أداء الطيفي علي جسيمات نانويه Plasmonic مع القائم علي انتقال Nomarski نوع التداخل التفاضلي التباين المجهر

Summary

والهدف من هذا البروتوكول هو التفصيل نهج ثبت لاعداد عينات جسيمات متناهي plasmonic ولأداء الطيفية الجسيمات واحد عليها مع تباين التداخل التفاضلي (DIC) المجهر.

Abstract

المجهر التفاضلي التباين (DIC) هو أداه التصوير القوية التي تستخدم الأكثر شيوعا لتصوير الأجسام المجهرية باستخدام ضوء المدى المرئي. والغرض من هذا البروتوكول هو التفصيل طريقه ثبت لاعداد عينات جسيمات متناهي plasmonic وأداء الطيفية الجسيمات واحد عليها مع المجهر DIC. ويجب اتباع العديد من الخطوات الهامه بعناية من أجل اجراء تجارب طيفيه قابله للتكرار. أولا ، يمكن حفر المعالم في الركيزة العينة ، والتي تساعد في تحديد مكان سطح العينة وفي تتبع المنطقة من الفائدة اثناء التجارب. بعد ذلك ، يجب تنظيف الركيزة بشكل صحيح من الحطام والملوثات التي يمكن ان تعيق أو تحجب فحص العينة. بمجرد ان يتم اعداد عينه بشكل صحيح ، يجب محاذاة المسار البصري لمجهر ، وذلك باستخدام كولر الاضاءه. مع معيار Nomarski نمط DIC المجهر ، قد يكون من الضروري دوران العينة ، لا سيما عندما الجسيمات النانويه plasmonic تظهر الخصائص البصرية التي تعتمد علي الاتجاه. لان المجهر DIC لديه اثنين من حقول الاستقطاب المتعامد المتاصله ، ونمط التباين DIC تعتمد علي الطول الموجي يكشف عن اتجاه جسيمات نانويه plasmonic علي شكل قضيب. وأخيرا ، يجب الاضطلاع بعناية بعمليات الحصول علي البيانات وتحليل البيانات. من الشائع ان تمثل بيانات الطيف الطيفي المستندة إلى DIC كقيمه تباين ، ولكن من الممكن أيضا تقديمها كبيانات كثافة. في هذه المظاهرة من DIC لطيفي الجسيمات واحد ، والتركيز علي جسيمات نانويه الذهب علي شكل كرويه وقضيب.

Introduction

ومنذ الثمانينات ، ينظر إلى المجهر التفاضلي المتباين للتداخل (DIC) إلى حد كبير علي انه طريقه تصوير مهمة محجوزه للأجسام المجهرية داخل العلوم البيولوجية. مهما, اثناء تطويره في الخمسينات والستينات, كان نويت هو كتقنية ل [متريلس] علم¹. مع التطورات الاخيره في العلوم المادية المتعلقة بالجسيمات النانويه plasmonic ، وقد تم زيادة الاهتمام في توصيف المواد مع المجهر البصري مكان.

العديد من التقنيات البصرية هي بالتاكيد متاحه لتوصيف نانوماتيريال (علي سبيل المثال ، الحقل المظلم ، برايت فيلد ، الاستقطاب الضوء ، فلوري ، الخ). الحقل المظلم هو شعبيه علي نطاق واسع في البحوث الجسيمات متناهية ، ولكنه يعتمد فقط علي جمع مبعثر ويوفر معلومات محدوده حول العينات المعقدة². الفلورية يمكن ان تكون مفيده ، ولكن فقط مع العينات التي الاناره أو التي يمكن ان تكون ملطخه بشكل صحيح. المجهر DIC لديه العديد من الصفات التي تجعل من أداه قيمه لتحليل الجسيمات النانويه. المزايا الأكثر شيوعا من DIC بالمقارنة مع غيرها من الطرق وفيما يتعلق بجسيمات نانويه plasmonic هي: لا تلطيخ عينه المطلوبة ، لا اثار هاله ، عمق الضحلة من الميدان ، وارتفاع القرار الجانبي³. DIC لديها نقاط القوه الاضافيه التي هي قيمه للبحوث جسيمات متناهي plasmonic. أولا وقبل كل شيء ، يوجد حقلان للاستقطاب المتاصل والمتعامد ، ويمكن قياسهما في وقت واحد لأغراض الطيفية². ثانيا ، لا يتم التقاط اشاره الاستقطاب من الجسيمات النانويه في الصورة النهائية²، والتي يمكن ان تكون سببا للقلق الشديد في القياسات الطيفية الميدانية المظلمة.

