الكتابة الجينية لعنابة النعمان البحرية خلال التنمية المبكرة

Summary

والهدف من هذا البروتوكول هو النمط الجيني لداء النعمان البحر نيماتوستيلا vectensis أثناء التطفل دون التضحية بالجنين.

Abstract

يوصف هنا بروتوكول يستند إلى PCR للنمط الجيني للجنين مرحلة gastrula من الأنثوزون نيماتوستيلا vectensis دون التضحية بحياة الحيوان. بعد الإخصاب في المختبر وإزالة هلام، يسمح zygotes لتطوير لمدة 24 ساعة في درجة حرارة الغرفة للوصول إلى مرحلة مبكرة إلى منتصف gastrula. ثم توضع أجنة غازترولا على سرير جل أغاروز في طبق بيتري يحتوي على مياه البحر. تحت المجهر تشريح، يتم استخدام إبرة التنغستن لفصل جراحيا جزء من الأنسجة الأبال من كل جنين. ثم يسمح للأجنة بعد الجراحة بالشفاء ومواصلة النمو. يتم استخراج الحمض النووي الجينومي من جزء الأنسجة المعزولة واستخدامه كقالب لPCR خاص بالموقع. ويمكن تحديد النمط الجيني على أساس حجم منتجات PCR أو وجود/عدم وجود منتجات PCR الخاصة بالأليل. ثم يتم فرز الأجنة بعد الجراحة وفقا للنمط الجيني. تعتمد مدة عملية الكتابة الجينية بأكملها على عدد الأجنة التي سيتم فحصها، ولكنها تتطلب الحد الأدنى 4-5 ساعة. ويمكن استخدام هذه الطريقة لتحديد المتحولين بالضربة القاضية من مجموعة غير متجانسة وراثيا من الأجنة وتمكن من تحليل الأنماط الظاهرية أثناء التنمية.

Introduction

يمثل الكنيداريون مجموعة متنوعة من الحيوانات التي تشمل قنديل البحر والشعاب المرجانية وشاطئ النعمان البحري. وهي ثنائية الخلايا، تتكون من ectoderm وendoderm التي يتم فصلها بواسطة مصفوفة خارج الخلية (mesoglea). Cnidaria هي مجموعة شقيقة لspeciose Bilateria، والتي نماذج الحيوانات التقليدية مثل دروسوفيلا وموس تنتمي¹. بالإضافة إلى ذلك، يعتقد أن الاختلاف Cnidaria-Bilateria قد حدث في فترة ما قبل الكمبري². وعلى هذا النحو، فإن الدراسات المقارنة للسكانيين والبلاتيريين ضرورية للحصول على رؤى في بيولوجيا أسلافهم المشتركين الأحدث. في الآونة الأخيرة، كشفت علم الجينوم المقارن أن cnidarians وbilaterians حصة العديد من الجينات مجموعة أدوات التنمية مثل الشق وbHLH، مما يعني أن أسلافهم المشتركة لديها بالفعل هذه الجينات³. ومع ذلك، فإن دور هذه الجينات مجموعة أدوات التنمية في السلف المشترك الأخير من Cnidaria وBilateria هو أقل فهما بالمقارنة جيدا. ولمعالجة هذه المشكلة، من الأهمية بمكان دراسة كيفية عمل هذه الجينات المحفوظة بعمق في الكنيداريين.

واحدة من النماذج الوراثية cnidarian الناشئة هو الأنثوزون نيماتوستيلا vectensis. وقد تم تسلسل الجينوم³، ومجموعة متنوعة من الأدوات الوراثية ، بما في ذلك المورفولينول بوساطة الجينات بالضربة القاضية ، وtransgenesuclease بوساطة transgenes ، وكريسبر-Cas9 بوساطة الجينات knockins وخروج المغلوب ، متاحة الآن للاستخدام في هذا الحيوان. وبالإضافة إلى ذلك، فإن تطوير نيماتوستيلا مفهوم بشكل جيد نسبيا. أثناء تكوين الجنين، يحدث التطفل عن طريق المهبل⁴، ويتطور الجنين إلى يرقة بلنبولا السباحة الحرة. وتتحول البلنة في وقت لاحق إلى ورم مسيل مع الفم والمخالب المحيطة. ثم ينمو ورم ويصل إلى النضج الجنسي.

