JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

سريريا, نقص الإستروجين في النساء في سن اليأس قد تفاقم حدوث اضطراب الدهون وتصلب الشرايين. أنشأنا نموذج نقص الإستروجين في الجسم الحي عن طريق استئصال المبيض الثنائي عن طريق شق مزدوج الظهر الجانبي في apoE-/- الفئران. نموذج الماوس ينطبق على فحص علاجات الإستروجين الخارجية من خلل القلب والأوعية الدموية بعد انقطاع الطمث.

Abstract

النساء بعد سن اليأس أكثر عرضة للإصابة بأمراض القلب والأوعية الدموية من النساء قبل سن اليأس. الفئران الإناث المبيضين (OVX) في عرض الوهن زيادة الآفات تصلب الشرايين في الأبهر مقارنة مع الفئران الإناث مع وظيفة المبيض سليمة. ومع ذلك، تفتقر النماذج المختبرية التي تنطوي على الفئران التي تعاني من نقص الإستروجين مع حالة عرضة لتصلب الشرايين. هذا العجز أمر بالغ الأهمية لأن نقص الإستروجين السريري في النساء في سن اليأس قد تفاقم حدوث اضطراب الدهون الموجودة من قبل أو الجارية وتصلب الشرايين. في هذه الدراسة، نقوم بإنشاء نموذج ماوس في الجسم الحي ناقص الإستروجين عن طريق استئصال المبيض الثنائي عن طريق شق مزدوج الظهر الجانبي في apolipoprotein E (apoE)-/- الفئران. ثم نقارن آثار 17β-استراديول والزائفة (PPD) (فيتوستروجين) تدار بشكل حول المحيط بالعين البورعنا عن طريق انتشار البندق. نجد أنه على الرغم من أن PPD يمارس بعض التأثير على الحد من وزن الجسم النهائي والبلازما TG في OVX apoE-/- الفئران، لديها قدرات مضادة للتصلب الشرايين والقلب واقية مقارنة مع نظيره 17β-استراديول. PPD هو فيتوستروجين التي تم الإبلاغ عنها لممارسة خصائص مضادة للورم. وهكذا، فإن الطريقة المقترحة تنطبق على فحص phytoestrogens عن طريق الإدارة البرفيلة لتحل محل العلاج بالهرمونات البديلة التقليدية في النساء بعد سن اليأس، والتي أفيد أن لديها يحتمل أن تكون ضارة الورم القدرات. إدارة البيروال عن طريق انتشار البندق غير الغازية، مما يجعلها قابلة للتطبيق على نطاق واسع لكثير من المرضى. تحتوي هذه المقالة على المظاهرات خطوة بخطوة من استئصال المبيض الثنائي عن طريق شق مزدوج الظهرالجانبي في أبو-/- الفئران وperoral 17β-استراديول أو استبدال هرمون الإستروجين النباتي عن طريق انتشار البندق. تتبع تحليلات وظيفة الدهون في البلازما والقلب والأوعية الدموية باستخدام تخطيط صدى القلب.

Introduction

وقد أظهرت الدراسات الوبائية والسريرية أن النساء بعد سن اليأس هي في خطر أكبر بكثير من أمراض القلب والأوعية الدموية من النساء قبل سن اليأس1،2. العلاج بالهرمونات البديلة (HRT) قد يقلل من المخاطر النسبية لأمراض القلب والأوعية الدموية إلى 0.37-0.793. من بين المضاعفات الأخرى، تصلب الشرايين الناجمعن أمراض القلب والأوعية الدموية هو السبب الرئيسي للوفاة في جميع أنحاء العالم4. ومع ذلك، تفتقر النماذج المختبرية التي تنطوي على الفئران التي تعاني من نقص الإستروجين التي تعرض حالة عرضة لتصلب الشرايين. يوفر هذا البروتوكول في الجسم الحي نقص الإستروجين نموذج الماوس لفحص علاجات الإستروجين الخارجية من خلل القلب والأوعية الدموية بعد انقطاع الطمث.

الدراسات السابقة تبين أن تطبيق OVX في القوارض تصلب الشرايين تغذية نظام غذائي عالي الكولسترول يمكن أن يحاكي النساء بعد سن اليأس الذين يعانون من تصلب الشرايين5،6،7،8. نموذج حيواني قابل للاستنساخ ومريحة تشبه حالة تصلب الشرايين في النساء في سن اليأس هو أساس أبحاث الإستروجين الخارجية. هنا، تم تطبيق شق مزدوج الظهرالجانبي من استئصال المبيض الثنائي في تصلب الشرايين المعرضة للتصلب apolipoprotein E بالضربة القاضية (apoE-/-) الفئران9،10. بالمقارنة مع شق في البطن الأوسط أو الظهري، شق الظهرية الجانبية المزدوجة هو أسهل، وسيلة أقل استهلاكا للوقت التي يمكن تجنب التصاق تجويف البطن الشديد والتهاب. إدارة بيروال عن طريق انتشار البندق (انظر جدولالمواد) غير الغازية ومريحة، مما يجعلها قابلة للتطبيق على نطاق واسع كأسلوب إدارة على المدى الطويل11. بطيئة الإفراج عن زرعبيليه هو أيضا شعبية 6. ومع ذلك، قد تؤدي الغرسات إلى تفاقم حدوث العدوى خاصة في الفئران التي تتعرض لـ OVX. وسائط الإدارة غير الغازية الأخرى، مثل اللقاحات عن طريق الفم وإدارة المياه، لديها أيضا العديد من العيوب. عادة ما الإجهاد اللقاحات عن طريق الفم الفئران ويمكن أن يسبب إصابة المريء. إدارة الهرمون عن طريق مياه الشرب مفيد للغاية; ومع ذلك، فإن إضافة DMSO كمستحلب أمر لا مفر منه كما الإستروجين الخارجية غير قابلة للذوبان في الماء. هنا, اخترنا peroral 17β-استراديول أو استبدال هرمون الإستروجين النباتي عن طريق انتشار البندق للإدارة على المدى الطويل.