الغرض من هذه المقالة هو توفير منهجيه واضحة لاستخدام المجهر الضوئي المرسلة الخفيفة لاجراء الطيفي علي جسيمات نانويه plasmonic. علي الرغم من ان DIC هو تقنيه قويه التي يمكن تطبيقها علي مواد متنوعة للغاية ، بل هو أيضا تقنيه تتطلب مهارة كبيره وفهم لتشغيله بشكل صحيح عند التصوير النانويه. المجهر المستندة إلى ناقل الحركة Nomarski DIC لديه مسار ضوء معقده¹ التي سيتم فقط استعراضها بإيجاز هنا. يتم عرض القطار البصري من DIC في الشكل 1. وينتقل الضوء من خلال المجهر أولا يتم تمريرها من خلال المستقطب والمنظور تقسيم شعاع Nomarski قبل ان تركز علي المكثف علي الطائرة عينه. بعد المرور من خلال الهدف ، والضوء يصادف شعاع الجمع بين المنشور Nomarski ومحلل قبل الخروج إلى كاشف. المستقطبات اثنين والمناشير Nomarski هي حاسمه لتشكيل الصورة DIC وهي المسؤولة عن إنتاج المجالات الاستقطاب المتعامدين DIC¹. للقارئ المهتمة في معرفه المزيد عن مبادئ العمل والمسار البصري من المجاهر DIC Nomarski ، أو الاختلافات بين Nomarski DIC وأنماط أخرى من DIC ، يرجى الرجوع إلى حسابات أخرى مكتوبه بشكل جيد علي هذه المواضيع^{1، 4 , 5 , 6 , 7}-

من المهم بنفس القدر لفهم الطبيعة الاساسيه للجسيمات النانويه plasmonic قبل محاولة اجراء الطيفي عليها ، سواء كان ذلك مع Nomarski DIC ، حقل مظلم ، أو اي تقنيه المجهر الأخرى. في مجال plasmonics ، يتم تعريف جسيمات نانويه الجسيمات مع ابعاد علي مقياس 10-100 nm^8،9. يمكن ان تاخذ الجسيمات النانويه علي العديد من الاشكال (علي سبيل المثال ، المجالات ، القضبان ، النجوم ، الاثقال ، الخ) ، ومعظم خصائصها الهامه تنشا من التفاعلات مع الضوء في نطاق الاشعه فوق البنفسجية المرئي-القريب من الطيف الكهرومغناطيسي. ولا يقتصر مصطلح "plasmonic" علي الجسيمات النانويه¹⁰؛ ومع ذلك ، عند مناقشه الجسيمات النانويه ، يتم استخدامه في الاشاره إلى الصدى الموضعي لسطح البلازما (LSPR خاص). [لسد] ظاهره في اي التوصيل الكترونات في [جسيمات متناهي] يتذبذب واجبه إلى [كولومبيك] تفاعل مع إشعاع كهرومغناطيسية من جدا محدده ونسبيا ضيقه تردد نطاق⁸. في هذه الترددات نفسها ، والجسيمات النانويه plasmonic تظهر زيادة امتصاص وتشتت الضوء ، مما يجعلها قابله للملاحظة مع المجهر البصري. في كثير من الحالات ، يفضل ان نلاحظ الجسيمات النانويه في حين وضع مرشحات الممرات قبل المكثف²، لتحسين التباين التصوير والقضاء علي الضوء الذي يفشل في الحث علي تاثير lspr. كما ان استخدام الفلاتر يجعل من الممكن اجراء تجارب طيفيه واحده للجسيمات.

