نموذج في المختبر لدراسة التجميع تاو باستخدام لينتيفيرال-بوساطة الخلايا العصبية البشرية

Summary

هذا البروتوكول تفاصيل الاجراء الذي يتم محول الثقافات العصبية البشرية مع لينتيفيرال ثوابت الترميز لمتحولة تاو الإنسان. الثقافات محوله عرض المجاميع تاو والامراض المرتبطة بها.

Abstract

التراكم الشاذ من البروتين تاو يشارك بشكل مرضي في عدد من الامراض التنكسية ، بما في ذلك مرض الزهايمر (AD). علي الرغم من ان نماذج الفئران من تواعتلال قدمت موردا قيما للتحقيق في أليات العصبية من تاو المجمعة ، فانه أصبح من الواضح علي نحو متزايد انه ، بسبب الاختلافات بين الأنواع في الفيزيولوجيا العصبية ، والدماغ الماوس غير مناسب نمذجة الحالة الانسانيه. التقدم في أساليب ثقافة الخلية جعلت ثقافات الخلايا العصبية البشرية في متناول للاستخدام التجريبي في المختبر وساعدت في تطوير المداواة العصبية. ومع ذلك ، علي الرغم من التكيف مع الثقافات خليه الخلايا العصبية البشرية ، في المختبر نماذج من الاعتلال البشري ليست متاحه علي نطاق واسع حتى الآن. يصف هذا البروتوكول نموذجا خلويا لتجميع تاو الذي يتم فيه توصيل الخلايا العصبية البشرية بالمتجات المشتقة من لينتيفيرال التي تم دمجها بالشفرة المتحولة بشكل باثوجيوكلي مع مراسل البروتين الفلوري الأصفر (YFP). الثقافات المحولة تنتج المجاميع تاو ان وصمه عار إيجابيا لثيوفلافين وعرض علامات السمية العصبية ، مثل انخفاض طول اكسنال وزيادة حجم الليسومال. وقد يكون هذا الاجراء نموذجا مفيدا وفعالا من حيث التكلفة لدراسة الامراض البشرية.

Introduction

التراكم المرضي من البروتين المرتبط بالبولية الصغيرة تاو هو سمه مميزه للعديد من الامراض التنكسية ، بما في ذلك AD ، الخرف الجبهي الامامي (FTD) ، ومرض البيك ، والشلل التقدمي التقدمي (PSP)¹. في حاله غير المريضة ، تاو يربط ويستقر خيوط ميكروتوبولي في محاور الخلايا العصبية². ومع ذلك ، والمرتبطة بالمرض فرط فوسفونات تاو يعزز تجميع تاو ، التفكك من الأنابيب الدقيقة ، وسميه الخلايا العصبية³. الآثار السامة لل تاو المجمعة قد تنطوي علي تفعيل الشاذة من الكوليني⁴ ومستقبلات جلوتاميلجيك⁵ مما ادي إلى خلل في الكالسيوم داخل الخلايا و, في نهاية المطاف, موت الخلية. في النماذج الحيوانية ، والحد من الدماغ تاو يحسن علم الامراض في الفئران AD⁶ وفي نماذج الماوس من المتكررة خفيفه أصابه الدماغ الرضية⁷.

تثبت الادله المتصاعدة ان البنية والصلة الملزمة لل tau المشتقة من الفاره تختلف عن المشتقة البشرية تاو وان الماوس تاو غير مناسب لنمذجة الإنسان⁸. ومع ذلك ، فان نماذج اعتلال الخلايا البشرية ليست متاحه تجاريا علي نطاق واسع. الهدف العام لهذا العمل هو وصف نموذج في المختبر من تجميع تاو فيه الخلايا العصبية البشرية محوله مع ناقلات المشتقة من لينتيفيرال التي تحتوي علي متحولة الإنسان تاو يبني⁹. تاو التجميعية المسببة للينتيفيرال يبني رموز للمجال التكرار تاو إيواء P301L والطفرات الV337Mه تنصهر إلى مراسل YFP (تاو-RDLM-YFP) في حين ان التحكم بإنشاء التعليمات البرمجية للمجال البرية من نوع (Wt) تاو تكرار تنصهر إلى مراسل YFP (تاو-Wt-YFP). الثقافات العصبية محوله باستخدام هذه الطريقة التعبير عن حوالي تسع مرات أكثر تاو من الثقافات غير المحولة. وعلي الرغم من ان مقدار تعبير تاو المعبر عنه يساوي تقريبا بين الخلايا المحولة من تاو-RDLM-YFP-و Tau-Wt-YFP ، فان الخلية العصبية الوحيدة المحولة مع المجاميع العرض تاو-RDLM-YFP. الثقافات محوله مع تاو-rdlm-yfp وصمه عار إيجابيا لثيوفلافين وعرض التخفيضات في طول محواري وكثافة متشابك. ولذلك ، قد يكون هذا النموذج الخلوي أداه مفيده لدراسة تجميع تاو في المختبر.

