪، و 96٪ TBA الحلول في الماء المقطر. على سبيل المثال، بالنسبة لـ 30٪ TBA، إضافة 15 مل من 100٪ TBA إلى 35 مل من الماء المقطر في وعاء قابل للغلق المناسب ومزيج عن طريق عكس.
   ملاحظة: TBA لديه نقطة انصهار من 25-26 درجة مئوية; وبالتالي، فإنه يميل إلى أن تكون صلبة في درجة حرارة الغرفة. من أجل إعداد حلول TBA، تسخين زجاجة مختومة جيدا في 37 درجة مئوية في حاضنة أو حمام مائي.
2. تجفيف العينات مع 4 مل من كل تركيز من سلسلة أعدت من حلول TBA في ترتيب تصاعدي لمدة 2 ساعة لكل منهما. ترك 96٪ TBA على بين عشية وضحاها.
3. تجفيف العينات أكثر في نقية (100٪) TBA لمدة 2 ساعة.
4. إعداد حل المقاصة BABB-D15.
   ملاحظة: BABB-D15 هو مزيج من مكتبة الإسكندرية وBB (BABB) التي يتم خلطها مع DPE بنسبة x:1، حيث يتم تحديد x في اسم الحل، في هذه الحالة 15.
   1. لBABB، مزيج من جزء واحد BA مع جزأين BB.
   2. مزيج BABB وDPE بنسبة 15:1.
   3. إضافة 0.4 فول٪ DL-α-توكوفيرول (فيتامين E).
      ملاحظة: على سبيل المثال، ل20 مل من BABB-D15، مزيج 6.25 مل من مكتبة الإسكندرية مع 12.5 مل من BB. إضافة 1.25 مل من DPE وتكمله مع 0.08 مل من DL-α-توكوفيرول.
5. قم بإلغاء مسح العينات في محلول المقاصة حتى تكون شفافة بصريًا (2-6 ساعة).
6. يمكن تخزين العينات في 4 درجة مئوية في BABB-D15، محمية من الضوء، حتى التركيب والتصوير.

6. عينة تصاعد

1. باستخدام طابعة ثلاثية الأبعاد، اطبع غرفة التصوير والغطاء (المادة: copolyester [CPE]، فوهة: 0.25 مم، ارتفاع الطبقة: 0.06 مم، سمك الجدار: 0.88 مم، عدد الجدران: 4، الحفر: 100٪، لا هيكل دعم؛ المقابلة . يمكن العثور على ملف STL في المواد التكميلية لهذا البروتوكول).
2. تجميع غرفة التصوير(الشكل 2).
   1. جبل غطاء جولة (قطرها: 30 ملم) على غرفة التصوير مع RTV-1 (مكون واحد غرفة درجة الحرارة- مبركن) سيليكون المطاط. إزالة المطاط سيليكون الزائدة مع مسحة القطن مبللة بالماء وعلاج بين عشية وضحاها.
   2. قم بتركيب غطاء دائري (قطر: 22 مم) على الغطاء مع مطاط السيليكون RTV-1. إزالة المطاط سيليكون الزائدة مع مسحة القطن مبللة بالماء وعلاج بين عشية وضحاها.
3. ضع العينة في غرفة التصوير، وأضف وحدة تخزين صغيرة من BABB-D15، وأدخل الغطاء. املأ الغرفة بـ BABB-D15 من خلال مدخل الباب، باستخدام إبرة تحت الجلد (27 G × 3/4 بوصة [0.40 مم × 20 مم]).
4. سد مدخل وختم غرفة التصوير مع المطاط سيليكون RTV-1. علاج بين عشية وضحاها في الظلام.