في الآونة الأخيرة، تم الطعن في التأثير المفيد لHRT على نظام القلب والأوعية الدموية للنساء بعد سن اليأس في التجارب مبادرة صحة المرأة (WHI)12. من ناحية, الإستروجين الخارجية وحدها تمارس تأثير مفيد على نظام القلب والأوعية الدموية; من ناحية أخرى, فإنه يمكن الجمع بين مع خلات metohydroxyprogesterone لزيادة خطر أحداث القلب والأوعية الدموية. وبشكل أكثر خطورة، HRT قد يؤدي إلى تطور ورم الثدي والرحم، وهذا التأثير قد حد بشكل ملحوظ استخدامه13،14. وقد تركز المزيد من الاهتمام على الآثار الواقية للقلب والأوعية الدموية من هرمون الاستروجين الخارجي تفتقر إلى النشاط الميتوتيك في الخلايا السرطانية15,16,17. دراسات متعددة في البشر والحيوانات تشير إلى أن phytoestrogens مع هياكل مماثلة لتلك التي من هرمون الاستروجين يمكن أن تلعب دورا مفيدا في حماية القلب والأوعية الدموية15,18.

وهكذا، فإن أهداف العمل الحالي هي '1' بناء نموذج الماوس نقص الإستروجين في الجسم الحي عن طريق استئصال المبيض الثنائي عن طريق شق مزدوج الردور الجانبي في apoE-/- الفئران و '2' لمقارنة الآثار الواقية القلب والأوعية الدموية من قبل الجميع تدار 17β-استراديول والزائفة (PPD)، عن طريق انتشار البندق. 17β-استراديول هو نوع واحد من الإستروجين الخارجي الذي ينتمي إلى الهرمونات الجنسية الأنثوية6,11,19. PPD, الصابونين الستيرويد وphytoestrogen من النباتات Dioscorea, وقد أفيد سابقا لممارسة خصائص مضادة للورم20.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

تمت الموافقة على جميع البروتوكولات المتعلقة برعاية الحيوانات والبروتوكولات التجريبية من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها التابعة للأكاديمية الصينية للعلوم الطبية وكلية الطب في اتحاد بكين (إذن رقم: SYXK (بكين) 2013-0023). أصل apoE-/- الفئران هو C57BL/6J9،10.

1. استئصال المبيض الثنائي عن طريق شق مزدوج الظهرية الجانبية في apoE-/- الفئران

  1. في الوض (العمر 28 يوما)، والتخدير الإناث apoE-/- C57BL/6J الفئران مع avertin (ثلاثي البروم الإيثانول؛ 200 ملغ / كغ؛ داخل اقصاق).
    ملاحظة: تم تقسيم 32 apoE-/- الفئران عشوائياً إلى 4 مجموعات: الشام، OVX، OVX/E2، ومجموعة OVX/PPD (n = 8 لكل مجموعة).
  2. وضع الحيوان في موقف عرضة على وسادة التدفئة. تطبيق زيوت التشحيم العين لحماية العين أثناء التخدير.
  3. الحفاظ على درجة حرارة الجسم في غضون 36 ± 0.5 درجة مئوية. إدارة 5 مغ/كغ وزن الجسم من carprofen مسكن تحت الجلد إلى الجانب الجانبي من عنق الماوس.
  4. حلاقة 3 × 5 سم2 منطقة الماوس cephalic من قمة الحرقفي. قبل تغطية الحيوان مع ورقة جراحية 3 × 5 سم2 فتحة، وتنظيف المنطقة حلق تماما مع اليود ثم 70٪ الإيثانول. استخدام الأدوات المعقمة والقفازات أثناء التجربة.
  5. استخدام مقص وملقط لجعل شق 1 سم الجانبية إلى خط الوسط و 1 سم الجانبية إلى الأضلاع كوستال.
  6. تشريح بصراحة الأنسجة تحت الجلد باستخدام ملقط.
  7. استخدام نظارات تشريح (انظر جدولالمواد) لتحديد الأنسجة الدهنية البيضاء في تجويف البطن.
  8. استخدام مقص دقيق وmicroforceps لجعل شق 0.5-1 سم من خلال اللفافة حتى يتم الوصول إلى تجويف البطن.
    ملاحظة: للمجموعة التي تعمل بالشام، أغلق الجروح مباشرة. خياطة طبقة العضلات والجلد بشكل منفصل باستخدام خياطة حيدة.
  9. عندما يمكن رؤية الأنسجة الدهنية البيضاء في تجويف البطن، والاستيلاء على الأنسجة الدهنية باستخدام microforceps وسحب بلطف بها. يمكن رؤية المبيض الوردي على شكل التوت ملفوفة بأنسجة الدهنية في تجويف البطن.
  10. قم بإنزال الأوعية القريبة من 0.5-1 سم وقرن الرحم باستخدام خياطة حيدة. إزالة المبيض باستخدام مقص صغير ووضع الأنسجة المتبقية مرة أخرى في تجويف البطن.
    ملاحظة: الأعراض السلبية الرئيسية لعملية OVX هو ربط الحالب الذي يؤدي إلى ارتفاع معدل الوفيات في الفئران التي تعمل بـ OVX. ويمكن تجنب ذلك عن طريق تحديد الأنسجة باستخدام الغبطة تشريح.
  11. أغلق الجروح خياطة طبقة العضلات والجلد بشكل منفصل باستخدام خياطة حيدة.
  12. استخدام مقص وملقط لجعل شق آخر 1 سم الجانبية إلى خط الوسط و 1 سم الجانبية إلى الأضلاع الساحلية على الجانب الآخر. كرر الإجراء أعلاه (1.5 إلى 1.11).
  13. دع الحيوان يستيقظ من التخدير. الاحتفاظ بالماوس بشكل منفصل في اليوم الأول بعد الجراحة.
  14. تنظيف أو استبدال القفص في كثير من الأحيان خلال مرحلة الانتعاش.
  15. ما يقرب من 24 ساعة بعد الجراحة، وإدارة آخر 5 ملغ / كغ من وزن الجسم من carprofen مسكن تحت الجلد.