السلوك البصري المرتبط بالشركة يعتمد إلى حد كبير علي حجم وشكل الجسيمات النانويه ، ويمكن التحقيق مع العديد من تقنيات المجهر البصري. ومع ذلك ، من أجل فك المعلومات التوجيهية من الجسيمات النانويه plasmonic مع التباين (اي غير كرويه) الشكل ، فمن الضروري استخدام الاستقطاب من حقل الضوء. بالتناوب بعناية حقل الاستقطاب أو الركيزة عينه بزيادات صغيره ، فمن الممكن لمراقبه الخصائص الطيفية التي تعتمد علي الاتجاه من الجسيمات النانويه الفردية. ويمكن ان يساعد الدوران والاستقطاب أيضا في تحديد ما إذا كانت السمة الطيفية ناجمه عن تذبذب النظام القطبي أو الأعلى للكترونات سطح الجسيمات متناهي. ومع ذلك ، ففي حاله الجسيمات النانويه الانسيابية (اي كرويه) ، يظل الملف الطيفي بدون تغيير أساسا عند تدوير العينة تحت ضوء مستقطب.

عند عرضها من خلال المجهر DIC (الشكل 2) ، والجسيمات النانويه لديها قرص مهواه مع مظهر الظل الزهر الأبيض والأسود ضد خلفيه رمادية. سوف الجسيمات النانويه كرويه الاحتفاظ بهذا المظهر تحت التناوب ومع تغيير مرشحات ممر. ومع ذلك ، فان الجزيئات تتلاشي تدريجيا من وجهه نظر كما يصبح الطول الموجي المركزي للمرشح أكثر فصلها من المجال الوحيد القطبية الطول الموجي LSPR¹¹. ظهور nanorods يمكن ان تتغير بشكل كبير جدا لأنها استدارة². Nanorods لديها اثنين من العصابات LSPR مع السلوك ثنائي القطبية ، والموقع الذي يستند إلى الابعاد المادية لل nanorods. عندما المحور الطولي لل nanorod هو المنحى موازيه لواحده من حقول الاستقطاب DIC ، فان القرص مهواه تظهر جميع الأبيض أو كل الأسود إذا كان ينظر اليها مع فلتر ممر المرتبطة بهذا الطول الموجي LNNNN. بعد تناوب عينه 90 درجه ، وسوف يستغرق علي اللون المعاكس. بدلا من ذلك ، نظرا لان المحور العرضي ل nanorod متعامد مع المحور الطولي ، فان القضيب سياخذ اللون المعاكس عند التبديل بين الفلاتر التي تتطابق مع الأطوال الموجية لجهاز الدوران للمحورين. في الاتجاات الأخرى وإعدادات التصفية ، سوف تظهر nanorods أكثر مثل المجالات ، وتقديم مجموعه متنوعة من أنماط القرص مهواه الظل المصبوب. ل nanorods مع محور عرضيه < 25 نانومتر ، فانه يمكن ان يكون من الصعب الكشف عن اشاره في هذا الطول الموجي LNN'S باستخدام المجهر DIC.

لاجراء الطيف الطيفي للجسيمات المفردة ، من المهم استخدام المكونات البصرية الصحيحة ومحاذاتها بشكل صحيح. يجب استخدام هدف قادر علي المجهر DIC. للتجارب الجسيمات واحد ، 80x أو 100x أهداف النفط مثاليه. Nomarski DIC المناشير عاده ما تاتي في ثلاثه أصناف: القياسية ، وارتفاع التباين ، وارتفاع القرار. النوع المثالي يعتمد بشكل كبير علي الغرض من التجربة وحجم الجسيمات النانويه. المناشير القياسية علي ما يرام بالنسبة للعديد من التجارب; ولكن عند العمل مع الجسيمات النانويه الصغيرة (< 50 نانومتر) ، يمكن ان تكون المنشورية عاليه التباين مفيده ، حيث ينخفض تباين الجسيمات مع انخفاض حجم الجزيئات¹¹. يتم تحقيق ضبط التباين DIC اما عن طريق تدوير المستقطب أو عن طريق ترجمه واحده من الprisms DIC ، اعتمادا علي العلامة التجارية المجهر أو نموذج⁶.