Protocol

1. اعداد وسائل الاعلام والكواشف

1. الذوبان في الطابق السفلي غشاء مصفوفة طلاء للوحات الثقافة في 4 درجه مئوية (لا تسمح مصفوفة غشاء الطابق السفلي لتسخين أو انها سوف يصلب). جعل 1 مل قسامات وتخزينها في-20 درجه مئوية أو-70 درجه مئوية.
2. أعاده تكوين الخلايا الليفية الاساسيه عامل النمو (bFGF) في معقم الفوسفات-المالحة المخزنة مؤقتا (التلفزيونية الخاصة) في 10 ميكروغرام/مل وجعل 10 μL aliquots. تخزينها في 4 درجه مئوية.
3. إلى زجاجه جديده ، غير مفتوحة ، 500 mL من DMEM/F12 مع الجلوتامين ، أضافه B27 (10 مل) ، N2 (5 مل) ، والبنسلين-ستربتوميسين (5 مل). مكان 50 mL من هذه الخلايا الجذعية العصبية (القومي) وسائل الاعلام في أنبوب مخروطي وأضافه 10 μL من 10 ميكروغرام/μL (2 ميكروغرام/مل النهائي) bFGF. تخزين الاعلام القومي (+) bFGF الوسائط في 4 درجه مئوية.
4. لجعل (-) bFGF وسائل الاعلام ، واستخدام نفس الوصفة كما هو موضح في الخطوة 1.3 ولكن لا تضيف bFGF. وسوف تستخدم هذه الوسائط لتفريق NSCs إلى الخلايا العصبية والحفاظ علي الثقافات العصبية بعد التمايز.

2. لينتيفيرال يبني

ملاحظه: قبل البدء في العمل مع لينتيفيرال ثوابت ، تاكد من ان المختبر قد تمت الموافقة علي استخدام السلامة الاحيائيه مستوي-2 (BSL-2) وكلاء. وعلاوة علي ذلك ، يجب استخدام أغطيه الثقافات من طراز BSL-2 ، ومعدات الوقاية الشخصية ، وأساليب التخلص عند العمل مع ناقلات لينتيفيرال.

1. الحصول علي يبني تاو تعبئتها في لينتيفيروس من مصدر مفضل (انظر ساندرز وآخرون¹⁰ لبناء المعلومات).

3. زراعه الخلايا الجذعية العصبية البشرية

ملاحظه: وعاده ما يتم البذر NSCs في 100000-150000 الخلايا/سم² وتباع معظم nscs المتاحة تجاريا ك 1 × 10⁶ خلايا/قارورة. وقد تم تحسين هذا البروتوكول لاطباق الثقافة خليه 10 سم (علي الرغم من ان الاحجام الأخرى من الاطباق يمكن استخدامها) ؛ ولذلك ، إذا تم استخدام NSCs المتاحة تجاريا ، قد تحتاج إلى توسيع NSCs بالأول يجري مثقف في سته اطباق جيدا من أجل ان يؤدي إلى خلايا كافيه للبذور 10 سم الاطباق. ويمكن بدلا من ذلك تكييف هذا البروتوكول لمجموعه متنوعة من الاحجام طبق ثقافة الخلية (ولكن لا يحتوي علي تعليمات لمرور nscs لان هذه البروتوكولات متوفرة في مكان آخر^11,12).