2. إدارة بيروال من 17β-استراديول أو PPD عن طريق انتشار البندق

  1. إذابة 17 β-استراديول أو PPD في زيت السمسم، ثم اخلط زيت السمسم مع انتشار البندق (انظر جدولالمواد). جزء يومي لكل 30 غرام ماوس يحتوي على 3 ميكروغرام من 17β-استراديول أو 15 ميكروغرام من PPD، 4 ميكرولتر من زيت السمسم، و 60 ملغ من انتشار البندق. إعداد وهمي لكل 30 غرام الماوس يحتوي على 4 ميكرولتر من زيت السمسم و 60 ملغ من انتشار البندق.
    ملاحظة: ويستند الجزء الإداري اليومي من 17β-استراديول أو PPD على الدراسات السابقة6و11 والتجارب الأولية.
  2. بعد أسبوع واحد من OVX، تغذية الفئران مع اتباع نظام غذائي عالي الكولسترول (1.25٪ الكولسترول، 0٪ cholate) لمدة 12 أسبوعا. ويتضح في الشكل 1مخطط علاجي تجريبي نموذجي، كما هو مستخدم في هذه الدراسة.
  3. قبل 5 أيام من انتشار البندق في الأسبوع 4، تدريب الفئران لتناول الدواء الوهمي الذي يحتوي على ما يقرب من 30 ملغ انتشار البندق لمدة 2-5 الفئران لمدة 5 أيام. تدريب الفئران في مجموعات في أقفاص منازلهم خلال الأيام الثلاثة الأولى. وضع الفئران في أقفاص منفصلة في اليومين الرابع والخامس من التدريب وخدمة الجزء اليومي لتشبه الوضع التجريبي.
  4. خلال الأسابيع ال9 الماضية، ضع الفئران في أقفاص منفصلة ثم يقدم جزء ًا يوميًا من جزء انتشار البندق لكل مناسبة تغذية.
    ملاحظة: تقديم جزء يومي يحتوي على 17β-استراديول (0.1 ملغ·كغ-1)أو PPD (0.5 ملغ·كغ-1)عن طريق انتشار البندق في مجموعة OVX/E2 وOVX/PPD على التوالي؛ خدمة جزء يومي يحتوي على انتشار البندق خالية من الهرمونات في شام ومجموعة OVX.