كريسبر-Cas9 بوساطة الطفرات المستهدفة يستخدم الآن بشكل روتيني لدراسة وظيفة الجينات في نيماتوستيلا vectensis^5,6,7,8,9. لتوليد متحولين بالضربة القاضية في Nematostella، يتم حقن كوكتيل يحتوي على locus محددة واحدة دليل RNAs والبروتين Cas9 endonuclease لأول مرة في البيض غير المخصبة أو المخصبة لإنتاج الحيوانات مؤسس F0 التي تظهر عادة الفسيفساء. يتم رفع الحيوانات F0 في وقت لاحق إلى النضج الجنسي وعبرت مع بعضها البعض لإنتاج السكان F1، مجموعة فرعية منها قد تكون متحولة بالضربة القاضية⁶. بدلا من ذلك، يمكن عبور الحيوانات F0 ناضجة جنسيا مع الحيوانات البرية من نوع لتوليد الحيوانات Heterozygous F1، وF1 heterozygotes التي تحمل أليل بالضربة القاضية في موضع الاهتمام يمكن بعد ذلك أن عبرت مع بعضها البعض لإنتاج ذرية F2، ربع منها من المتوقع أن تكون متحولة بالضربة القاضية⁵. ويتطلب كلا النهجين طريقة لتحديد المتحولين بالضربة القاضية من السكان غير المتجانسين وراثيا. يمكن استخدام مخالب البولي لاستخراج الحمض النووي الجينيللكتابة الجينية 6،^7. ومع ذلك، في الحالات التي يتم فيها التحقيق في الوظيفة التنموية لجين الاهتمام ولا تصل الأجنة المتحولة إلى مرحلة البول (أي بسبب فتك اليرقات المرتبطة بالطفرة)، يجب تحديد المتحولين بالضربة القاضية في وقت مبكر من الأنطوجيني. يوصف هنا هو بروتوكول يستند إلى PCR للالحيوانات الفردية النمط الجيني في مرحلة gastrula دون التضحية الحيوان، والتي تمكن من تحديد المتحولين بالضربة القاضية من مجموعة غير متجانسة وراثيا من الأجنة. تعتمد مدة عملية الكتابة الجينية بأكملها على عدد الأجنة التي سيتم فحصها، ولكنها تتطلب الحد الأدنى 4-5 ساعة.

Protocol

1. تحريض التفريخ، والإخصاب في المختبر، وإزالة هلام

1. الحفاظ على vectensis Nematostella في مياه البحر مع ملوحة من 12 أجزاء في الألف (ppt) في الظلام في 16 درجة مئوية، وتغذية Artemia يوميا.
2. في اليوم السابق للتفريخ التعريفي، ضع الحيوانات في حاضنة تعمل بدرجة الحرارة والضوء. برنامج الحاضنة بحيث تتعرض الحيوانات إلى 8 ح من الضوء في 25 درجة مئوية. اختياري: إطعام قطعة صغيرة (<1 مم³⁾من المحار للالحيوانات الفردية قبل وضعها في الحاضنة لتعزيز التفريخ.
3. ترك الحيوانات في الحاضنة لمدة 1 ساعة في 16 درجة مئوية.
4. إزالة الحيوانات من الحاضنة وتركها على سطح مقاعد البدلاء مع الضوء في درجة حرارة الغرفة (RT) للسماح تفرخ. عادة ما يحدث التفريخ في غضون 1.5-2 ساعة التالية.
5. إذا كان الذكور والإناث في حاويات منفصلة، ضع حزم البيض من حاوية الإناث في حاوية الذكور التي تحتوي على الحيوانات المنوية باستخدام ماصة نقل الذي يتم قطع طرفه لتوسيع الفتحة بحيث لا تتلف البيض من الإجهاد الميكانيكي أثناء نقل. السماح بتخصيب البيض بتركهم في حاوية الذكور لمدة 15 دقيقة على الأقل.
6. دي جيلي حزم البيض في مياه البحر التي تحتوي على 3٪ سيستين (درجة الحموضة 7.4) على طبق بيتري أو في أنبوب 15 مل. يهيّج بلطف على شاكر لمدّة 12 دقيقة.
7. استخدام ماصة بلاستيكية لتفريق كتل والاستمرار في التحريض لمدة 2-3 دقيقة أخرى حتى تماما دي jellied.
8. إزالة السيستين عن طريق استبدال وسائل الإعلام مع مياه البحر العذبة لمدة 5X على الأقل.
9. احتفظ بالبيض المخصبة على طبق بيتري زجاجي عند درجة حرارة 16 درجة مئوية أو RT.