بعد اعداد أضاءه كولر وإعدادات الاستقطاب ، من المهم عدم تعديل هذه الإعدادات اثناء جمع بيانات الطيف الطيفي. وعلاوة علي ذلك ، يجب الحفاظ علي متوسط ثابت لاشاره الخلفية في جميع الأوقات اثناء جمع البيانات ، حتى عند التبديل بين الفلاتر وإعدادات الزاوية. تعتمد قيمه الخلفية المثالية الفعلية علي النطاق الديناميكي للكاميرا العلمية ، ولكن بشكل عام ، يجب ان تكون الخلفية في نطاق 15% – 40% من مستوي الكشف الأقصى للكاميرا. وهذا يقلل من احتمال تشبع مستشعر الكاميرا مع تمكين التباين الأمثل للجسيمات. لجمع بيانات الطيف الطيفي ، من الضروري العمل مع كاميرا علميه تلتقط الصور بالأبيض والأسود ، بدلا من الكاميرا الملونة.

اعداد العينة هو جانب آخر حرجه من التصوير النانويه plasmonic. فمن المحتم ان مشغلي المجهر DIC لديهم فهم الخصائص البصرية للعينه والركيزة العينة. "قبل تنظيف" المجهر الزجاج ليست مستعدة بما فيه الكفاية للتصوير النانويه ، ويجب أعاده تنظيفها بشكل صحيح قبل ترسب عينه لضمان المراقبة دون عائق من العينة. تم توثيق العديد من بروتوكولات التنظيف لشرائح المجهر سابقا¹²، ولكنها ليست خطوه التي يتم الإبلاغ عنها عاده في الدراسات التجريبية.

وأخيرا ، فان أساليب تحليل البيانات هي المكون النهائي للتحليل الطيفي للجسيمات الواحدة. ويجب قياس الكثافة القصوى والدنيا لكل جسيمات متناهي ، فضلا عن متوسط الخلفية المحلية. يجب ان تكون الجزيئات ذات الاهميه موجودة في المناطق التي لا يوجد بها حطام خلفي أو عيوب في الركيزة أو أضاءه غير متساوية. طريقه واحده لتحديد الملامح الطيفية لجسيمات متناهي هو عن طريق حساب تباين الجسيمات في كل طول موجي ، وذلك باستخدام المعادلة أدناه^{11،13،14،15}:

وبدلا من ذلك ، يمكن تقسيم طيف الجزيء الواحد إلى مكونات الاشاره القصوى والدنيا الفردية ، والتي تمثل مجالي الاستقطاب في DIC ، التالي عرض الأطياف التي تعتمد علي directionally والتي تم جمعها في نفس الوقت ، من خلال المعادلتين:

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. اعداد العينة مع الشرائح المجهر الزجاج القياسية