3. تحديد سمك Intima-وسائل الإعلام وخلل القلب باستخدام نظام الموجات فوق الصوتية

  1. الفحص المجهري الحيوي فائق السونوغرافيا
    1. قبل يوم واحد من الإنهاء، فحص سمك intima-وسائل الإعلام وخلل القلب باستخدام نظام الموجات فوق الصوتية الدقيقة (انظر جدولالمواد) كما سبق وصفه21.
    2. قبل الفحص، إعطاء كل فأر حقن ة داخل الستابية 200 ملغ/كغ من avertin (ثلاثي بروموإيثانول) كتخدير (ن = 8 فئران لكل مجموعة).
    3. حلاقة شعر الرقبة من كل فأر بعناية. تطبيق هلام انتقال الموجات فوق الصوتية الدافئة بحرية لضمان جودة الصورة المثلى.
    4. احصل على صور أحادية الخط فائقة السونوغرافيا للجذر الأبهري والأبهر الصاعد مع رأس المسح الضوئي 30 ميغاهرتز عند تركيز 12.7 مم ودقة 40 ميكرومتر.
    5. استخدام تخطيط القلب الكهربائي مع تكوين الرصاص الثاني للرصد.
    6. التقاط الصور اليمنى ذات المحور الطويل للأبهر الصاعد، والقوس الأبهري، وفرع الشريان البشوقفي فيمستوى واحد في systole (الشكل 3).
  2. قياسات من [إينتيما-مديا] و [مإكسلل] لوح سماكة
    1. ضبط المسافة بين محول والموقع الشرياني بسهولة للحصول على صور واضحة.
    2. تخزين حلقة السينما 10 s رقميا لفحص حاليا على نظام تحليل الصور.
    3. اختر صورة فائقة الموجات فوق الصوتية مثالية للتجميد يدويًا لمزيد من القياسات. تحقق من الصور في انحناء طفيفة من الأبهر الصاعد. إذا كان يمكن رؤية البلاك في الأبهر الصاعد، وقياس سمك البلاك القصوى. إذا كان لا يمكن رؤية اللوحة في الأبهر الصاعد، وقياس الاتصالات المتنقلة الدولية القصوى.
    4. قياس الاتصالات المتنقلة الدولية (المسافة بين واجهة الأوعية الدموية الإنارة والواجهة الوسيطة- السبتية). قياس سمك البلاك القصوى (المسافة الأكثر سمكا بين حدود تجويف الأوعية الدموية والطبقة السبتية).
    5. متوسط البيانات من ثلاثةمواقع الآفات (الشكل 3).
  3. تحديد خلل القلب باستخدام تخطيط صدى القلب
    ملاحظة:     فحص وظيفة القلب من خلال تخطيط صدى القلب باستخدام نظام الموجات فوق الصوتية الدقيقة، كما سبق وصفه22.
    1. توجيه شعاع الموجات فوق الصوتية نحو القلب، بالقرب من العضلات الشعرية.
    2. تحقيق ثنائي الأبعاد تخطيط القلب القائم على كيلوهرتز التصور.
    3. أداء في الجسم الحي عبر الصدر تخطيط صدى البطين الأيسر باستخدام رأس المسح الضوئي 30 ميغاهيرتز.
    4. قياس المعلمات المرتبطة وظيفة القلب رقميا من تتبع وضع M.
    5. متوسط البيانات من ثلاث إلى خمسدورات القلب (الجدول 1).
  4. التباين داخل المراقبين وداخلهم
    1. للتحقق من التباين داخل المراقبين، قم بتحليل البيانات من قبل عامل تشغيل واحد في مناسبتين مختلفتين.
    2. لتقييم التباين بين المراقبين، قم بتحليل البيانات من قبل مشغل مختلف.

4. قياس وزن الجسم الأسبوعي والبلازما مجموع الكوليسترول (TC) والدهون الثلاثية (TG) تحديد