2. الاستئصال الجراحي للأنسجة الأبالمنة من جنين غازيولا

1. إعداد مخزن استخراج الحمض النووي يتكون من 10 مل تريس-حمض الهيدروكلوريك (درجة الحموضة 8)، 50 مل ككل، 1 MM EDTA، 0.3٪ توين20، 0.3٪ NP40، و 1 ملغ / مل بروتيناز ك. استخدام 20 مل من المخزن المؤقت استخراج لكل جنين. يُمزج جيداً عن طريق التَحَمِل ويُخلط العازل في أنابيب PCR.
2. إذابة 1٪ أغاروز في مياه البحر وصب في طبق بيتري لتغطية الجزء السفلي. تبرد على سطح المقعد لجعل سرير هلام. صب مياه البحر الطازجة لتغطية السرير هلام في طبق بيتري.
3. نقل 24 ساعة بعد الإخصاب (hpf) الأجنة (مرحلة مبكرة إلى منتصف gastrula) في طبق بيتري الذي يحتوي على سرير هلام أغاروز.
4. إدراج إبرة التنغستن في حامل إبرة وتعقيم عن طريق غمس طرف إبرة في الكحول (70٪ أو أعلى) ووضعها في اللهب لحرق الكحول.
5. تحت المجهر تشريح (في 20x إلى 40x التكبير)، واستخدام إبرة التنغستن لجعل الاكتئاب على سرير أجاروز عن طريق إزالة قطعة من الأجاروز السطحية حول حجم الجنين ليتم التلاعب بها، ووضع الجنين على الاكتئاب مع الجانبية الجانب التي تواجه أسفل من أجل تقييد حركة الجنين للجراحة الدقيقة.
6. استخدام إبرة التنغستن لاستئصال جراحيا قطعة من الأنسجة الأبوالية تقع قبالة فتح blastoporal عن طريق الفم. عادة ما يكون الأوفيرال من ثلث إلى ربع الأنسجة الجنينية على طول المحور الفموي - الأبوالي كافياً.
7. استخدم ماصة P20 لنقل الأنسجة الأبوالية المعزولة (بالداخل و2 مل) إلى أنبوب PCR يحتوي على 20 مل من المخزن المؤقت لاستخراج الحمض النووي.
8. نقل الجنين بعد الجراحة إلى بئر تحتوي على ما لا يقل عن 500 مل من مياه البحر العذبة في لوحة 24-أو 96 جيدا.
9. كرر الخطوات 2.4-2.8 لعدد الأجنة حسب الحاجة.
10. ضع لوحة البئر التي تحتوي على أجنة ما بعد الجراحة في حاضنة عند درجة حرارة 16 درجة مئوية أو RT حتى يتم الانتهاء من الكتابة الجينية.

