الجيل السريع من الخلايا الصباغية الأولية Murine والثقافات الليفية

Summary

يحدد هذا البروتوكول طريقة سريعة لتوليد الثقافات الخلايا الصباغية والليفية في وقت واحد من جلد الفئران القديمة 0-4 أيام. يمكن الحفاظ على هذه الثقافات الأولية والتلاعب بها في المختبر لدراسة مجموعة متنوعة من العمليات ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية، بما في ذلك بيولوجيا خلايا الجلد، والتصبغ، والتئام الجروح والورم الميلانيني.

Abstract

ترتبط العيوب في وظيفة الخلايا الليفية أو الصباغية مع الأمراض الجلدية، بما في ذلك ضعف وظيفة الحاجز، والتئام الجروح المعيبة، وعيوب التصبغ والسرطان. ومن الأمور الحيوية لفهم هذه الأمراض وتحسينها التجارب في الثقافات الليفية الأولية والخلايا الصباغية. ومع ذلك، تتطلب البروتوكولات الحالية لعزل الخلايا الصباغية أن الطبقات الجلدية والجلدية من الجلد يتم علاجها وفصلها يدويا. وتستغرق هذه العملية وقتا طويلا، وتنطوي على تحديات تقنية، وتسهم في عدم اتساق الغلة. وعلاوة على ذلك، فإن أساليب توليد الثقافات الليفية النقية في وقت واحد من نفس عينة الأنسجة ليست متاحة بسهولة. هنا، ونحن نصف بروتوكول محسنة لعزل الخلايا الصباغية والخلايا الليفية من جلد الفئران في أيام ما بعد الولادة 0-4. في هذا البروتوكول، يتم تجانس الجلد كله ميكانيكيا باستخدام المروحية الأنسجة ومن ثم هضمها لفترة وجيزة مع الكولاجين والتربسين. ثم يتم عزل مجموعات الخلايا من خلال الطلاء الانتقائي متبوعاً بمعاملة G418. ينتج عن هذا الإجراء غلة الخلايا الصباغية والليفية المتسقة من فأر واحد في أقل من 90 دقيقة. هذا البروتوكول هو أيضا قابلة للتحجيم بسهولة، مما يسمح للباحثين لمعالجة مجموعات كبيرة من الحيوانات دون زيادة كبيرة في التدريب العملي على الوقت. نبين من خلال تقييمات قياس التدفق أن الثقافات التي أنشئت باستخدام هذا البروتوكول غنية بدرجة عالية للخلايا الصباغية أو الخلايا الليفية.

Introduction

جلد الثدييات هو جهاز متعدد الطبقات يحمي الجسم من مسببات الأمراض الأجنبية والتشعيع فوق البنفسجي (UVR). الجلد يلعب أيضا دورا حاسما في العمليات المثلية مثل التئامالجروح، وتنظيم درجة الحرارة وإنتاج فيتامين (د) 1،^2،3. يتكون جلد الثدييات من ثلاثة أنواع رئيسية من الخلايا: الخلايا الصباغية، الخلايا الليفية والكيراتينية. هذه الأنواع من الخلايا ملء طبقات مختلفة من الجلد، مع الخلايا الكيراتينية التي تشكل البشرة، الخلايا الليفية المقيمة في الأدمةوالخلايا الصباغية توطين إلى تقاطع البشرة الجلدية وبصيلات الشعر 4. هنا، نقوم بتفصيل إجراء بسيط يمكّن الجيل المتزامن من الخلايا الصباغية الأولية والثقافات الليفية من جلد المورين.

الخلايا الصباغية هي الخلايا المنتجة للأصباغ الموجودة في العديد من المواقع في جميع أنحاء جسم الإنسان، بمافي ذلك البشرة القاعدية، القزحية، القوقعة، الدماغ وبصيلا الشعر 5. الوظيفة الأساسية للخلايا الصباغية هي توليد وتفرز الحويصلات التي تحتوي على الميلانين تسمى melanosomes^5،6. الميلانين تحتوي على فئتين رئيسيتين من الميلانين: البني / الأسود eumelanin والأصفر / الأحمر فيوميلانين^6،7. العمليات البيوكيميائية داخل الخلايا الصباغية تنظيم الوفرة النسبية لكل نوع من أنواع الميلانين وتساعد على تحديد الشعر والجلد ولون العين^8،9. الميلانين يعمل أيضا على امتصاص UVR وحماية الأنسجة المعرضة للشمس من الطفرات^10.