1. اعداد الشرائح المجهر الزجاجي لترسب عينه.
   ملاحظه: في بعض الحالات ، قد يكون من الأنسب لتخزين الزجاج في الماء فائق النقاء بدلا من الايثانول. ومع ذلك ، تخزين في الماء أو الهواء يجعل الزجاج مسعور مع مرور الوقت.
   1. للحصول علي أفضل النتائج ، وشراء الزجاج أو الكوارتز الشرائح المجهر وتغطيه الزجاج.
   2. باستخدام قلم خربشه ، ضع علامة خدش ضحلة وقصيرة علي وسط كل زلة غطاء زجاجي.
   3. تنظيف جميع الزجاج المجهر ، حتى لو تم شراؤها "قبل تنظيفها" ، لأزاله شظايا الزجاج ، والغبار ، ومسحوق ، وبقايا العضوية ، وأي ملوثات أخرى تؤثر علي جوده التصوير أو ترسب عينه.
      ملاحظه: هذه الطريقة التنظيف أدناه يعمل بشكل جيد لأنواع العينات الموصوفة هنا ويتجنب استخدام المواد الكيميائية القاسية. يمكن ان المواد الكيميائية اقسي حفر الزجاج وتتطلب المزيد من الرعاية في المناولة والتخلص منها.
      1. وضع الزجاج المجهر علي رفوف التخزين ثم في الكاس ، أو في جره تلطيخ. لا تضع الزجاج المجهر في الجزء السفلي من الأكواب وغيرها من الأواني الزجاجية مختبر دون الإجهاد ، وذلك لان كل قطعه وسطح الزجاج المجهر ينبغي ان تتعرض تماما لوكلاء التنظيف.
      2. صب ~ 1 مل من المنظفات السائلة (جدول المواد) في الحاوية واعلي قباله الحاوية مع الماء. سوكاتي لمده 30 دقيقه.
         ملاحظه: بمجرد بدء عمليه التنظيف ، والتعامل مع الزجاج فقط اثناء ارتداء القفازات ، لتجنب ترك بقايا بصمات الأصابع علي الزجاج.
      3. صب المحتويات السائلة من حاويه التنظيف في بالوعة. شطف الحاويات عده مرات مع الماء نقاء لأزاله كل مظهر من المنظفات. أعاده ملء الحاوية بالماء فائق النقاء. سوكاتي الحاوية مع الزجاج المجهر لمده 30 دقيقه أخرى.
      4. كرر الخطوة السابقة مره أخرى علي الأقل. اجراء جولات اضافيه من سونيكيشن في الماء حتى انه من الواضح ان جميع اثار المنظفات قد أزيلت.
      5. صب محتويات حاويه التنظيف. شطف الحاوية بالماء فائق النقاء. أعاده ملء الحاوية مع الايثانول. الزجاج المجهر سوكاتي لمده 30 دقيقه.
      6. صب محتويات حاويه التنظيف في حاويه نفايات. أعاده ملء مع الايثانول. تغطيه الحاوية لمنع فقدان الايثانول من خلال التبخر. تخزين الزجاج المجهر في هذه الحاوية حتى وقت التجربة. تبقي الشرائح نظيفه وقابله للاستخدام طالما انها تبقي مغمورة في الايثانول داخل حاويه مغطاه.
2. اعداد الحل الجسيمات متناهي
   1. باستخدام الماصات المجهرية ، قم بازاله 100 μL من 0.05 mg/mL محلول جسيمات متناهي الذهب من حاويه التخزين الاصليه وإخراج الحل إلى أنبوب الطرد المركزي 1.5 mL.
   2. الطرد المركزي العينة لمده 10 دقيقه في 6,000 x g.
   3. أزاله ماده طافي مع ميكروماص ، من أجل أزاله السطحي الزائد.
   4. باستخدام ميكروماص ، ضع 100 μL من الماء فائق النقاء في أنبوب الطرد المركزي.
      ملاحظه: إذا لم يكن كل من ماده طافي يمكن ازالتها في المحاولة الاولي ، كرر الخطوات طرد وأعاده التعليق.
   5. لفتره وجيزة دوامه العينة لأعاده تعليق بيليه. [سنوكت] فورا [افتروردس] ل 20 [مين] ان تماما [ربرك] ويكسر فوق جسيمات متناهي مجاميع.
      ملاحظه: إذا لم يتم استخدام العينة علي الفور ، يجب ان تكون سونيكاتيد مره أخرى لمده 20 دقيقه قبل إيداع الحل علي الزجاج المجهر.
3. عينه ترسيب
   1. أزاله كشوف الغطاء المنظفة والشرائح المجهر من حاويات التخزين الخاصة بهم. ضربه جافه الزجاج مع النيتروجين المضغوط أو الارجون.
   2. باستخدام الماصة الصغيرة ، قطره 6 μL من محلول جسيمات متناهي من الخطوة التالية إلى زلة الغطاء. لنشر قطره بالتساوي ، ضع بعناية الثاني ، قطعه أكبر من الزجاج المجهر علي راس زلة الغطاء ، مثل زلة الغطاء الثاني أو شريحة المجهر. تجنب الحصول علي فقاعات الهواء المحاصرين بين قطعتين من الزجاج.
      1. تحويل الركيزة العينة أكثر ، وختم قباله حواف زلة الغطاء مع خط ضيق من طلاء الأظافر من أجل منع تبخر الحل المتوسط.
      2. بدلا من ذلك ، لصوره العينة "الجافة" ، والسماح للحل للوقوف لمده 5-15 دقيقه علي زلة الغطاء ، قبل أزاله قطعه غير المرغوب فيها من الزجاج. ضربه برفق زلة الغطاء الجاف مع النيتروجين المضغوط أو الارجون.
   3. إذا كان ذلك ممكنا ، عينات الصورة مباشره بعد التحضير. إذا لم يكن ذلك ممكنا ، قم بتخزين العينات في حاويه مغطاه ، مثل طبق بيتري حتى التصوير.