7. التصوير ومعالجة الصور

1. إعداد الحصول على الصورة عن طريق تحديد خطوط الليزر ذات الصلة لتتناسب مع الفلوروفور المستخدمة. ضبط نطاقات الكشف عن كل كاشف لمنع تداخل الإشارة بين القنوات.
   ملاحظة: نطاقات الكشف المثالي لأليكسا فلور 488، اليكسا فلور 568، وTO-PRO-3 هي 500-550 نانومتر، 590-620 نانومتر، و 645-700 نانومتر، على التوالي.
2. اختر معلمات الاكتساب، وحدد الحد العلوي والسفلي لمكدس z، واحصل على مكدس الصور.
   ملاحظة: معلمات الاكتساب المثالية هي مسح تسلسلي بحجم بكسل من 60-90 نانومتر، وحجم خطوة z 0.5 ميكرومتر، ومتوسط خط 1، وسرعة مسح 400 هرتز، وحجم ثقب من وحدة متجددة الهواء 1.
3. معالجة كومة الصور باستخدام برامج تحليل الصور المناسبة (مثل فيجي) لتوليد إسقاطات ثلاثية الأبعاد أو إجراء تحليلات متعمقة.
   ملاحظة: بسبب الحجم الكبير لملفات الصور المكتسبة عادةً ما يكون استخدام محطة عمل ضروري.
   1. فتح ملف (ملفات) الاكتساب أو الصورة في فيجي (ملف | فتح | حدد الملفات).
      1. إذا كنت تستخدم، على سبيل المثال، . LIF، حدد أو قم بإلغاء تحديد الخيارات المطلوبة في إطار الحوار تنسيقات حيوية. عرض المكدس مع Hyperstack. بخلاف ذلك، لا توجد اختيارات محددة أو علامات التجزئة ضرورية. اضغط على موافق.
      2. إذا كان الملف يحتوي على مكدسات صور متعددة، حدد تلك التي سيتم تحليلها وتأكيدها عن طريق الضغط على موافق.
   2. إجراء تصحيح التبييض عن طريق تقسيم الصورة المدمجة إلى قنوات فردية (صورة | اللون | أداة القنوات، ثم حدد المزيد | تقسيم القنوات). لكل قناة، حدد تصحيح التبييض (صورة | ضبط | تصحيح التبييض) واختر نسبة بسيطة (كثافة الخلفية: 0.0).
      ملاحظة: في بعض الحالات، على سبيل المثال، عندما لا يكون هناك اضمحلال خطي للإشارة أو الإشارة ضعيفة جداً بشكل عام، قد تفشل نسبة بسيطة. بدلاً من ذلك، حاول Exponential Fit أو تخطي تصحيح التبييض.
   3. ضبط السطوع والتباين لكل قناة باستخدام أشرطة التمرير (صورة | ضبط | السطوع | التباين).
   4. دمج القنوات (صورة | اللون | دمجالقنوات)، وجعل مركب (صورة | اللون | أداة القنوات، ثم حدد المزيد | جعلمركب)، وتحويلها إلى تنسيق RGB (صورة | اللون | أداة القنوات، ثم حدد المزيد | قم بالتحويل إلى RGB).
   5. إذا لزم الأمر، تغيير حجم مكدس الصور لتقليل وقت الحساب وحجم الملف (صورة | ضبط | الحجم،كلا الخيارين تكتك بالإضافة إلى الاستيفاء bilinear).
   6. إنشاء إسقاط ثلاثي الأبعاد (صورة | مكدسات | 3D المشروع). اختر نقطة ألمع كطريقة إسقاط وتعيين تباعد الشرائح لمطابقة حجم خطوة z لمكدس الصور المكتسبة. للحصول على أقصى جودة، قم بتعيين زيادة زاوية الدوران إلى 1 وتمكين الاستيفاء. تعديل الاستدارة الإجمالية وعتبات الشفافية والتعتيم حسب الحاجة.
   7. إذا لزم الأمر، تعديل التباين والسطوع عن طريق تحويل الإسقاط 3D مرة أخرى إلى تنسيق 8 بت (صورة | النوع | 8 بت). استخدام المتزلجون المعنية (صورة | ضبط | السطوع | التباين) وإعادة تحويل مكدس الصور إلى تنسيق RGB كما هو موضح في الخطوة 7.3.4.
   8. حفظ الإسقاط 3D كـ . TIF (تنسيق ملف الصورة) و . AVI (تنسيق ملف الفيديو).

النتائج

مزيج من iDISCO¹⁴ و uDISCO¹³ جنبا إلى جنب مع CLSM عالية الدقة يوفر رؤى عميقة في القرار spatiotime واللدونة من العدوى RABV من أنسجة الدماغ والسياق الخلوي المحيطة بها.

باستخدام التلطيخ المناعي للبروتين الفوسفاتي RABV (P)، يمكن تصور الطبقات المعقدة منالخل...