يمكن أن يسبب خلل الخلايا الصباغية عيوبًا صباغية ويزيد من قابلية الإصابة بسرطان الجلد. على سبيل المثال، بقع الجلد فرط التصبغ مميزة من الكلف هي نتيجة للإفراط في إنتاج الميلانين البؤري، في حين أن الطفرات الوراثية الجرثومية التي تضر الجينات المشاركة في تخليق الميلانين تؤدي إلى المهق^11،12 . مطلوب معرفة حميمة من بيولوجيا الخلايا الصباغية لوضع استراتيجيات من شأنها تصحيح هذه العيوب الصباغية وتحسين في نهاية المطاف الرفاه النفسي والاجتماعي للأفراد المصابين بهذه الأمراض. ويرتبط العجز في إنتاج الميلانين و / أو التوليف التفضيلي للفيوميلانين أيضا مع زيادة خطر سرطان الجلد¹⁰. ويعتقد أن هذا الخطر ينتج عنانخفاض حماية UVR 6،¹³. وهكذا, طرق لتعزيز أو استعادة إنتاج eumelanin في الخلايا الصباغية قد يقلل من حدوث سرطان الجلد في هذه التجمعات السكانية.

الخلايا الليفية mesenchymal إنشاء النسيج الضام والدعم الهيكلي لجميع أجهزة الجسم، بما في ذلك طبقة الجلد من الجلد^14. إفراز البروتينات مثل الكولاجين والإيلاستين واللامينين والفيبرونكتين تمكن الخلايا الليفية لتشكيل المصفوفة خارج الخلية (ECM) التي هي ضرورية لسلامة الأنسجة^1،14. كما تلعب الخلايا الليفية أدوارًا أساسية في عمليات مثل التئام الجروح، والالتهاب، وتكوين الأوعية الدموية، وتكوين/تقدم السرطان^1،15،16.

على غرار الخلايا الصباغية، يمكن أن تعزز العيوب في تنشيط الخلايا الليفية والوظيفة الأورام والمرض. على سبيل المثال، تنشيط الأورام الليفية غير المناسبة يؤدي عادة إلى تشكيل التليف، الناجمة عن الترسيب المعزز لمكونات ECM الزائدة في الأنسجة المحيطة بها. كما تحافظ الخلايا الليفية على الكثير من السلامة الهيكلية للجسم، والتليف يعزز الأمراض التي تؤثر على العديد من الأنسجة والأعضاء، بما في ذلك التليف الرئوي مجهول السبب، والتصلب الجهازي، وتليف الكبد والتليف القلبي¹⁵. الأورام الليفية تلعب أيضا دورا حاسما في السرطان¹⁶. الخلايا الليفية المرتبطة بالسرطان (CAFs) هي الخلايا غير الخبيثة الأكثر وفرة في البيئة الدقيقة للعديد من الأورام. وقد ثبت CAFs لتعزيز انتشار الورم، والتقدم والمقاومة العلاجية عن طريق تحوير تصلب الأنسجة، وإنتاج السيتوكين المحلية ووظيفة المناعة¹⁶.

توفر ثقافات الخلايا الأولية للباحثين نماذج قابلة للزراعة وراثياً لتحديد والتخفيف من عيوب الخلايا الصباغية والأورام الليفية التي تؤدي إلى المرض. ومع ذلك، فإن الأساليب الحالية لإنشاء الثقافات الخلايا الصباغية تستغرق وقتا طويلا وصعبة من الناحية الفنية. الحاجة إلى التجريب والفصل الدقيق بين البشرة والأدمة يساهم في تقلب في الغلة التجريبية ويجعل من الصعب إجراء تجارب واسعة النطاق. وعلاوة على ذلك، تفتقر حاليا في هذا المجال بروتوكولات لعزل الخلايا الصباغية والخلايا الليفية في وقت واحد من الجلد كله.

لقد قمنا بتطوير طريقة للحد من خطوات المعالجة والتباين والوقت اللازم لإنشاء الثقافات الميلانية والليفية من نفس عينة الجلد بأكملها. باستخدام طريقة التجانس الميكانيكية تليها الهضم وجيزة، استراتيجيتنا يقلل بشكل كبير من كمية الوقت العملي اللازم لعزل الخلايا الصباغية الأولية مع تمكين العزلة الليفية المتزامنة. زيادة سرعة وكفاءة واتساق هذا البروتوكول، جنبا إلى جنب مع القدرة على عزل الخلايا الصباغية من الفئران القديمة 0-4 أيام، ويوفر للباحثين المرونة لإجراء مجموعة أوسع من التجارب مما كان ممكنا في السابق.