2. التصوير الضوئي

1. محاذاة الهدف والمكثف.
   1. بعد وضع العينة علي المجهر ، والعثور علي المستوي البؤري مع العينة علي ذلك. أولا تحديد موقع والتركيز علي علامة الصفر التي تم إنشاؤها في وقت سابق. ثم صقل التركيز حتى الجسيمات النانويه تاتي في الاعتبار.
   2. لتحديد موضع دقيق من المكثف ، والاستفادة من أسلوب الاضاءه كولر. ⁵ كولر الاضاءه في التكبير العالي (80x ، 100x) هو أكثر سهوله يتحقق من خلال الاعداد الاولي للاضاءه كولر في التكبير اقل ، مثل 20x.
      ملاحظه: عاده ، كولر الاضاءه لا تحتاج إلى أعاده ضبطها اثناء التصوير من عينه واحده. ومع ذلك ، فمن الممارسة الجيدة للتحقق من ان الاضاءه كولر يتم تعيينها بشكل صحيح عند التبديل إلى شريحة المجهر الجديد.
2. تحسين إعدادات التباين.
   1. حدد منطقه الاهتمام داخل العينة للتصوير. توسيط المنطقة في مجال رؤية الكاميرا واضبط التركيز حسب الضرورة.
      1. إذا كان المجهر لديه تصميم دي Senarmont ، تبدا مع المستقطب تعيين بالقرب من الحد الأقصى للانقراض الخلفية وتناوب تدريجيا الاستقطاب نحو خفض الانقراض الخلفية. ستزداد كثافة الخلفية تدريجيا.
      2. إذا لم يكن المجهر لديها تصميم Senarmont دي ، تبدا مع القطار البصرية التي تم تعيينها في الحد الأقصى من الانقراض الخلفية. في هذه الحالة ، ضبط تدريجيا موقف المنظور الموضوعي نحو خفض انقراض الخلفية.
         ملاحظه: يتم تحقيق الاعداد المثالي عندما تصل الجسيمات النانويه إلى أكبر فرق الكثافة (اي التباين) من قيمه الخلفية المحلية المتوسطة. لجسيمات نانويه plasmonic ، وعاده ما يتحقق التباين الأمثل مع خلفيه داكنه نسبيا ، التالي في الإعدادات بالقرب من الحد الأقصى لانقراض الخلفية.
3. صوره العينة.
   1. إيقاف تشغيل أضاءه الغرفة لمنع الاضاءه الضالة من التفاعل مع العملية.
   2. اثناء عرض الجسيمات النانويه مع كاميرا التصوير العلمي ، تحديد مستوي الخلفية الأمثل. باستخدام العرض الكامل 10 نانومتر في نصف الحد الأقصى (FWHM) مرشح ممر مع الطول الموجي المركزية المشتركة التي تقع مع الطول الموجي الرئيسي لل ، وعرض المنطقة من الفائدة. اضبط كثافة المصباح أو وقت التعريض الضوئي حتى يكون مستوي الخلفية في نطاق 15% – 40% من مستوي السعه القصوى للكاميرا ولا توجد كائنات داخل المنطقة ذات كثافة اشاره المعرض التي تتجاوز 90% من مستوي الكثافة الأقصى للكاميرا.
      ملاحظه: الهدف من الخطوة 2-3-2 لمنع تشبع جهاز الاستشعار عند التبديل بين عوامل التصفية. سيختلف مستوي الخلفية المثالي بين العينات والكاميرات. وبمجرد الانتهاء من هذه الخطوة ، يمكن تعديل وقت التعرض ولكن ليس كثافة المصباح.
   3. صوره العينة مع سلسله من مرشحات الممرات التي لديها كل FWHM من 10 نانومتر وانه ككل تمكين التصوير عبر نطاق الطول الموجي بأكمله من الفائدة. تاكد من ان كثافة الخلفية تبقي متناسقة من الصورة إلى الصورة (داخل ~ 5% من بعضها البعض) عن طريق ضبط وقت التعرض. بعد تبديل الفلاتر ، أعد تركيز العينة قبل التقاط الصورة.
   4. احفظ الصور كملفات TIFF غير مضغوطه و/أو في تنسيق الملف الأصلي للبرنامج ، من أجل الحفاظ علي كافة المعلومات.
4. تدوير العينة.
   1. بعد جمع الصور من العينة في موقفها الأصلي ، يمكن الآن ان تكون العينة استدارة والذين لديهم اتجاات اضافيه في مسار الضوء. قم باجراء الاستدارة علي فترات منتظمة (علي سبيل المثال ، 10 درجات أو 15 درجه) عبر نطاق 180 درجه أو 360 درجه.
      ملاحظه: يتطلب التدوير مرحله عينه قابله للتدوير.
   2. كما هو الحال في الأقسام 2.1-2.3 ، اضبط إعدادات الكاميرا لتوفير مستوي خلفيه متناسق من الصورة إلى الصورة.
      ملاحظه: لا ينبغي اجراء اي تعديل علي الاضاءه كولر.