  1. قياس وزن الجسم الأسبوعي
    1. قياس أوزان الجسم مرة واحدة في الأسبوع من الأسبوع -1 إلى الأسبوع 12.
      ملاحظة: n = 8 فئران لكل مجموعة.
  2. إعداد البلازما
    1. قبل جمع عينات الدم من خلال ثقب داخل القلب، وإعداد المحاقن والأنابيب. استخدام EDTA كمضاد للتخثر. إضافة 10 ميكرولتر من 0.5 M EDTA إلى كل حقنة 2 مل، وإضافة 8 ميكرولتر من 0.5 M EDTA إلى كل أنبوب 1.5 مل.
    2. في الأسبوع 12، بعد الصيام بين عشية وضحاها، والتخدير الفئران مع avertin (ثلاثي البروم الإيثانول؛ 200 ملغ / كغ؛ داخل اقحام).
      ملاحظة: n = 3 فئران لكل مجموعة.
    3. إعداد منطقة الصدر البطني مع الإيثانول 70٪.
    4. استخدام مقص وملقط لفتح تجويف الصدر وقطع الأضلاع حتى يتعرض القلب النابض.
    5. أدخل إبرة 25 G في البطين الأيمن. يستنشق ببطء حتى يبدأ الدم في التدفق إلى الحقنة.
      ملاحظة: نحن نستخدم المحاقن التي يمكن التخلص منها في حالة معقمة مع إبر G 25 (انظر جدولالمواد).
    6. استمر في الإستنكب مع الضغط المستمر، وحتى. إذا لم يتم رؤية أي دم، تغيير موضع الإبرة وتكرار الطموح.
    7. الحفاظ على الفئران التخدير العميق قبل جمع حجم الدم المطلوب. عادة، يمكن جمع ما يصل إلى 1 مل من الدم. قتل الفئران عن طريق خلع عنق الرحم تحت هذه الحالة المخدرة العميقة.
    8. عينات الدم ماصة في أنابيب 1.5 مل وعكس الدم تماما لضمان خلط EDTA في الدم. ثم وضع عينات الدم على الجليد على الفور.
    9. عينات الطرد المركزي لمدة 20 دقيقة في 400 × ز في 4 درجة مئوية في غضون 30 دقيقة من جمع.
    10. جمع supernatant بعناية. Aliquot وتخزين عينات البلازما في -80 درجة مئوية.
  3. إنشاء منحنيات قياسية لقياس محتوى TC أو TG
    1. بالنسبة لمنحنى TC القياسي، قم بإعداد تركيزات مختلفة من معايير الكوليسترول في الدم: 0 مليمول/لتر، 0.52 مليمول/لتر، 1.03 مليمول/لتر، 2.07 مل/لتر، 4.14 مليمول/لتر، 6.20 مليمول/لتر، 8.27 مليمول/لتر و10.34 مليمول/لتر. تعيين متوسط O.D. لكل معيار الكولسترول. كقيمة المحور العمودي (ص)، قم بتعيين التركيز كقيمة المحور الأفقي (X). إنشاء منحنى قياسي باستخدام برنامج إحصائي.
    2. بالنسبة للمنحنى القياسي TG، قم بإعداد تركيزات مختلفة من معايير TG: 0 مليمول/لتر، 0.45 مليمول/لتر، 0.90 مليمول/لتر، 1.81 مل/لتر، 3.62 مليمول/لتر، 5.42 مليمول/لتر، 7.23 مل/لتر و9.04 مل/لتر. تعيين متوسط O.D. لكل معيار TG كقيمة المحور العمودي (Y) ; تعيين التركيز كقيمة المحور الأفقي (X). إنشاء منحنى قياسي باستخدام برنامج إحصائي.
      ملاحظة: وقد استُخدم في هذه الدراسة تركيب منحنى لوجستي رباعي المعلمات (4-pl) في بناء المنحنى القياسي. تحقق من المنحنى القياسي قبل قياس عينات البلازما وتأكد من أن r2 أكبر من 0.995.
  4. قياس محتوى TC
    1. تسمية زجاجة من الكاشف اللون (25 مل) من TC اختبار عدة باسم "TC حل العمل".
    2. دوامة العينات المبردة لفترة وجيزة. إعداد التخفيفات: 20 ميكرولتر من البلازما في 80 ميكرولتر من الماء المقطر. لفترة وجيزة دوامة تخفيفات.
    3. إضافة 2.5 ميكرولتر من معايير الكوليسترول (5.17 مليمول / لتر) أو 2.5 ميكرولتر من البلازما المخففة أو 2.5 ميكرولتر من الماء المقطر (فارغة) إلى الآبار المناسبة من لوحة 96 جيدا. يوصى بثلاثة أضعاف.
    4. إلى جميع الآبار، إضافة 250 درجة مئوية من الكاشف اللون.
    5. حضانة في 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
    6. تشغيل قارئ ميكروبليت والسماح للتسخين 10 دقيقة.
    7. إزالة لوحة (ق) من الحاضنة وقراءة قارئ ميكروبليت في 510 نانومتر. تأكد من عدم وجود فقاعات أو غبار في آبار ميكروتيدر أو في الجزء السفلي من اللوحة، على التوالي.
    8. حساب تركيز TC على النحو التالي:
      TC cont. = معايير الكوليسترول في الدم cont. × (عينة البلازما O.D.-فارغة O.D)/ (معايير الكوليسترول O.D.-فارغة O.D)
  5. قياس محتوى TG
    1. تسمية زجاجة من الكاشف اللون (25 مل) من TG اختبار عدة باسم "TG حل العمل".
    2. دوامة العينات المبردة لفترة وجيزة.
    3. إضافة 2.5 ميكرولتر من معايير TG (2.26 مليمول/لتر) إلى أو 2.5 ميكرولتر من البلازما المخففة أو 2.5 ميكرولتر من الماء المقطر (فارغ) إلى الآبار المناسبة للوحة 96 بئر. يوصى بثلاثة أضعاف.
    4. إلى جميع الآبار، إضافة 250 درجة مئوية من الكاشف اللون.
    5. حضانة في 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
    6. تشغيل قارئ ميكروبليت والسماح للتسخين 10 دقيقة.
    7. إزالة لوحة (ق) من الحاضنة وقراءة قارئ ميكروبليت في 510 نانومتر.
      ملاحظة: تأكد من عدم وجود فقاعات أو غبار في آبار ميكروتيدر أو في الجزء السفلي من اللوحة.
    8. حساب تركيز TG على النحو التالي:
      TG cont. = TG المعايير cont. × (عينة البلازما O.D.-فارغة O.D) / (TG المعايير O.D.-فارغة O.D)