1. لاعداد لوحات ثقافة الخلية ، وأزاله قسامه واحد من طبقه القبو المجمدة طلاء مصفوفة للوحات ثقافة الخلية والسماح لها لذوبان الجليد في 4 درجه مئوية (يمكن وضع الارصفه في 4 درجه مئوية بين عشيه وضحيها اليوم قبل ان يتم البذر الخلايا). أضافه 385 μL من الطابق السفلي غشاء مصفوفة طلاء إلى 5 مل من DMEM/F12 وسائل الاعلام + البنسلين-ستربتوميسين.
   ملاحظه: 5 مل من الوسائط DMEM/F12 + البنسلين-ستربتوميسين هو ما يكفي لمعطف واحد 10 سم طبق (1 مل من هذا الطابق السفلي غشاء مصفوفة الحل يكفي لمعطف واحد جيدا من سته طبق جيد). بدلا من ذلك ، إذا كانت الخلايا لتكون ثابته ومناعية ، أو ملطخه لثيوفلافين ، والخلايا الثقافية علي الزجاج coverslips في الاطباق الثقافة 24-حسنا.
   1. الحفاظ علي وسائل الاعلام وطلاء المصفوفة الباردة قبل واثناء اضافتها إلى الاطباق الثقافية. أضافه طلاء مصفوفة غشاء الطابق السفلي إلى الاطباق الثقافية ووضع الاطباق في حاضنه (في 37 درجه مئوية) لمده 1 ساعة. لطلاء الأمثل ، لا احتضان مصفوفة غشاء الطابق السفلي لأكثر من أو اقل من 1 ساعة. بعد 1 ساعة ، يستنشق الطبقة السفلية غشاء طلاء المصفوفة من الثقافات الخلية الاطباق. تاكد من ان هذا يتزامن مع NSCs كونها جاهزه لتكون مطليه.
      ملاحظه: إذا لم يتم أذابه الخلايا من المخزونات المجمدة ، تخطي الخطوة 3.2 ومتابعه الخطوة 3.3.
2. إذا تم أذابه الخلايا من مخزونات الإنقاذ القومي المجمدة ، خذ قنينة من الخلايا المجمدة وسخنها في حمام مائي يسخن إلى 37 درجه مئوية عن طريق تحريك القارورة ذهابا وإيابا في الماء. مره واحده أذابه ، رش القارورة مع 70 ٪ الايثانول ووضعها في غطاء للثقافة الخلية. نقل الخلايا إلى ~ 10 مل من DMEM/F12 + البنسلين-ستربتوميسين وسائل الاعلام والطرد المركزي أنبوب في درجه حرارة الغرفة في 1,000 x g ل 5 دقيقه. يستنشق وسائل الاعلام وأعاده تعليق الخلايا في وسائل الاعلام القومية.
3. تمييع الخلايا في وسائل الاعلام القومية للحصول علي كثافة البذر المناسبة للسفينة ثقافة الخلية التي يتم استخدامها.
   ملاحظه: علي سبيل المثال ، إذا كانت NSCs مطليه علي لوحه من سته ابار-واحده جيدا علي طبق ثقافة سته جيدا لديها مساحة السطح من 9 سم²-900,000 إلى 1,350,000 خلايا مطلوبه للبذور. لذلك ، يمكن أعاده تعليق قارورة واحده تحتوي علي خلايا 1,000,000 في 2 مل من وسائل الاعلام ، وأضاف إلى بئر واحد من سته طبق جيدا.
4. أضافه ما يكفي من الخلايا المعلقة في وسائل الاعلام التابعة لل القومية للبذور الطابق السفلي غشاء مصفوفة المغلفة اطباق الثقافة (100,000 خلايا/سم²) وتغيير وسائل الاعلام كل يوم (إذا كان استخدام الأسهم المجمدة ، وتغيير وسائل الاعلام في اليوم بعد الطلاء وكل يوم بعد ذلك). تنمو الخلايا حتى انها 75 ٪-80 ٪ متموج.
   ملاحظه: ومن المرجح ان تصل الخلايا إلى 75 ٪-80 ٪ التقاء بعد الطلاء بوقت قصير ، ولكن هذا قد يستغرق وقتا أطول إذا تم استخدام المخزونات المجمدة.
5. مره واحده NSCs هي 75 ٪-80 ٪ متموج ، تبدا التمايز العصبية عن طريق أزاله الوسائط الاعلاميه bFGF (+) واستبدالها مع الإنقاذ القومي (-) bFGF وسائل الاعلام. ثقافة الخلايا في هذه الوسائط (استبدال وسائل الاعلام كل يوم) لمده 4 أسابيع علي الأقل.
   ملاحظه: وسوف تستمر الخلايا في الانقسام لبضعة أيام بعد انسحاب bFGF; لذلك ، قد تصل الخلايا إلى 90-100% التقاء. بعد الخياطة لمده 4 أسابيع ، ستكون الخلايا قد حققت مصير المخ وسوف تكون جاهزه لعلاج لينتيفيروس.