3. تحليل البيانات باستخدام ImageJ

ملاحظه: يمكن اجراء العمليات الحسابية التالية في مجموعه متنوعة من حزم البرامج ، وأحيانا في البرنامج الأصلي المستخدمة لجمع الصور. ImageJ هو برنامج متاح مجانا من المعاهد الوطنية للصحة.

1. احسب تباين الجسيمات أو شدتها.
   1. افتح الصورة باستخدام ImageJ.
   2. حدد أداه المستطيل وارسم مستطيلا حول المنطقة الرئيسية التي تهمك.
   3. علي شريط الاداات ، حدد الصورة ، ثم التكبير ، ثم إلى التحديد. سيتم تكبير نافذه التصوير في المنطقة المحددة.
   4. في شريط الاداات ، حدد الصورة ، ثم اضبط، ثم السطوع /التباين. تظهر نافذه جديده. لتمكين عرض أفضل لمنطقه العينة ، اضبط الإعدادات الاربعه: الحد الأدنى والأقصى والسطوع والتباين. هذه التعديلات لا يغير البيانات العلمية ، فانها مجرد تمكين رؤية أفضل للمنطقة عينه.
      ملاحظه: قد يتم تنفيذ الخطوات 3-1-3 و 3-1-4 عده مرات وبترتيب عكسي.
   5. باستخدام أداه المستطيل مره أخرى ، ارسم مربعا حول الجسيمات متناهي الاولي التي سيتم قياسها. يجب ان يكون مربع أكبر قليلا فقط من القرص مهواه جسيمات متناهي.
   6. علي شريط الاداات ، حدد تحليل، ثم قياس. يظهر اطار جديد يبلغ عن الحد الأدنى والحد الأقصى والشدة المتوسطة للبيكسلات الموجودة داخل المربع المحدد.
   7. اسحب المربع المستخدم لقياس الجسيمات متناهي إلى منطقه مجاوره مباشره للجسيم ، حيث يكون التباين في الخلفية نسبيا حتى ولا توجد جزيئات أو ملوثات موجودة. الاحتفاظ بالحجم الأصلي للمربع.
   8. استخدم أداه القياس لتحديد الكثافة المتوسطة لمنطقه الخلفية.
   9. قياس الجزيئات المتبقية ومنطقه الخلفية المجاورة لكل منهما.
   10. كرر العملية لكل الجسيمات في جميع الصور في السلسلة.
   11. تصدير البيانات إلى جدول بيانات لحساب التباين أو كثافة كل الجسيمات ، عبر جميع الأطوال الموجية والزوايا.
   12. حساب تباين كل الجسيمات ، باستخدام المعادلة التالية^13،14،15:
       
