تقييم مخاطر الإصابة بسرطان القولون والمستقيم وانتشاره عن طريق الكشف عن سلامة الحمض النووي البراز

Summary

مجموعة FL-DNA التشخيصية المقدمة هي طريقة موفرة للوقت وسهلة الاستخدام لتحديد الاحتمال الموثوق بوجود آفات سرطان القولون والمستقيم.

Abstract

في الوقت الحاضر، يمكن عزل الحمض النووي البراز وتحليلها بعدة طرق. يمكن الكشف عن الأجزاء الطويلة من الحمض النووي في البراز عن طريق فحص qPCR ، مما يوفر احتمالًا موثوقًا به لوجود آفات القولون والمستقيم قبل النيوبلاستيك أو النيوبلاستيك. هذه الطريقة، تسمى الحمض النووي الطويل فلورسينس (FL-DNA)، هي إجراء سريع وغير جراحي يعد تحسينًا على نظام الوقاية الأولي. وتستند هذه الطريقة إلى تقييم سلامة الحمض النووي البرازي عن طريق التضخيم الكمي لأهداف محددة من الحمض النووي الجينومي. على وجه الخصوص ، فإن تقييم شظايا الحمض النووي لفترة أطول من 200 bp يسمح بالكشف عن المرضى الذين يعانون من آفات القولون والمستقيم مع خصوصية عالية جدا. ومع ذلك، فإن هذا النظام وجميع اختبارات الحمض النووي البراز المتاحة حاليا ً تعرض بعض القضايا العامة التي تحتاج إلى معالجة (على سبيل المثال، وتيرة إجراء الاختبارات والعدد الأمثل من عينات البراز التي يتم جمعها في كل نقطة زمنية لكل فرد). ومع ذلك ، فإن الميزة الرئيسية لFL-DNA هي إمكانية استخدامه بالاقتران مع اختبار يستخدم حاليًا في برنامج فحص CRC ، المعروف باسم اختبار الدم الغامض البرازي القائم على البيوكيميائية المناعية (iFOBT). في الواقع ، يمكن إجراء كلا الاختبارين على نفس العينة ، مما يقلل من التكاليف ويحقق تنبؤًا أفضل بوجود آفات القولون والمستقيم في نهاية المطاف.

Introduction

سرطان القولون والمستقيم (لجنة حقوق الطفل) مستمد من عملية متعددة الخطوات التي يتطور الظهارة الصحية ببطء إلى أورام غدية أو الاورام الحميدة ، والتي تتطور إلى الأورام السرطانية الخبيثة مع مرور الوقت^1،2. وعلى الرغم من ارتفاع معدل الإصابة في اتفاقية حقوق الطفل، لوحظ اتجاه تنازلي في النسبة المئوية للوفيات على مدى العقد الماضي^3. في الواقع، أدت أدوات التشخيص المبكر المعتمدة في برامج الفحص إلى الكشف المبكر وإزالة الأورام الحميدة قبل النيوبلاستيك أو الاورام الحميدة⁴. ومع ذلك ، نظرا لاختلاف الحدود التقنية ، لا شيء من هذه الأساليب هو الأمثل. في الواقع، من أجل تحسين الحساسية والتحديد، وقد اقترح العديد من اختبارات الحمض النووي البراز وحدها أو في تركيبة مع الاختبارات التشخيصية الروتينية الحالية^5,6.

عادة ، يلقي الغشاء المخاطي الصحي في الخلايا القولونية المبرئة في تيار البراز ، في حين أن الغشاء المخاطي المريض يقشر الخلايا القولونية غير المبرمجة. أجزاء من 200 نقطة بريتيش بتروليوم أو أكثر في الطول تميز الحمض النووي غير المبرمج. يسمى هذا الحمض النووي الحمض النووي الطويل (L-DNA) وأصبح علامة بيولوجية قابلة للاستخدام للتشخيص المبكر للجنة حقوق الطفل. يمكن عزل L-DNA من عينة البراز وكميا من قبل qPCR باستخدام في⁷المختبر التشخيص FL-DNA عدة^{7,8,,9,,10,,11,,12}.