4. التوصيل والصيانة للثقافات العصبية

1. إلى transduce الخلايا العصبية مع لينتيفيروس ، واستخدام عدد عيار من 3.4 x 10⁵ وحدات محوله/خليه (100 ٪ متموج 10 سم طبق سوف تحتوي علي ~ 10,000,000 الخلايا العصبية). تمييع الوحدات محوله إلى التركيز اللازم في الخلية ثقافة الاعلام وأضافها إلى الخلايا (استخدام الحجم العادي للوسائط لطبق ثقافة الخلية). بعد يومين من أضافه لينتيفيروس ، وغسل الخلايا 1x مع الطازجة (-) وسائل الاعلام bFGF (بدون لينتيفيروس) ومواصله الخياطة في (-) وسائل الاعلام bFGF كالمعتاد.
2. لعلاج ما بعد اللينتيفيرال, تغذيه الخلايا العصبية محوله عن طريق تغيير وسائل الاعلام الخلية الثقافة ([-] وسائل الاعلام bFGF) كل يومين. الحفاظ علي الخلايا ل ~ 8 أسابيع بعد المحول. تصور الخلايا تحت المجهر الضوئي بشكل روتيني لضمان الاستمرارية.
   ملاحظه: العصافير أو الكسور الجذعية هي علامات علي ان الخلايا لم تعد قابله للحياة.

5. تصوير الخلايا

1. تصوير الخلايا الحية
   1. بعد التوصيل (بعد 4 أيام من أضافه لينتيفيروس) ، راقب إشارات YFP تحت مجهر فلوري قادر علي تصوير الخلايا الحية. تاخذ الاطباق ثقافة الخلية من الحاضنة والتاكد من ان الآبار الثقافة لا تزال عقيمه من خلال الحفاظ علي غطاء علي راس الاطباق الثقافية. تصور الخلايا باستخدام هدف 10x مع الطول الموجي الاثاره من ~ 514 nm وفلتر الانبعاثات من ~ 527 nm.
      ملاحظه: المجاميع هي عاده مرئية في الثقافات خليه محوله 6-8 أيام بعد تطبيق لينتيفيروس.
2. الخلايا الثابتة تلطيخ (β-الأنابيب الثالث وسم وتلطيخ ثيوفلافين)
   1. لإصلاح الخلايا في بارافورمالدهيد (PFA) ، وأزاله وسائل الاعلام الثقافة من الخلايا العصبية المحولة التي تزرع علي الشفتين الزجاج. غسل الخلايا 1x مع تلفزيوني ، وأزاله الغسيل ، وأضافه 300-500 μL (إذا باستخدام لوحات 24 جيدا) من 4 ٪ PFA (المخفف في الخدمات التلفزيونية العامة) إلى coverslips لمده 20 دقيقه في درجه حرارة الغرفة. أزاله PFA وغسل الشفتين 2x مع تلفزيوني.
   2. اعداد حل حظر يتالف من تلفزيوني ، 3 ٪ الزلال المصل البقري (جيش الصرب البوسني) ، و 0.3 ٪ تريتون X-100. أضافه 300-500 μL من الحل إلى الآبار واحتضان الشفتين لمده 2 ح في 4 درجه مئوية. بعد 2 ح ، تمييع الأجسام المضادة الاوليه (في تركيز الأجسام المضادة من 1:500) في منع الحل وأضافه 300-500 μL من حل الأجسام المضادة الاساسيه لكل بئر. وضع لوحه علي منصة هزاز أو الدورية (بسرعة منخفضه) بين عشيه وضحيها في 4 درجه مئوية.
   3. في اليوم التالي ، وأزاله الحل المضادات الاساسيه وغسل الشفتين 3x لمده 5 دقائق لكل منها مع تلفزيوني. تمييع الأجسام المضادة الثانوية في حل العازلة الحاجز (بتركيز 1:1000) وأضافه حل الأجسام المضادة الثانوية لكل بئر. حدد الأجسام المضادة الثانوية المناسبة باستخدام علامة الفلورسنت التي لا تتداخل مع اشاره YFP (CY-3 ، علي سبيل المثال). احتضان الخلايا في درجه حرارة الغرفة لمده 2 ساعة علي منصة هزاز أو الدورية. بعد 2 ح ، وأزاله حل الأجسام المضادة الثانوية وغسل الشفتين 3x لمده 10 دقيقه لكل منهما مع تلفزيوني.
   4. غسل الشفتين في المياه المزدوجة منزوعة الأيونات (DDW) لمده 10 دقيقه. أزاله DDW وأضافه 300 μL/well من 0.015 ٪ ثيوفلافين المخفف في الايثانول 50 ٪ لمده 10 دقيقه. أزاله الحل ثيوفلافين وغسل الشفتين 2x لمده 4 دقائق لكل منهما مع 50 ٪ الايثانول ، تليها واحد 4 دقيقه يغسل مع الايثانول 30 ٪ واثنين يغسل لمده 5 دقائق لكل منها مع الايثانول 30 ٪. غسل الشفتين 1x مع DDW قبل التركيب.
      ملاحظه: تلطيخ ثيوفلافين الموصوفة في الخطوة 5.2.4 اختياريه.
   5. لتركيب الشفتين علي الشرائح الزجاجية ، ضع قطره واحده من الوسائط المتصاعدة علي الجانب "+" من الشريحة الزجاجية. أزاله كل السائل من البئر التي تحتوي علي الزجاج كوفيرسليب ، وذلك باستخدام ملقط غرامه ، وأزاله بعناية الزجاج كوفيرسليب ، والحفاظ علي المسار الذي الجانب لديه خلايا مثقف.
   6. اضغط برفق علي حافه الشفة المختلطة ضد Kimwipe لأزاله اي رطوبة زائده. لا تزال تجتاح كوفيرسليب مع ملقط غرامه ، وتلمس الحافة (مع الجانب الخلية التي تواجه نحو قطره من وسائل الاعلام المتصاعدة) من كوفيرسليب إلى وسائل الاعلام المتصاعدة ، ومن ثم ، وضع بلطف في كوفيرسليب علي وسائل الاعلام المتصاعدة (وضع الخلايا المستزرعة في تصاعد وسائل الاعلام ويقحمها بين المشبك والشريحة الزجاجية). السماح للوسائط المتصاعدة لتتصلب لمده 30 دقيقه قبل التصوير. يمكن تخزين الشرائح في-20 درجه مئوية للاستخدام في المستقبل.
   7. صوره الخلايا باستخدام المجهر الفلورسنت والمناسبة الاثاره/الانبعاثات الأطياف (YFP = ~ 514/527 نانومتر ، CY-3 = ~ 555/568 nm ، و ثيوفلافين S = ~ 390/426 nm).