       ملاحظه: استخدام هذه المعادلة ، يجب ان يكون التباين الجسيمات دائما > 0.
   13. احسب القيمة القصوى المعدلة للخلفية الخاصة بالجسيمات من خلال قسمه الحد الأقصى لكثافة الجسيمات المقيسة علي الخلفية بمعني:
       
   14. المثل ، يحسب الحد الأدنى للقيمة المعدلة في الخلفية عن طريق قسمه كثافة الجسيمات الدنيا المقاسه حسب الخلفية علي ما يلي:
       
       ملاحظه: كما هو محسوب ، يجب ان يكون الحد الأقصى قيمه أكبر من واحد ، بينما الحد الأدنى سيكون اقل من واحد. من المقبول طرح كل قيمه بواسطة "1" ، بحيث يكون متوسط الخلفية صفرا ، ويتم تمثيل الحد الأقصى كقيمه موجبه ، ويتم تعيين القيمة الدنيا بقيمه سالبه¹⁶. هذا النهج الأخير يسمح للمحلل بالنظر بشكل منفصل في ما يحدث علي طول كل من حقول الاستقطاب ، وهو أمر مفيد عند دراسة الجزيئات المتباينة الخواص.
   15. للرسم البياني للتشكيل الطيفي في موضع جسيمات متناهي معين ، ارسم بيانات بالطول الموجي علي المحور س والتباين أو الكثافة علي طول محور y.
   16. لرسم التشكيل الجانبي للتناوب في الطول الموجي المعطي ، ارسم زاوية الاستدارة علي المحور س والتباين أو الكثافة علي طول محور y.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

عند العمل مع العينات التي هي كبيره بما يكفي ان ينظر اليها مع العين المجردة ، ووضع المعالم علي الركيزة الزجاجية ليست مطلوبه عاده. ومع ذلك ، عند العمل مع المواد النانويه أو عند الحاجة إلى دوران العينة ، يمكن ان توفر المعالم طريقه سهله لتحديد موقع العينة وتمييزها وتتبع اتجاه...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

عند التصوير مع المجهر DIC ، فمن المهم لتحسين المكونات البصرية قبل جمع البيانات. حتى التعديلات الطفيفة علي المستقطب في منتصف التجربة يمكن ان تؤدي إلى تاثيرات كبيره علي البيانات النهائية⁶. وعلاوة علي ذلك ، تتطلب مواد مختلفه إعدادات الاستقطاب مختلفه. علي الرغم من انه تم استخدام اح...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Contrad 70	Decon Labs, Inc.	1002	For cleaning microscope glass, Available through many chemical suppliers
Ethanol	Fisher Scientific	A962-4	For cleaning and storing microscope glass
Glass microscope cover slips	Ted Pella	260148
Glass microscope slides	Ted Pella	26007
Gold nanorods	Nanopartz	DIAM-SPR-25-650
Gold nanospheres (80 nm)	Sigma Aldrich	742023-25ML
ImageJ	NIH	N/A	Free Software availabe for data analysis from NIJ
Nail polish	Electron Microscopy Sciences	72180
Nikon Ti-E microscope	Nikon	N/A
Nitrogen gas	Airgas	N/A
ORCA Flash 4.0 V2+ digital sCMOS camera	Hamamatsu	77054098
Scribing pen	Amazon	N/A	Many options available online for under $10. Not necessary to buy an expensive version.
Ultrapure water			18 megaohm