3- استخراج الحمض النووي الجيني والنمط الجيني من الـ PCR

1. تدور لفترة وجيزة أسفل أنابيب PCR التي تحتوي على المخزن المؤقت لاستخراج الحمض النووي والأنسجة الجنينية المعزولة باستخدام جهاز طرد مركزي صغير (على سبيل المثال في 2680 × ز لمدة 10 ق).
2. لاستخراج الحمض النووي الجيني من الأجنة المفردة، احتضان أنابيب PCR في 55 درجة مئوية لمدة 3 ح. دوامة لمدة 30 s كل 30 دقيقة لضمان تفكك كتل الخلايا وتعزيز تحليل الخلايا.
3. احتضان أنابيب PCR في 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق لتعطيل proteinase K.
4. احتفظ بمستخلصات gDNA عند درجة حرارة 4 درجات مئوية أو على الجليد، ثم انتقل على الفور إلى PCR.
   ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتاً هنا عن طريق وضع مستخلصات gDNA في فريزر -20 درجة مئوية.
5. إعداد رد فعل PCR باستخدام gDNA المستخرجة كقالب لتضخيم موضع الفائدة الجينومية.
   1. إذا كانت الأليلات مختلفة في موضع الاهتمام تختلف في الحجم بحيث يمكن الكشف عن الفرق حجم من قبل الكهربائي هلام أغاروز، وتصميم مجموعة واحدة من التمهيديات لتضخيم المكان بأكمله.
   2. بدلا من ذلك، استخدم التمهيديات الخاصة بالأليل التي تولد منتجات PCR فقط في وجود أليل محددة؛ على سبيل المثال، من خلال تصميم التمهيدي الذي يربط إلى منطقة تحتوي على الطفرات الإدراج / الحذف.
   3. استخدام مزيج نموذجي من تفاعل PCR 20 مل على النحو التالي: 5 مل من مستخلصات gDNA، 8 مل من المياه الخالية من النوكليس، 4 مل من المخزن المؤقت PCR، 0.2 مل من 10 mM dNTPs، 0.6 مل من DMSO، 1 مل من 10 مل التمهيدي إلى الأمام، 1 مل من 10 مل التمهيدي العكسي ، و 0.2 مل من بوليميراز الحمض النووي (انظر جدولالمواد).
      ملاحظة: يمكن استخدام العديد من المواد التمهيدية في رد فعل PCR. على سبيل المثال، يمكن الجمع بين التمهيدي العالمي إلى الأمام واثنين من التمهيديات العكسية الخاصة بآليل، طالما تم تصميم التمهيديين العكسيين لتوليد منتجات PCR من أحجام متميزة بحيث يمكن أن يكون وجود / غياب الأليلات اثنين لا لبس فيه يحددها الكهربائي هلام (انظر قسم النتائج التمثيلية).
6. تشغيل الأوجاروز جل الكهربائي لتحديد حجم ووجود / غياب منتجات PCR. ضبط حالة الأوغاروس جل الكهربائي (على سبيل المثال، نسبة هلام أغاروز، V / سم، والمدة) اعتمادا على الحجم المتوقع من منتجات PCR.
7. استخدم نتائج PCR فيما يتعلق بحجم ووجود/غياب منتجات PCR لتعيين نمط جيني لكل جنين ما بعد الجراحة. على سبيل المثال، إذا كان من المتوقع أن تولد الأليلات المختلفة منتجات PCR من أحجام مختلفة، استخدم معلومات الحجم لتعيين النمط الجيني لكل جنين. وفي حالة استخدام المواد التمهيدية الخاصة بالأليل، ينبغي استخدام البيانات المتعلقة بوجود/عدم وجود منتجات الـ PCR لتعيين نمط جيني لكل جنين.
8. فرز الأجنة وفقا للنمط الجيني.

النتائج

جينوم نيماتوسلا لديه موضع واحد أن ترميز بروتين السلائف لGLWamide neuropeptide. وقد تم الإبلاغ عن ثلاثة أليليس متحولة بالضربة القاضية في هذا المكان(glw^-a,glw-b,وglw-c) سابقا⁵. أربعة ذكور heterozygous تحمل أليل البرية من نوع (+) وخروج المغلوب أليل GLW

Discussion

وصف هنا بروتوكول يستند إلى PCR إلى النمط الجيني لجنين النعمان البحر واحد دون التضحية الحيوان. بعد التفريخ وإزالة هلام، يسمح للبيض المخصبة أن تتطور إلى gastrulae. تتم إزالة المنطقة الأبالة لكل جنين غازيولا جراحيا، ويستخدم الأنسجة الأبوروفال المعزولة لاستخراج الحمض النووي الجيني اللاحقة، في حي?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Drosophila Peltier Refrigerated Incubator	Shellab	SRI6PF	Used for spawning induction
Instant ocean sea salt	Instant ocean	138510
Brine shrimp cysts	Aquatic Eco-Systems, Inc.	BS90
L-Cysteine Hydrochloride	Sigma Aldrich	C7352
Standard Orbital Shaker, Model 3500	VWR	89032-092
TRIS-HCl, 1M, pH8.0	QUALITY BIOLOGICAL	351-007-01
Potassium chloride	VWR	BDH9258
EDTA, 0.5M pH8	VWR	BDH7830-1
Tween 20	Sigma Aldrich	P9416
Nonidet-P40 Substitute	US Biological	N3500
Proteinase K solution (20 mg/mL), RNA grade	ThermoFisher	25530049
Agarose	VWR	710
Micro Dissecting needle holder	Roboz	RS-6060
Tungsten dissecting needle	Roboz	RS-6063
PCR Eppendorf Mastercycler Thermal Cyclers	Eppendorf	E6336000024
Phusion High-Fidelity DNA polymerase	New England BioLabs	M0530L
dNTP mix	New England BioLabs	N0447L
GLWamide universal forward primer			5’- CATGCGGAGACCAAGCGCAAGGC-3’
Reverse primer specific to glw-a			5’-CCAGATGCCTGGTGATAC-3’
Reverse primer specific to glw-c			5’- CGGCCGGCGCATATATAG-3’