يتكون الاختبار من اثنين من المقالات للكشف عن شظايا FL-DNA تتراوح بين 138 نقطة أساس إلى 339 نقطة بالثانية. كل فحص يسمح تضخيم FL-DNA (FAM) وكذلك ارتفاع في الحمض النووي (HEX). لضمان التضخيم الأمثل لجميع الشظايا، تم تقسيم الاختبار إلى قسمين (اسمه "A" و "B"). يكتشف الناياج A منطقتين من exon 14 من جين APC (NM_001127511) وجزء من exon 7 من جين TP53 (NM_001276760). يكتشف المنازى B جزءًا من exon 14 من جين APC (NM_001127511) ومنطقتين من الطاردات 5 و 8 من جين TP53 (NM_001276760). لا تميز المقالات بين المناطق المكتشفة. يتوافق الحمض النووي للارتفاع في الحمض النووي لحمض هونورينتشوس كيتا السلمون الحمض النووي ويمكّن من التحقق من أن الإجراء قد تم بشكل صحيح ويتحقق من الوجود المحتمل للمثبطات ، والتي قد تسفر عن نتائج سلبية كاذبة. يتم تقييم تركيز FL-DNA عن طريق التحديد الكمي المطلق باستخدام طريقة المنحنى القياسي ويتم التعبير عنه على أنه نانوغرام /رد فعل.

طريقة FL-DNA هي اختبار الحمض النووي البراز غير الغازية وغير مكلفة التي، جنبا إلى جنب مع اختبار الدم الخفي البرازي القائم على المناعة الكيميائية (iFOBT)، ويستخدم حاليا في برامج فحص لجنة حقوق الطفل ويسمح لتنبؤات أفضل من CRC و / أو آفات الورم الحميد عالية الخطورة¹².

Protocol

تم تعيين المرضى في Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) من Meldola (FC, Italy) بين عامي 2013 و 2015. وكان المرضى المسجلون في البروتوكول IRSTB002، الذي وافقت عليه لجنة الأخلاقيات في IRST - IRCCS AVR (25/10/2012، في ر. 1). وقد تم تنفيذ جميع الأساليب وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح ذات الصلة. وتم الحصول على موافقة خطية مستنيرة من جميع المرضى.

1. استخراج الحمض النووي من البراز

1. استخدام عدة لإعداد عينات البراز (انظر جدول المواد).) حدد وعالج مواد البراز عن طريق إجراء عملية الاستخراج وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة. تضخيم الحمض النووي النقي مباشرة أو تخزينها في -20 درجة مئوية للتحليل اللاحق.

2. إعداد السيطرة الإيجابية، والمعايير، وارتفاع في الحمض النووي، والعينات السريرية

1. إعداد المعايير والعينات
   1. لإعداد السيطرة الإيجابية، والمعايير، وارتفاع في الحمض النووي، وجميع العينات السريرية، وأجهزة الطرد المركزي aliquot من السيطرة الإيجابية، والمعايير، وارتفاع في الحمض النووي، ثم إعادة تعليق كل كاشف عن طريق إضافة الكمية الصحيحة من المياه المقدمة (انظر أدناه). ثم، دوامة بعناية السيطرة الإيجابية، القياسية، وارتفاع في الحمض النووي، ثم الطرد المركزي لمدة 10 s. لتحقيق إعادة تعليق كامل من الكواشف الجافة، وتخزين الكواشف السائلة في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 30 دقيقة قبل الاستخدام.
      1. التحكم الإيجابي هو الحمض النووي البشري في شكل جاف. إعادة تعليق كل aliquot مع 750 ميكرولتر من الماء.
      2. الحمض النووي الالارتفاعي هو سمك السلمون(Oncorhynchus keta)DNA ، والذي يستخدم كتحكم داخلي خارجي للتحقق من احتمال وجود مثبطات في عينات الحمض النووي المستخرجة من البراز. إعادة تعليق كل aliquot مع 100 ميكرولتر من الماء.
   2. لإعداد المنحنى القياسي، قم بإنتاج أربعة تخفيفات 1:5 بدءًا من محلول المخزون. يجب أن تكون النقاط القياسية 10 نانوغرام / رد فعل ، 2 نانوغرام / رد فعل ، 0.4 نانوغرام / رد فعل ، و 0.08 نانوغرام / رد فعل.
2. إعداد 1x ارتفاع في الحمض النووي
   1. إعداد ارتفاع في السيطرة على الحمض النووي مباشرة قبل الاستخدام.
   2. إعداد 1x ارتفاع في السيطرة على الحمض النووي عن طريق خلط 5 ميكرولتر من ارتفاع FL-DNa مع 20 ميكرولتر من الماء المعقم. وسيتم إعداد عدد عينات التحكم في الحمض النووي ذات الارتفاع الحاد 1x وفقا لعدد العينات التي سيتم تحليلها، بالإضافة إلى التحكم الإيجابي.
3. إعداد العينات
   1. مزيج 75 ميكرولتر من العينات (عينات سريرية أو التحكم الإيجابي) مع 25 ميكرولتر من 1x ارتفاع في الحمض النووي، مما أسفر عن حجم إجمالي قدره 100 ميكرولتر.