5. تحليل الوجه من الآفات الأبهري تصلب الشرايين

  1. عزل وختان الأبهر
    1. في الأسبوع 12، بعد الصيام بين عشية وضحاها، والتخدير الفئران مع avertin (ثلاثي البروم الإيثانول؛ 200 ملغ / كغ؛ داخل اقحام). قتل الفئران عن طريق خلع عنق الرحم تحت هذه الحالة المخدرة العميقة.
      ملاحظة: استخدمنا 3 فئران لكل مجموعة.
    2. إعداد منطقة الصدر البطني مع الإيثانول 70٪. استخدام مقص وملقط لفتح تجويف الصدر وقطع الأضلاع حتى يتعرض القلب النابض.
    3. ملء حقنة 50 مل مع الفوسفات المخزنة المالحة في الحموضة 7.4 (انظر جدولالمواد). أدخل 25 غ من الإبرة في البطين الأيسر واقطع الأذين الأيمن لتجنب الضغط العالي من التسريب.
    4. أداء التسريب في الموقع بمعدل تدفق من 0.05-0.08 مل / دقيقة.
    5. إزالة الأضلاع والرئتين في تجويف الصدر مع مقص وملقط. ثم، فتح تجويف البطن وإزالة الأعضاء داخل لعرض أفضل من الشريان الأبهري.
    6. إزالة الأبهر عن طريق عقد القلب مع microforceps وفصل الأبهر من الظهرية العمود الفقري مع microscisssors حتى الانقسام الحرقفي.
      ملاحظة: عند تشريح بالقرب من الفروع الأذينية الكلوية، قطع بعمق باستخدام مقص صغير لتجنب تلف الأبهر.
    7. إصلاح القلب والأبهر لمدة 48 ساعة في 4٪ بارافورماليدهايد. تخزين الأبهر في المالحة في درجة حرارة الغرفة أو في 2-8 درجة مئوية لبضع ساعات.
      ملاحظة: هذا الإجراء سوف يسهل التنظيف.
  2. إعداد الأبهر
    1. إزالة القلب. إزالة بعناية الأنسجة السبتية من الأبهر باستخدام microforceps وmicroscissorss تحت مجهر مجسم. استخدام المالحة للحفاظ على الأنسجة رطبة أثناء التنظيف.
      ملاحظة: كن حذراً من عدم المسيل للدموع أو شق الشريان الأبهر وبعض الفروع الهامة، مثل الشريان innominat، غادر الشريان السباتي المشترك، والشريان تحت الترقوة الأيسر.
    2. اترك 1 مم من الشرايين السباتية الشائعة وتتركها وتقطع الشريان تحت الترقوة الأيسر بأكمله.
    3. قطع انحناء الخارجي من خلال الشريان الداخلي، ثم إلى الشريان السباتي الشائع الأيسر، ثم إلى الشريان تحت الترقوة الأيسر.
    4. قطع مفتوحة على طول انحناء الداخلية للجزء التصاعدي إلى الجزء السفلي من الجزء البطني.
    5. ضعي الأبهر المسطح على ورقة بلاستيكية سوداء وطبقي ملحًا للحفاظ على الأبهر من التجفيف.
  3. صورة للمنطقة الألفة من الأبهر
    1. التقاط صور من الأبهر الوجه مع المجهر ستيريو. قم بتضمين مسطرة مقياس ملليمتر في الصور لمعايرة القياسات.
    2. إدراج مناطق القوس والصدر في نفس الصورة ومنطقة البطن في آخر. حفظ الصور كـ JPEG أو TIFF.
      ملاحظة: المنطقة القوسية هي من تقاطع عضلة القلب إلى 3 مم القاصي من الشريان تحت الترقوة الأيسر، والمنطقة الصدرية هي 3 ملم من البعد إلى الشريان تحت الترقوة الأيسر إلى الشريان الوربي الأخير، ومنطقة البطن هي الشريان الأوربي الأخير إلى الإليافية التشعب.
  4. قياس كمية من طريقة الوجه الآفة تصلب الشرايين
    1. المعايره
      1. افتح الصورة باستخدام برنامج تحليل الصور (راجع جدولالمواد)، انتقل إلى المعايرة المكانية واتبع التعليمات.
      2. تغيير الوحدات المرجعية إلى مم عن طريق وضع المسطرة فوق الخط.
    2. قياس
      1. تعيين المعايرة الصحيحة لكل صورة.
      2. قياس 3 ملم على المسطرة.
      3. قياس القوس والمنطقة الصدرية: قم بتخطيط المنطقة القوسية من تقاطع عضلة القلب إلى 3 مم من الشريان تحت الترقوة الأيسر والمنطقة الصدرية من 3 مم إلى الشريان تحت الترقوة الأيسر إلى الشريان الأوربي الأخير. تتبع الآفات في منطقة القوس والصدر وننظر إلى الأبهر من خلال المجهر.
      4. قياس منطقة البطن: مخطط منطقة البطن من نهاية المنطقة الصدرية إلى الانقسام الحرقفي. تتبع الآفات في منطقة البطن وننظر إلى الشريان الأبهري من خلال المجهر.
      5. حساب منطقة الآفة بالنسبة إلى السطح الداخلي للأبهر.
      6. تحقق من القياس الكمي من خلال مراقب ثان أعمى للجان الدراسة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

ويتضح في الشكل 1مخطط علاجي تجريبي نموذجي، كما هو مستخدم في هذه الدراسة. في الوض (العمر 28 يوماً)، تم التخدير الإناث apoE-/- C57BL/6J الفئران معavertin (ثلاثي بروموثانول؛ 200 ملغ /كغ؛ داخل اقبية). كانت الفئران ثنائيا OVX أو الشام تعمل من خلال شق الظهر 1 سم. بعد أسبوع وا?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

المنهجية الموصوفة هنا هو نموذج الماوس تشبه اضطراب الدهون وتصلب الشرايين ينظر في النساء في سن اليأس. ومن الموثق جيدا أن نقص الإستروجين في النساء بعد سن اليأس يمكن أن تفاقم حدوث ارتفاع الكوليسترول في الدم الموجودة من قبل أو الجارية مع الآفات التصلبية المعقدة تدريجيا وعلى نطاق واسع