6. الطرق الاختيارية

1. كل يومين ، وجمع وسائل الاعلام المكيفة من الثقافات وتخزينها في-20 درجه مئوية للتحليلات في المستقبل من الأنواع تاو التي أطلقتها الثقافات.

النتائج

تم المفتاحية تاو-RDLM-YFP-محول الخلايا العصبية فلوريسسينتلي مع YFP ، والثقافات RDLM-محول عرض المجاميع بعد المحولة. هذه الشوائب الملونة الايجابيه لثيوفلافين (الشكل 1). كما يوضح الشكل 1 ، ينتج هذا البروتوكول ثقافات الخلايا العصبية التي تعرض مجاميع tau الموجبة لثيوفلا?...

Discussion

يصف هذا البروتوكول توليد نموذج في المختبر لاعتلال الأمعاء البشرية الذي يسلك المجاميع الايجابيه للبقع الفضية والتشابك العصبي الليفي ثيوفلافين الإيجابي (NFTs). وعلاوة علي ذلك ، تعرض الخلايا المحولة الامراض التي يسببها تاو مثل العيوب المورفولوجية ، وانخفاض synaptogenesis ، وزيادة حجم الليسومال. وا?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cm culture dishes	Thermofisher	12556002
15 mL tubes	Biopioneer	CNT-15
16% paraformaldehyde	Thermofisher	50-980-487
24 well culture plates	Thermofisher	930186
50 mL tubes	Biopioneer	CNT-50
70% ethanol in spray bottle	Various sources	NA
B27 supplement	Thermofisher	17504044
Basement membrane matrix (Matrigel)	Corning	356231
Basic FGF	Biopioneer	HRP-0011
Bovine serum albumin	Sigma	A7906
Cell culture incubator	Various sources	NA
Centrifuge	Various sources	NA
DMEM-F12 culture media with glutamine	Thermofisher	10565042
Ethanol (50% concentration or higher)	Various sources	NA
Flourescently labeled secondary antibodies	Various Sources, experiment dependent	NA
Fluorescent microscope	Various sources	NA
Glass coverslips	Thermofisher	1254581
Glass slides	Thermofisher	12-550-15
Human neural stem cells	Various sources	NA
Lentiviral vectors	Various sources	custom order
Mounting media	Thermofisher	P36934
N2 supplement	Thermofisher	17502048
Penicillin-Streptomycin	Thermofisher	15140122
Phosphate buffered saline	Thermofisher	14190250
Primary antibodies	Various Sources, experiment dependent	NA
Rocking or rotating platform	Various sources	NA
Sterile cell culture hood	Various sources	NA
Thioflavin S	Sigma	T1892-25G
Triton X-100	Thermofisher	BP151-100
Water bath	Various sources	NA