3. تضخيم وتحديد قيمة FL-DNA باستخدام qPCR Easy PGX

ملاحظة: يتم توفير خلائط التضخيم الكامل التي تحتوي على أجهزة تمهيدية محددة وتحقيقات تستهدف الحمض النووي البشري والرقابة الداخلية في شكل lyophilised في 8 شرائط بئر لـ FL-DNA Mix A و FL-DNA Mix B. Standards، والضوابط الإيجابية والسلبية، ويجب تضخيم العينات مع كل من الخلطات lyophilized. يجب فقط تضخيم العينات السريرية في مكررة مع كل من يمزج lyophilized.

1. انظر جدول المواد لأداة qPCR وبرامج التشغيل.
   1. افتح برنامج التشغيل واضبط اللوحة والملف الحراري:
      1. إعداد اللوحة كما هو موضح في الجدول 1.
         1. تعيين نوع البئر لجميع المواضع الثمانية في العمود 1 كمعيار.
         2. تعيين نوع البئر لآبار A2 و B2 كما NTC.
         3. تعيين نوع البئر لC2 و D2 (عناصر التحكم الإيجابية) كما غير معروف.
         4. تعيين نوع البئر لكافة المواضع الأخرى كـ غير معروف.
         5. حدد جميع المراكز الـ 96، وأضف Dyes FAM و HEX. انقر فوق لوحة المزامنة.
      2. تعيين التشكيل الحراري وفقا للجدول 2.
   2. الطرد المركزي العدد اللازم من شرائط ل10 ق لجلب محتويات إلى الجزء السفلي من الأنبوب.
   3. إزالة بلطف الأختام من شرائط، مع إيلاء الاهتمام للاحتفاظ محتويات، وإضافة إلى شرائط ذات الصلة: التحكم السلبي: 20 ميكرولتر من الماء؛ العينة: 20 ميكرولتر من الحمض النووي. منحنى قياسي: 20 ميكرولتر من المعيار 1 أو 2 أو 3 أو 4؛ التحكم الإيجابي: 20 ميكرولتر من التحكم الإيجابي.
   4. إغلاق بعناية جميع شرائط باستخدام 8 شريط القبعات البصرية المسطحة والدوامة لبضع ثوان.
   5. طرد مركزي شرائط لمدة 10 s وتحميلها في الصك. ثم ابدأ التشغيل.

4 - تحليل البيانات

ملاحظة: يمكن إجراء تحليل البيانات تلقائيًا أو يدويًا اعتمادًا على البرنامج (انظر جدول المواد).

1. في نهاية الشوط ، حدد الأعمدة A و C و E و G لـ"FAM: FL-DNA-A" و"HEX: IC"، والأعمدة B و D و F و H لـ"FAM: FL-DNA-B" و"HEX: IC".
2. تعيين ما يلي لكمية بدء الكميات القياسية:10 نانوغرام/ رد فعل لآبار A1 و B1، 2 نانوغرام/رد فعل لـ C1 و D1، 0.4 نانوغرام/رد فعل لـ E1 وF1، و0.08 نانوغرام/رد فعل لـ G1 وH1.
3. تعيين قيم الفلورسينس عتبة إلى 150 لكل من FAM (FL-DNA A و FL-DNA B) وHEX (IC) القنوات.
4. في جدول نتائجالمربع، انقر فوق خيارات العمود | حدد الكل | موافق للحصول على النتائج في كلتا القناتين مع كل من Cq (R) والقيم الأخيرة.
   ملاحظة: يتم توفير هذه القيم بواسطة برنامج أداة PCR الوقت الحقيقي. آخر مرة يتوافق مع قيمة الفلورسينس التي تم تطبيعها إلى دورة التضخيم الأخيرة.
5. في جدول النتائج في المربع، انقر بزر الماوس الأيمن على الجدول لفتح قائمة السياق وانقر فوق إرسال إلى Excel لتصدير البيانات الخام.
6. تحقق من قيم المعايير للتحقق من ملاءمة المنحنى القياسي.
7. لكل مزيج FL-DNA، تحقق من R² ["R² (-R)" العمود] والكفاءة ["الكفاءة (%)" عمود] القيم. إذا كانت في نطاق مقبول ، فمن الممكن المضي قدما في التحليل وفقا لتعليمات الشركة المصنعة(الجدول 3).
8. إذا لم تكن نتائج قناة FAM في النطاق المتوقع، قم بحذف نقطة واحدة من المنحنى القياسي وإعادة تحليل التشغيل.
9. تحديد قيم عناصر التحكم السلبية والإيجابية مع الصيغة التالية، مع الأخذ في الاعتبار قيم "لا Cq" كصفر:
   