Protocol

الحصول على موافقة لجنة أخلاقيات الحيوان المؤسسية الخاصة بك قبل البدء في هذه الدراسة أو أي دراسة أخرى تشمل الحيوانات. تمت الموافقة على التجارب التي أجريت في هذا البروتوكول من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها في جامعة ولاية أوهايو (IACUC، البروتوكول #2012A00000134).

1- إعداد البروتوكول

ملاحظة: تعليمات إعداد الكاشف التالية مناسبة لتوليد 9 سم² الثقافات الخلايا الصباغية والليفية من فأر واحد. راجع دليل إعداد الكاشف في الجدول 1 للحصول على عزلات نطاق أكبر.

1. إعداد 1.5 مل من محلول الكولاجين الذي يحتوي على 50 ميكروغرام / مل الكولاجين في 0.1 M حمض الخليك الجليدي.
2. في خزانة تدفق اللامينار، قم بتغليف بئر واحد من طبق ثقافة الخلايا 6-well مع 8 ميكروغرام/سم² (1.44 مل) محلول الكولاجين. تأكد من أن البئر مغطى بالكامل من قبل محلول الكولاجين. تحضن الطبق عند 37 درجة مئوية لمدة 3 ساعات أو عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها. قبل الاستخدام، اغسل الكولاجين المغلفة جيدا مرتين مع 1.35 مل من الفوسفات المعقمة المخزنة المالحة (PBS) (150 درجة مئوية من PBS لكل 1 سم^2).
3. تجميع المروحية الأنسجة في مجلس الوزراء تدفق laminar عن طريق وضع بعناية قرص تقطيع على منصة المروحية الأنسجة وتأمين شفرة معقمة إلى الذراع المنقولة.
4. إعداد 3 مل من 1X المضادات الحيوية / مضاد للحشرات الحل عن طريق تخفيف 100X المضادات الحيوية / مضاد للميتوتيك حل الأسهم في PBS المعقمة.
5. إعداد 3 مل من الطازجة الجلد الهضم العازلة التي تحتوي على 10٪ مصل البقر الجنيني، 1٪ البنسلين / العقديات حل، 1٪ L-الجلوتامين، 10 ملغ / مل كولاجيناز نوع الأول، 0.25٪ التربسين porcine و 0.02 ملغ / مل ديوكسيريبونوكليس أنا في RPMI 1640.
6. إعداد 6 مل من وسائل الإعلام الميلانيتة الطازجة التي تحتوي على 10٪ مصل البقر الجنيني، 7٪ مصل الحصان، 1٪ البنسلين / العقديات حل، 1٪ L-الجلوتامين، 0.5 مليون متر دي بوتيريل دوري AMP (dbcAMP)، 20 nM tetradecanoylphorbol 13 خلات (TPA) و 200 سم الكوليرا PM (CT) في المغذيات مزيج F-12 هام وسائل الإعلام.
   ملاحظة: يمكن إجراء حلول الأوراق المالية المركزة dbcAMP وTPA وCT، وتسعيرها وتخزينها لمدة أكثر من 1 سنة عند -80 درجة مئوية. يمكن تخزين الوسائط الأساسية التي تفتقر إلى هذه المكونات لمدة تصل إلى شهر واحد عند درجة حرارة 4 درجة مئوية.
7. إعداد 4 مل من وسائل الإعلام الليفية التي تحتوي على 10٪ مصل البقر الجنيني، 1٪ البنسلين / العقديات و 1٪ L-الجلوتامين في دولبيكو تعديل النسر المتوسط. يمكن تخزين هذه الوسائط عند درجة حرارة 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد.
8. إعداد 40 مل من 4٪ بارافورمالدهايد الحل عن طريق تخفيف 16٪ بارافورمالدهايد في PBS. تخزين أي فائض في 4 درجة مئوية لمدة شهر واحد أو -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 1 سنة.
9. إعداد محلول مخزون الصابونين 1٪ عن طريق خلط 0.5 غرام من الصابونين في 50 مل من PBS في 37 درجة مئوية حتى السابونين قد حل تماما. تعقيم الحل للتخزين على المدى الطويل باستخدام حقنة 50 مل مزودة بفلتر PES 0.2 ميكرومتر. يمكن الاحتفاظ بمحلول مخزون الصابونين الناتج عند درجة حرارة 4 درجة مئوية لمدة شهر واحد.
10. إعداد 200 درجة مئوية من 0.1٪ سابونين الحل لكل ماوس عن طريق تخفيف 1٪ محلول الأوراق المالية الصابونين في PBS تحتوي على 3٪ الزلال المصل البقري (BSA).
11. إعداد 1 مل من محلول الصلاحية عن طريق تخفيف 1 ميكرولتر من صبغة صلاحية قابلة للإصلاح في 1 مل من PBS.