Discussion

عودة ومواصلة تطوير تقنيات إزالة الأنسجة في السنوات الأخيرة^2و3و4 و5 و6و7^{و8، 9 , 10 سنوات , 11 , 1...}

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Benzyl alcohol	Alfa Aesar	41218	Clearing reagent
Benzyl benzoate	Sigma-Aldrich	BB6630-500ML	Clearing reagent
Dimethyl sulfoxide	Carl Roth	4720.2	Various buffers
Diphenyl ether	Sigma-Aldrich	240834-100G	Clearing reagent
DL-α-Tocopherol	Alfa Aesar	A17039	Antioxidant
Donkey serum	Bio-Rad	C06SBZ	Blocking reagent
Glycine	Carl Roth	3908.2	Background reduction
Goat serum	Merck	S26-100ML	Blocking reagent
Heparin sodium salt	Carl Roth	7692.1	Background reduction
Hydrogen peroxide solution (30 %)	Carl Roth	8070.2	Sample bleaching
Methanol	Carl Roth	4627.4	Sample pretreatment
Paraformaldehyde	Carl Roth	0335.3	Crystalline powder to make fixative solution
Sodium azide	Carl Roth	K305.1	Prevention of microbial growth in stock solutions
tert-Butanol	Alfa Aesar	33278	Sample dehydration for tissue clearing
TO-PRO-3	Thermo Fisher	T3605	Nucleic acid stain
Triton X-100	Carl Roth	3051.2	Detergent
Tween 20	AppliChem	A4974,0500	Detergent
Miscellaneous
5 mL reaction tubes	Eppendorf	0030119401	Sample tubes
Coverslip, circular (diameter: 22 mm)	Marienfeld	0111620	Part of imaging chamber
Coverslip, circular (diameter: 30 mm)	Marienfeld	0111700	Part of imaging chamber
Hypodermic needle (27 G x ¾” [0.40 mm x 20 mm])	B. Braun	4657705	Filling of the imaging chamber with clearing solution
RTV-1 silicone rubber	Wacker	Elastosil E43	Adhesive for the assembly of the imaging chamber
Ultimaker CPE 2.85 mm transparent	Ultimaker	8718836374869	Copolyester filament for 3D printer to print parts of the imaging chamber
Technical equipment and software
3D printer	Ultimaker	Ultimaker 2+	Printing of imaging chamber
Automated water immersion system	Leica	15640019	Software-controlled water pump
Benchtop orbital shaker	Elmi	DOS-20M	Sample incubation at room temperature (~ 150 rpm)
Benchtop orbital shaker, heated	New Brunswick Scientific	G24 Environmental Shaker	Sample incubation at 37 °C (~ 150 rpm)
Confocal laser scanning microscope	Leica	DMI 6000 TCS SP5	Inverted confocal microscope for sample imaging
Fiji	NIH (ImageJ)	open source software (v1.52h)	Image processing package based on ImageJ
Long working distance water immersion objective	Leica	15506360	HC PL APO 40x/1.10 W motCORR CS2
Vibratome	Leica	VT1200S	Sample slicing
Workstation	Dell	Precision 7920	CPU: Intel Xeon Gold 5118 GPU: Nvidia Quadro P5000 RAM: 128 GB 2666 MHz DDR4 SSD: 2 TB
Primary antibodies
Goat anti-RABV N	Friedrich-Loeffler-Institut		Monospecific polyclonal goat anti-RABV N serum, generated by goat immunization with baculovirus-expressed and His-tag-purified RABV nucleoprotein N Dilution: 1:400
Rabbit anti-GFAP	Dako	Z0334	Polyclonal antibody (RRID:AB_10013382) Dilution: 1:100
Rabbit anti-MAP2	Abcam	ab32454	Polyclonal antibody (RRID:AB_776174) Dilution: 1:250
Rabbit anti-RABV P 160-5	Friedrich-Loeffler-Institut		Monospecific polyclonal rabbit anti-RABV P serum, generated by rabbit immunization with baculovirus-expressed and His-tag-purified RABV phosphoprotein P (see reference 23: Orbanz et al., 2010) Dilution: 1:1,000
Secondary antibodies
Donkey anti-goat IgG	Thermo Fisher Scientific	depending on conjugated fluorophore	Highly cross-absorbed Dilution: 1:500
Donkey anti-mouse IgG	Thermo Fisher Scientific	depending on conjugated fluorophore	Highly cross-absorbed Dilution: 1:500
Donkey anti-rabbit IgG	Thermo Fisher Scientific	depending on conjugated fluorophore	Highly cross-absorbed Dilution: 1:500
Goat anti-mouse IgG	Thermo Fisher Scientific	depending on conjugated fluorophore	Highly cross-absorbed Dilution: 1:500
Goat anti-rabbit IgG	Thermo Fisher Scientific	depending on conjugated fluorophore	Highly cross-absorbed Dilution: 1:500