   
10. قارن القيم التي تم الحصول عليها مع تلك التي تم الإبلاغ عنها في الجدول 4.
11. إذا كانت عناصر التحكم في التفاعل في نطاق القيم المتوقعة، فتابع تحليل العينات.
    ملاحظة: تحقق من أن قيم Cq التي تم الحصول عليها يتم إنشاؤها من تفاعل تضخيم حقيقي (منحنى الفلورسينس) وليس من قطعة أثرية (منحنى الفلورسينس الخطي).
12. لتحليل مدى ملاءمة العينة لكل مزيج FL-DNA، قارن قيم Cq لقناة HEX. إذا كانت القيمة ≥ 16، والمضي قدما في تحليل العينات. إذا كانت القيمة <16 أو لم يكن هناك Cq، فمن المحتمل أن يكون ذلك بسبب خطأ في الاستغناء عن FL-DNA Spike. لذلك، لا يمكن تحليل العينات.
13. حساب متوسط قيم CQ في قناة "HEX" للتحكم الإيجابي باستخدام الصيغة التالية:
    
14. حساب متوسط قيم CQ في قناة "HEX" من العينة ينسخ باستخدام الصيغة التالية:
    
15. حساب قيم CqHEX وفقا للصيغة التالية:
    
16. قارن قيم CqHEX للعينات مع تلك الواردة في الجدول 5.
17. لكل مزيج (ميكس A وMix B)، قارن قيم Cq لقناة FAM مع تلك الواردة في الجدول 6.
18. لتحديد قيمة FL-DNA لكل عينة مناسبة، استخدم الصيغة التالية، مع الأخذ في الاعتبار قيم "لا Cq" كصفر:
    
    
    ملاحظة: خطر الإصابة بسرطان القولون والمستقيم وانتشاره هو وظيفة من التقييمات iFOBT وFL-DNA وفقا لنتائج نومغرام فاغان التي حصلت عليها Rengucci وآخرون¹² (الجدول 7).

النتائج

يظهر سير عمل هذا البروتوكول في الشكل 1. يوفر سير العمل خطوتي تحكم وإجراءات مختلفة وفقًا لنتائج الخطوة هذه. أولاً، إذا كانت العينة تقدم عناصر تحكم غير مناسبة، يجب تكرار التضخيم. ثانياً، إذا تم تثبيط التضخيم، يجب إعادة معالجة العينة من البداية أو تصنيفها على أنها غير قيّمة.

Discussion

وقد أظهرت الدراسات السابقة أن تحليل سلامة الحمض النووي من البراز المستخرجة من النهج اليدوية وشبه التلقائية يمكن أن تمثل أداة بديلة للكشف المبكر عن آفات القولون والمستقيم^7،8،^{9,،10،11،12}

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL and 2 mL polypropylene twist-lock tubes (DNase-, RNase-, DNA-, PCR inhibitor-free)			Consumables required for DNA extraction and Real Time PCR
Absolute Ethanol (quality of analytical degree)			Reagent required for DNA extraction
Benchtop centrifuge			Maximum speed of 20000 x g. Instrument required for DNA extraction
EasyPGX analysis software version 2.0.0	Diatech Pharmacogenetics	RT800-SW	Analysis software
EasyPGX centrifuge/vortex 8-well strips	Diatech Pharmacogenetics	RT803	Instrument recommended for the Real Time PCR assay
EasyPGX qPCR instrument 96	Diatech Pharmacogenetics	RT800-96	Instrument recommended for the Real Time PCR assay
EasyPGX ready FL-DNA	Diatech Pharmacogenetics	RT029	Kit required for the Real Time PCR assay
Micropipettes (volumes from 1 to 1.000 µL)			Consumables required for DNA extraction and Real Time PCR
Powder-free disposable gloves			Consumables required for DNA extraction and Real Time PCR
QIAamp Fast DNA Stool	Qiagen	51604	Kit recommended for the DNA extraction and purification from stool
Sterile filter tips DNase-, RNase-free (volumes from 1 to 1.000 µL)			Consumables required for DNA extraction and Real Time PCR
Thermal block e.g. EasyPGX dry block	Diatech Pharmacogenetics	RT801	Instrument required for DNA extraction
Vortex e.g. EasyPGX centrifuge/vortex 1.5 ml	Diatech Pharmacogenetics	RT802	Instrument required for DNA extraction