2. عزل الخلايا الصباغية والليفية

1. قتل 0 إلى 4 يوم من العمر الذكور و / أو الإناث C57Bl/6J الجرو عن طريق قطع الرأس وإزالة الأطراف من الفئران القتل الرحيم باستخدام مقص الجراحية.
2. في مجلس الوزراء تدفق laminar، لفة لفترة وجيزة الجذع من كل فأر في طبق بيتري معقمة تحتوي على 70٪ الإيثانول. إزالة الجذع من الإيثانول ووضعها في فارغة، طبق بيتري معقمة.
3. باستخدام مقص الجراحية، تعقيمها في الإيثانول 70٪، وجعل شق في الجلد على الجانب البطني من الجذع بدءا من الرقبة إلى الذيل. قشر الجلد من جذع الماوس باستخدام ملقط معقمة.
4. ضع جانب الأدمة الجلدية في طبق من 6 آبار يحتوي على 3 مل من محلول مضاد حيوي/مضاد للحرارة واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 2-3 دقائق.
5. تشغيل المروحية الأنسجة مع الإعدادات التالية في مكان: سمك شريحة: 1 درجة مئوية; شفرة القوة: ~ 60٪ من الحد الأقصى؛ السرعة: ~ 50٪ من الحد الأقصى.
6. نقل الجلد، الجانب الأدمة إلى أسفل، إلى قرص المروحية الأنسجة المعقمة وتمرير الجلد تماما من خلال المروحية الأنسجة المنشطة 3 مرات.
7. نقل الجلد المتجانس إلى أنبوب مخروطي معقم، 15 مل يحتوي على 3 مل من الجلد الهضم العازلة. امزج التعليق الناتج عن ذلك عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا 10-15 مرة مع ميكرومازيت P1000.
8. قم بغطاء الأنبوب المخروطي واحتضن العينة في حمام مائي بزاوية 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة، مما يعكس الأنبوب كل 3-5 دقائق.
9. بيليه الخلايا في الجلد التجانس عن طريق الطرد المركزي أنبوب مخروطي في الدوار دلو يتأرجح في 750 × ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
10. باستخدام P1000 micropipette، ببطء وتماما إزالة العازلة هضم الجلد الحرص على عدم إزعاج بيليه.
    ملاحظة: يمكن حفظ جزء من الجلد كله في هذه المرحلة واستخدامها كعنصر تحكم للخطوة 3: تأكيد نقاء الخلوية. قم بإجهاد هذه الخلايا من خلال مصفاة خلايا بـ 70 درجة مئوية ثم تبدأ في الخطوة 3.5 لمزيد من المعالجة.
11. تماما إعادة تعليق بيليه الخلية في 1 مل من وسائل الإعلام Melanocyte عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا 15-20 مرات مع P1000 micropipette. إضافة حل الخلية الناتجة قطرة إلى بئر غير المصقول من طبق 6 جيدا تحتوي على 1 مل من وسائل الإعلام Melanocyte.
12. ضع تجانس الجلد المطلي في حاضنة زراعة الأنسجة التي تم تعيينها عند درجة حرارة 37 درجة مئوية و5% من ثاني أكسيد الكربون. السماح للثقافات لاحتضان لمدة 40 دقيقة.
    ملاحظة: خلال هذا الوقت ، فإن بعض الخلايا الليفية في تجانس الجلد تلتزم الطبق غير المصقول في حين أن الخلايا الصباغية والكيراتينية لا تزال في التعليق.
13. نقل الثقافة supernatant من الطبق غير المصقول إلى بئر واحد من قبل غسلها، الكولاجين المغلفة 6-جيدا طبق. إضافة G418 إلى وسائل الإعلام بحيث التركيز النهائي هو 100 نانوغرام/مل.
14. إضافة 2 مل من وسائل الإعلام الليفية إلى بئر واحد من الطبق غير المصقول، التي تحتوي الآن على الخلايا الليفية الملتصقة.
15. حضانة كلا الثقافتين بين عشية وضحاها في حاضنة زراعةالأنسجة تعيين في 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
16. يستنشق بشكل منفصل وسائل الإعلام وأي حطام من كل ثقافة، 16-24 ساعة بعد الطلاء. غسل كل طبق مرتين مع 1 مل من PBS معقمة، ومن ثم إضافة 2 مل من وسائل الإعلام الميلانيتة الطازجة بالإضافة إلى 100 نانوغرام / مل G418 إلى ثقافة الخلايا الصباغية و 2 مل من وسائل الإعلام الليفية الطازجة إلى ثقافة الخلايا الليفية.
17. بعد أن تم علاج الثقافات الخلايا الصباغية مع G418 لمدة 48 ساعة، وغسل الخلايا مرتين مع 1 مل من PBS المعقمة وإضافة 2 مل من وسائل الإعلام الخلايا الصباغية الطازجة دون G418 إلى الثقافة.
    ملاحظة: كما الخلايا الليفية في ثقافة الخلايا الصباغية لا تزال تموت قبالة العلاج بعد G418، وغسل الطبق مع PBS معقمة لإزالة الخلايا الميتة وإضافة وسائل الإعلام الخلايا الصباغية الطازجة. يجب أن يتم تمرير الخلايا الصباغية والثقافات الليفية عندما تصل إلى 70-80٪ من الملاءمة.

3. تأكيد نقاء الخلوية

1. قم بإستنسخ وسائل الإعلام من كل ثقافة واغسل كل طبق بعناية مع 1 مل من PBS المعقمة.
2. إضافة 0.7 مل من 0.25٪ تريبسين إلى كل ثقافة واحتضان الثقافات في التربسين في 37 درجة مئوية و 5٪ CO₂ لمدة 1 دقيقة.
3. إزالة الخلايا عن طريق الأنابيب التربسين ضد الجزء السفلي من الطبق باستخدام P1000 micropipette.
4. إضافة 0.7 مل من وسائل الإعلام المناسبة إلى كل ثقافة trypsinized ونقل حل الخلية في أنبوب الطرد المركزي الدقيقة 1.5 مل.
5. بيليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي في 750 × ز لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. قم بإزالة الـ supernatant بعناية والتخلص منها باستخدام P1000 micropipette.
   ملاحظة: يمكن استخدام الخطوات 3.1-3.5 لتمرير الثقافات الصباغية والليفية. يجب إعادة تعليق بيليه الناتجة في وسائل الإعلام المناسبة ووضعها في طبق جديد غير مطلي (الخلايا الليفية) أو غسلها مسبقا، الكولاجين المغلفة (الخلايا الصباغية).
6. إعادة تعليق بيليه الخلية في 0.5 مل من الجليد الباردة PBS.
7. تعداد ونقل 0.5 مليون خلية إلى أنبوب الطرد المركزي الصغير 1.5 مل المبردة مسبقا.
8. كرر الخطوة 3.5 ثم قم بإعادة تعليق الخلايا في 100 μL من حل الصلاحية. احتضان تعليق الخلية لمدة 30 دقيقة في 4 درجة مئوية في الظلام.
9. كرر الخطوات 3.5 إلى 3.6 مرتين.
10. كرر الخطوة 3.5، ثم إصلاح الخلايا عن طريق إعادة تعليق بيليه في 100 درجة مئوية من الجليد البارد ة 4٪ بارافورمالدهايد الحل. احتضان التعليق لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
11. كرر الخطوة 3.5 مرتين، في كل مرة إعادة تعليق بيليه في 0.5 مل من BSA 3٪ في 1X PBS.
12. كرر الخطوة 3.5، ثم إعادة تعليق بيليه الخلية في 100 درجة مئوية من 0.1٪ محلول الصابونين. احتضان التعليق لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
13. كرر الخطوة 3.5، ثم إعادة تعليق بيليه الخلية في 100 ميكرولتر من 0.1٪ محلول الصابونين يحتوي على 0.5 ميكروغرام من الأجسام المضادة للأرنب gp100، 0.5 ميكروغرام من الأرنب المضادة للفيبلاف البروتين الخاص 1 (FSP1) الأجسام المضادة و 0.025 ميكروغرام من الماوس المضادة للسيتوكيراتين 14 (K14) الأجسام المضادة. احتضان التعليق لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
    ملاحظة: في حين تم شراء الأجسام المضادة K14 مترافقة مسبقا إلى اليكسا فلور 647، تم الجمع بين الأجسام المضادة gp100 و FSP1 إلى CF 555 و CF 488، على التوالي. وينبغي أيضا أن يبدأ تلطيخ السكان الخاضعين للسيطرة في هذه الخطوة. وينبغي عزل مجموعات خلايا التحكم عن الثقافة ومعالجتها على النحو المبين في الخطوات 3-5 إلى 3-12.
14. كرر الخطوة 3.11 مرتين لإزالة أي جسم مضاد غير منضم.
15. كرر الخطوة 3.5، ثم إعادة تعليق بيليه الخلية في 200-400 درجة مئوية من BSA 3٪ في 1X PBS.
16. تمرير حل الخلية من خلال مصفاة خلية 40 ميكرومتر في أنبوب البوليستيرين 5 مل جولة القاع وتحليل الخلايا المتوترة عن طريق قياس التدفق الخلوي.

النتائج

تم قتل فئران C57Bl/6J من الذكور والإناث في أيام ما بعد الولادة 0-4 وتعرض الجلد الترونكال للإنفصال الميكانيكي كما هو موضح أعلاه. بعد التقطيع، شكلت الجلد الطين لزجة تفتقر إلى أي علامة على الأنسجة الهيكلية. الطرد المركزي من هذا الطين أدى إلى تشكيل بيليه خلية كبيرة في الجزء السفلي من أنبوب مخروطي و?...

Discussion

وقد أدت الثقافة في المختبر من الخلايا الصباغية الأولية والخلايا الليفية إلى تقدم كبير في فهمنا لبيولوجيا الجلد والمرض. هذا البروتوكول يحسن على طرق عزل الخلايا الصباغية السابقة عن طريق الحد من الوقت والدهاء التقنية اللازمة لتوليد الثقافات الخلايا الصباغية متسقة مع السماح لعزل في وقت واح?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 µm PES sterile syringe filter	VWR	28145-501
10 cm cell culture dish	Corning	430167
40 µm cell strainer	Fisher Scientific	22363547
5 mL polystyrene round-bottom tubes	Fisher Scientific	352008
6-well cell culture dish	Sigma-Aldrich	SIAL0516
70 µm cell strainer	Fisher Scientific	22363548
Antibiotic Antimycotic Solution (100x)	Sigma-Aldrich	A5955
Bovine Serum Albumin	Fisher Scientific	BP9706-100
CF 488A Mix-n-Stain Antibody Labeling Kit	Biotium	92273
CF 555 Mix-n-Stain Antibody Labeling Kit	Biotium	92274
Cholera Toxin	Sigma-Aldrich	C8052
Collagen from rat tail	Sigma-Aldrich	C7661
Collagenase Type I	Worthington Biochemicals	LS004156
Corning Penicillin/Streptomycin Solution	Fisher Scientific	30-002-CL
Cytokeratin 14 Antibody Alexa Fluor 647	Novus Biologicals	NBP2-34403AF647
Deoxyribonuclease I	Worthington Biochemicals	LS002058
Di-butyryl cyclic AMP	Sigma-Aldrich	D0627
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Gibco	12800-082
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Sigma-Aldrich	D8537
eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780	Thermo Fisher	65-0865-14
Ethanol, 200 proof	Fisher Scientific	22032601
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	12306C
FSP1/S100A4 antibody	Millipore Sigma	07-2274
G418 Disulfide	P212121	LGB-418-1
Glacial Acetic Acid	VWR	VWRV0714
Horse Serum	Fisher Scientific	26050088
HyClone L-Glutamine	Fisher Scientific	SH3003402
McIlwain Tissue Chopper	Ted Pella	10180
Melanoma gp100 antibody	Abcam	ab137078
Nutrient Mix F-12 Ham's Media	Sigma-Aldrich	N6760
Phorbol 12-Myristate 13-acetate	Sigma-Aldrich	P8139
Pierce 16% Formaldehyde	Thermo Fisher	28908
Porcine Trypsin	Sigma-Aldrich	85450C
RPMI 1640 media	Sigma-Aldrich	R8758
Saponin	Sigma-Aldrich	S-7900
Tissue Chopper Blade	Ted Pella	121-6
Tissue Chopper Plastic Disk	Ted Pella	10180-01
Trypsin	VWR	VWRL0154-0100