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

ويعلن صاحبا البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgements

وقد دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (81202526 إلى J.X.)، والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (81302769 إلى B.S.)، ومؤسسة العلوم الطبيعية لبلدية بكين (47144226 إلى B.S.)، وشهادة الدكتوراه الصينية مؤسسة العلوم (20110490325 إلى J.X.)، ومؤسسة برامج الدكتوراه التابعة لوزارة التعليم في الصين (20121106120031 إلى B.S.).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
17β-estradiol, >98%Sigma-AldrichE8875-250MGEstrogen
Disposable syringes (with 25 G needles)Hunan Luzhou Huikang Development Co., Ltd0.5*19TWLBCardiac bleeding
High-cholesterol mouse dietHuafukang Bio-TechnologyN/A1.25% cholesterol, 0% cholate
High-Resolution In Vivo Micro-Imaging SystemVisualSonicsVevo®770Measurements of intima-media thickness and cardiac dysfunction
2-Methyl-2-butanolSigma-Aldrich152463-250MLPreparation of avertin
Micro Dissecting forceps, Curved 8mmKanghua Medical Equipment Co., LtdSurgical tools
Micro Dissecting forceps, Straight 8 mmKanghua Medical Equipment Co., LtdSurgical tools
Micro Dissecting Scissors, Curved/Sharp 8 mmKanghua Medical Equipment Co., LtdSurgical tools
Micro Dissecting Scissors, Straight/Sharp 8 mmKanghua Medical Equipment Co., LtdSurgical tools
Monofilament suture 4-0 1/2 5 x 12 19 mmShanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co., LtdR413Suture and ligation of the tissues
Nut cream (Nutella)FerreroN/AMedium for peroral 17β-estradiol or PPD
OptiVisor optical glass binocular magnifierDohegan Optical Company Inc.N/AAssistant of identifying the tissues during ovariectomy
Phosphate-buffered saline at pH 7.4SIGMAP3813Preparing 1 L saline
Pro MultiLabel Microplate ReaderTecanInfinite M1000Plasma TC and TG determination
PseudoprotodioscinShanghai Winherb Medical S & T DevelopmentW-0427CAS registry no. 102115-79-7
Rimadyl, 50 mg/mLPfizer Pharma GmbH462986Postoperative analgesia after ovariectomy
Sesame oilSigma-AldrichS3547-1LDissolving the 17β-estradiol or PPD
Solcoseryl Eye-GelMenarini, Solco Basle Ltd.Eye protection during anesthesia
Stereo microscopeMCALONMCL-6STVImage of the intimal region of aorta
Table model high speed centrifugeSIGMA1-14KPreparation of plasma
Scissors, slight Curve (14 cm)Kanghua Medical Equipment Co., LtdSurgical tools
Scissors, straight Flat (14 cm)Kanghua Medical Equipment Co., LtdSurgical tools
Tissue forceps, serrated, slight Curve (14 cm)Kanghua Medical Equipment Co., LtdSurgical tools
Tissue forceps, serrated, straight Flat (14 cm)Kanghua Medical Equipment Co., LtdSurgical tools
TribromoethanolSigma-AldrichT48402-5GPreparation of avertin
Triglycerides (TG) assay kitInstitute of Nanjing Jiancheng Biology EngineeringA110-1Plasma TG determination
Total cholesterols (TC) assay kitInstitute of Nanjing Jiancheng Biology EngineeringA111-1Plasma TC determination

References

  1. Mozaffarian, D., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2016 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 133 (4), e38-e360 (2016).
  2. Packard, B. L. Cardiovascular health and disease in women. The New England Journal of Medicine. 329 (4), 247-256 (1993).
  3. Samaan, S. A., Crawford, M. H. Estrogen and cardiovascular function after menopause. Journal of the American College of Cardiology. 26 (6), 1403-1410 (1995).
  4. Libby, P. Inflammation in atherosclerosis. Nature. 420 (6917), 868-874 (2002).
  5. Tremollieres, F. A., et al. Effect of hormone replacement therapy on age-related increase in carotid artery intima-media thickness in postmenopausal women. Atherosclerosis. 153 (1), 81-88 (2000).
  6. Bourassa, P. A., Milos, P. M., Gaynor, B. J., Breslow, J. L., Aiello, R. J. Estrogen reduces atherosclerotic lesion development in apolipoprotein E-deficient mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (3), 10022-10027 (1996).
  7. Squadrito, F., et al. Genistein supplementation and estrogen replacement therapy improve endothelial dysfunction induced by ovariectomy in rats. Cardiovascular Research. 45 (2), 454-462 (2000).
  8. Wang, D., et al. Endothelial dysfunction and enhanced contractility in microvessels from ovariectomized rats: roles of oxidative stress and perivascular adipose tissue. Hypertension. 63 (5), 1063-1069 (2014).
  9. Zhang, S. H., Reddick, R. L., Piedrahita, J. A., Maeda, N. Spontaneous Hypercholesterolemia and Arterial Lesions in Mice Lacking Apolipoprotein E. Science. 258 (5081), 468-471 (1992).
  10. Nakashima, Y., Plump, A. S., Raines, E. W., Breslow, J. L., Ross, R. ApoE-Deficient Mice Develop Lesions of All Phases of Atherosclerosis Throughout the Arterial Tree. Arteriosclerosis and Thrombosis. 14 (1), 133-140 (1994).
  11. Ström, J. O., Theodorsson, A., Ingberg, E., Isaksson, I. M., Theodorsson, E. Ovariectomy and 17-estradiol Replacement in Rats and Mice: A Visual Demonstration. Journal of Visualized Experiments. 64 (e4013), 1-4 (2012).
  12. Rossouw, J. E., et al. Risks and benefits of estrogen plus progestin in healthy postmenopausal women: principal results From the Women's Health Initiative randomized controlled trial. The Journal of the American Medical Association. 288 (3), 321-333 (2002).
  13. Kumle, M. Declining breast cancer incidence and decreased HRT use. Lancet. 372 (9639), 608-610 (2008).
  14. Jager, W., et al. A randomized comparison of triptorelin and tamoxifen as treatment of progressive ovarian cancer. Anticancer Research. 15 (6B), 2639-2642 (1995).
  15. Bhathena, S. J., Velasquez, M. T. Beneficial role of dietary phytoestrogens in obesity and diabetes. The American Journal of Clinical Nutrition. 76 (6), 1191-1201 (2002).
  16. Wang, L., Qiu, X. M., Hao, Q., Li, D. J. Anti-inflammatory effects of a Chinese herbal medicine in atherosclerosis via estrogen receptor beta mediating nitric oxide production and NF-kappaB suppression in endothelial cells. Cell Death and Disease. 4 (e551), 1-13 (2013).
  17. Xiao, J., Wang, N. L., Sun, B., Cai, G. P. Estrogen receptor mediates the effects of pseudoprotodiocsin on adipogenesis in 3T3-L1 cells. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 299 (1), C128-C138 (2010).
  18. Guivarc'h, E., et al. Predominant Role of Nuclear Versus Membrane Estrogen Receptor alpha in Arterial Protection: Implications for Estrogen Receptor alpha Modulation in Cardiovascular Prevention/Safety. Journal of the American Heart Association. 7 (13), 1-17 (2018).
  19. Osako, M. K., et al. Estrogen inhibits vascular calcification via vascular RANKL system: common mechanism of osteoporosis and vascular calcification. Circulation Research. 107 (4), 466-475 (2010).
  20. Ivanova, A., et al. Screening of some saponins and phenolic components of Tribulus terrestris and Smilax excelsa as MDR modulators. In vivo. 23 (4), 545-550 (2009).
  21. Xiao, J., Zhu, T., Yin, Y. Z., Sun, B. Notoginsenoside R1, a unique constituent of Panax notoginseng, blinds proinflammatory monocytes to protect against cardiac hypertrophy in ApoE(-/-) mice. European Journal of Pharmacology. 833 (15), 441-450 (2018).
  22. Sun, B., Xiao, J., Sun, X. B., Wu, Y. Notoginsenoside R1 attenuates cardiac dysfunction in endotoxemic mice: an insight into oestrogen receptor activation and PI3K/Akt signalling. British Journal of Pharmacology. 168 (7), 1758-1770 (2013).
  23. Adams, M. R., et al. Inhibition of coronary artery atherosclerosis by 17-beta estradiol in ovariectomized monkeys. Lack of an effect of added progesterone. Arteriosclerosis. 10 (6), 1051-1057 (1990).
  24. Keaney, J. F. Jr, et al. 17 beta-estradiol preserves endothelial vasodilator function and limits low-density lipoprotein oxidation in hypercholesterolemic swine. Circulation. 89 (5), 2251-2259 (1994).
  25. Nakashima, Y., Plump, A. S., Raines, E. W., Breslow, J. L., Ross, R. ApoE-deficient mice develop lesions of all phases of atherosclerosis throughout the arterial tree. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 14 (1), 133-140 (1994).
  26. Saleh, T. M., Cribb, A. E., Connell, B. J. Estrogen-induced recovery of autonomic function after middle cerebral artery occlusion in male rats. American Journal of Physiology- Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 281 (5), R1531-R1539 (2001).
  27. Bingham, D., Macrae, I. M., Carswell, H. V. Detrimental effects of 17beta-oestradiol after permanent middle cerebral artery occlusion. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 25 (3), 414-420 (2005).
  28. Pignoli, P., Tremoli, E., Poli, A., Oreste, P., Paoletti, R. Intimal plus medial thickness of the arterial wall: a direct measurement with ultrasound imaging. Circulation. 74 (6), 1399-1406 (1986).
  29. Hodgin, J. B., Maeda, N. Minireview: estrogen and mouse models of atherosclerosis. Endocrinology. 143 (12), 4495-4501 (2002).
  30. Bush, T. L., et al. Cardiovascular mortality and noncontraceptive use of estrogen in women: results from the Lipid Research Clinics Program Follow-up Study. Circulation. 75 (6), 1102-1109 (1987).
  31. Marsh, M. M., Walker, V. R., Curtiss, L. K., Banka, C. L. Protection against atherosclerosis by estrogen is independent of plasma cholesterol levels in LDL receptor-deficient mice. Journal of Lipid Research. 40 (5), 893-900 (1999).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

150 intima

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved