JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نبرهن على ثقافة الخلايا الواحدة من البكتيريا داخل الحويصلات العملاقة (GVs). تم إعداد GVs التي تحتوي على الخلايا البكتيرية بواسطة طريقة نقل قطرات وتم تعطيلها على غشاء معتمد على الركيزة الزجاجية للمراقبة المباشرة للنمو البكتيري. وقد يكون هذا النهج أيضاقابلا للتكيف مع الخلايا الأخرى.

Abstract

قمنا بتطوير طريقة لزراعة الخلايا البكتيرية على مستوى الخلية الواحدة داخل الحويصلات العملاقة (GVs). ثقافة الخلايا البكتيرية مهمة لفهم وظيفة الخلايا البكتيرية في البيئة الطبيعية. بسبب التقدم التكنولوجي، يمكن الكشف عن وظائف الخلايا البكتيرية المختلفة على مستوى خلية واحدة داخل مساحة محصورة. GVs هي مقصورات كروية صغيرة الحجم تتكون من جزيئات الدهون أمفيليليك ويمكن أن تعقد مواد مختلفة، بما في ذلك الخلايا. في هذه الدراسة، تم تغليف خلية بكتيرية واحدة في 10-30 ميكرومتر GVs بواسطة طريقة نقل قطرات وGVs التي تحتوي على الخلايا البكتيرية تم تعطيلها على غشاء معتمد على الركيزة الزجاجية. طريقتنا مفيدة لمراقبة النمو في الوقت الحقيقي من البكتيريا واحدة داخل GVs. نحن المستزرعة الإشريكية القولونية (E.القولونية)الخلايا كنموذج داخل GVs، ولكن هذه الطريقة يمكن تكييفها لأنواع الخلايا الأخرى. يمكن استخدام أسلوبنا في المجالات العلمية والصناعية للميكروبيولوجيا، والبيولوجيا، والتكنولوجيا الحيوية، والبيولوجيا التركيبية.

Introduction

وقد حظيت ثقافة الخلايا البكتيرية على مستوى الخلية الواحدة باهتمام متزايد. زراعة الخلايا البكتيرية على مستوى الخلية الواحدة داخل مساحة محصورة يمكن أن توضحالوظائف البكتيرية مثل تقلب الفينوتيبيك 1،2،3،4،سلوك الخلية5، 6 , 7 , 8 , 9، ومقاومة المضادات الحيوية10،11. بسبب التطورات الأخيرة في تقنيات الثقافة، يمكن تحقيق ثقافة البكتيريا واحدة داخل مساحةمحصورة، كما هو الحال في رقاقة جيدة 4،7،8،هلام قطرات12،13 ، والمياه في النفط (W /O) قطرات 5،11. ولتعزيز فهم الخلايا البكتيرية الوحيدة أو استخدامها، يلزم إجراء المزيد من التطورات التقنية لتقنيات الزراعة.

الحويصلات التي تحاكي غشاء الخلية البيولوجية هي مقصورات كروية تتكون من جزيئات أمفيليليك ويمكن أن تعقد مواد مختلفة. وتصنف الحويصلات حسب الحجم وتشمل الحويصلات الصغيرة (SVs، القطر <؛ 100 نانومتر)، والحويصلات الكبيرة (LVs، <1 μm)، والحويصلات العملاقة (GVs، >1 ميكرومتر). وتستخدم عادة SVs أو LVs كناقلات المخدرات بسبب تقاربها مع غشاء الخلية البيولوجية14. وقد استخدمت أيضا GVs كنظام مفاعل لبناء protocells15 أو الخلايا الاصطناعية16. تم الإبلاغ عن تغليف الخلايا البيولوجية في GVs17،18،وبالتالي تظهر GVs إمكانات كنظام زراعة الخلايا عند دمجها مع نظام المفاعل.

هنا، جنبا إلى جنب مع شريط فيديو من الإجراءات التجريبية، ونحن نصف كيف يمكن استخدام GVs كسفن ثقافة الخلية رواية19. تم إجراء GVs التي تحتوي على البكتيريا من قبل طريقة نقل قطرات20 ثم تم تعطيلها على غشاء معتمد على زجاج الغلاف. استخدمنا هذا النظام لمراقبة النمو البكتيري على مستوى الخلية الواحدة داخل GVs في الوقت الحقيقي.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. إعداد GVs التي تحتوي على الخلايا البكتيرية بواسطة طريقة نقل قطرات

  1. إعداد حلول مخزون الدهون من 1-بالمتيل-2-أوليويل-سن-غليسيرو-3-فوسفوليكولين (POPC, 10 م، 1 مل) و 1،2-ديستيرويل-سن-غليسيرو-3-فوسفوإيثانولامين-ن-[بيوتينتيل(البولي ايثيلينغليكول)-2000] (البيوتين-PEG-DSPE، 0.1 مليون متر، 1 مل) في الكلوروفورم/ محلول الميثانول (2/1، v/v) وتخزين المخزون في -20 درجة مئوية.
  2. إعداد محلول زيتي يحتوي على الدهون
    1. صب 20 ميكرولتر من محلول POPC و 4 ميكرولتر من محلول البيوتين-PEG-DSPE في أنبوب زجاجي (الشكل1ب (ط)).
    2. تبخر المذيب العضوي عن طريق تدفق الهواء لتشكيل فيلم الدهون ووضع الفيلم في المجفف لمدة 1 ساعة لتبخر تماما المذيب العضوي (الشكل1ب (2)).
      ملاحظة: فمن الضروري لتبخر المذيبات العضوية في غطاء محرك الدخان.
    3. إضافة 200 ميكرولتر من الزيوت المعدنية (0.84 غرام/مل، جدولالمواد) إلى القارورة الزجاجية (الشكل1ب '3)).
    4. التفاف الجزء الافتتاحي من قارورة زجاجية مع فيلم وsonicate في حمام بالموجات فوق الصوتية (120 W) لمدة 1 ساعة على الأقل (الشكل1b (3)). التركيزات النهائية من POPC والبيوتين-PEG-DSPE هي 1 MM و 0.002 mM، على التوالي.
  3. ما قبل زراعة الخلايا البكتيرية
    1. تلقيح E. coli في 1X LB المتوسطة (1 غرام استخراج الخميرة، 2 غرام باكتو تريبتون، و 2 غرام كلوريد الصوديوم في 200 مل من الماء منزوع الأيونات) من لوحة LB وحضانة في 37 درجة مئوية لمدة 12-14 ساعة (بين عشية وضحاها).
    2. بعد الحضانة، وجمع 20 درجة مئوية من الحل الثقافي ونقل إلى 1.98 مل من الطازجة 1X LB المتوسطة، وثقافة الخلايا مرة أخرى لمدة 2 ساعة.
    3. تحقق من الكثافة البصرية في 600 نانومتر (OD600)قيمة الحل ما قبل الثقافة (أعدت في الخطوة 1.3.2). وينبغي استخدام حل ما قبل الثقافة لـOD 600 = 1.0-1.5.
  4. إعداد الحلول المائية الخارجية والداخلية للمركبات الكهربائية
    1. إذابة الجلوكوز في 1X LB المتوسطة لإعداد محلول مائي الخارجي من GVs. إعداد 20 مل من محلول الجلوكوز الأسهم (500 مل).
    2. تخفيف محلول الجلوكوز الأسهم مع 1X LB المتوسطةإلى 200 mM (الجدول 1).
    3. إذابة السكروز في 1X LB المتوسطة لإعداد محلول مائي داخلي من GVs. إعداد 20 مل من محلول السكروز الأسهم (500 مل).
    4. امزج محلول ما قبل الثقافة (OD600 = 1.0-1.5)، محلول السكروز (500 مليون متر)، و1x LB متوسطة(الجدول1). يجب أن تكون القيمة النهائية للمحلول الثقافي OD600 0.01-0.015 ويجب أن يكون تركيز السكروز النهائي 200 mM.
      ملاحظة: احرص على تجنب الضغط التناضحي. من الضروري تحقيق التوازن بين التركيز بين الحل المائي الداخلي والخارجي.
  5. إعداد قطرات الماء في الزيت (W/O) التي تحتوي على خلايا بكتيرية
    1. إضافة 2 ميكرولتر من محلول مائي داخلي من GVs (أعدت في الخطوة 1.4.4) إلى 50 ميكرولتر من محلول الزيت الذي يحتوي على الدهون (الزيوت المعدنية مع POPC والبيوتين-PEG-DSPE) في أنبوب بلاستيكي مغطى بـ 0.6 مل (الشكل1ب '4').
    2. استحلاب المكونين في الأنبوب البلاستيكي عن طريق النقر على الأنبوب باليد (الشكل1ب (v)).
  6. تشكيل GVs التي تحتوي على الخلايا البكتيرية
    1. إضافة 50 ميكرولتر من محلول مائي خارجي من المركبات المضادة للفيروسات القهقرية (أعدت في الخطوة 1.4.2) في أنبوب بلاستيكي مغطى بسعة 1.5 مل (الشكل1ب (6)) وطبقة بلطف 150 ميكرولتر من محلول الزيت الذي يحتوي على الدهون (الزيوت المعدنية مع POPC والبيوتين-PEG-DSPE) على سطح الأوج الخارجي (الشكل1 ب '7'). قم بحضانة هذه العينة في درجة حرارة الغرفة (RT، 25 درجة مئوية) لمدة 10-15 دقيقة تحقق للتأكد من أن واجهة النفط والحلول المائية مسطحة.
    2. إضافة 50 ميكرولتر من محلول قطرات W/O (المعد في الخطوة 1.5.2) على واجهة الزيت والمحلول المائي باستخدام ماصة (الشكل1ب '8)).
    3. طرد مركزي للأنبوب البلاستيكي ذو الغطاء بسعة 1.5 مل (من الخطوة 1.6.2) لمدة 10 دقائق عند 1600 × ز في RT في جهاز طرد مركزي مكتبي (الشكل1ب (9)). بعد الطرد المركزي، يستنشق الزيت (الطبقة العليا) من الأنبوب البلاستيكي ذو الغطاء 1.5 مل باستخدام ماصة، وجمع GVs التي تحتوي على خلايا بكتيرية (الشكل1ب (x)).

2. إعداد نظام مراقبة GV (نظام زراعة الخلايا البكتيرية)

  1. إعداد الحويصلات الصغيرة (SVs) للبناء ng a دعم غشاء ثنائي الطبقة
    1. صب 20 ميكرولتر من محلول POPC و 4 ميكرولتر من محلول البيوتين-PEG-DSPE في أنبوب زجاجي (باستخدام نفس تكوين الدهون المستخدمة لإعداد GV في الخطوة 1.1).
    2. تبخر المذيب العضوي عن طريق تدفق الهواء لتشكيل فيلم الدهون ووضع هذه العينة في المجفف لمدة 1 ساعة لتبخر المذيب العضوي تماما.
    3. إضافة 200 درجة مئوية من الجلوكوز 200 M في 1X LB المتوسطة (الحل المائي الخارجي من GVs) إلى القارورة الزجاجية.
    4. التفاف الجزء الافتتاحي من قارورة زجاجية مع فيلم وsonicate في حمام بالموجات فوق الصوتية (120 W) لمدة 1 ساعة على الأقل.
    5. إعداد SVs بواسطة طريقة البثق21 باستخدام مصغرة الطارد وغشاء البولي مع حجم المسام 100 نانومتر.
  2. إعداد غرفة مصنوعة يدويا
    1. حفر حفرة 7 مم مع لكمة جوفاء على ختم مزدوج الوجه (10 مم × 10 مم × 1 مم).
    2. لصق الختم ذو الوجهين مع ثقب على زجاج الغلاف (30 مم × 40 مم، سمك 0.25-0.35 مم).
  3. إعداد غشاء ثنائي الطبقة المدعومة على زجاج الغطاء في ثقب الغرفة
    1. إضافة 30 درجة مئوية من محلول SV إلى ثقب الغرفة (أعدت في القسم 2.2) وحضانة في RT لمدة 30 دقيقة.
    2. اغسل الحفرة برفق مرتين مع 20 ميكرولتر من 1x LB المتوسطة التي تحتوي على 200 مل الجلوكوز (الحل المائي الخارجي من GVs) عن طريق الأنابيب.
  4. تجميد العمل بالطائرات المتنقلة على دعم غشاء ثنائي الطبقة على الزجاج غطاء في حفرة من الغرفة
    1. إدخال 10 ميكرولتر من النيوترافيدين مع الحل المائي الخارجي من GVs (1 ملغ / مل) في الحفرة وحضانة في RT لمدة 15 دقيقة.
    2. اغسل الحفرة برفق مرتين مع 20 ميكرولتر من 1x LB المتوسطة التي تحتوي على 200 مل الجلوكوز (الحل المائي الخارجي من GVs) عن طريق الأنابيب.
    3. إضافة جميع الحلول التي تحتوي على GVs (أعدت في الخطوة 1.6.3) في حفرة الغرفة وختم مع غطاء الزجاج (18 مم × 18 ملم، سمك 0.13-0.17 مم) (الشكل2ب).
  5. المراقبة المجهرية لنمو الخلايا البكتيرية داخل GVs
    1. تعيين نظام مرحلة التدفئة المجهرية مع المجهر المقلوب مجهزة 40x/0.6 عدسة موضوعية فتحة رقمية (NA) مع مسافة عمل طويلة (الشكل2ب).
    2. وضع الغرفة على نظام مرحلة التدفئة المجهرية (الشكل2ب). احتضان GVs التي تحتوي على الخلايا البكتيرية في الغرفة في حالة ثابتة لمدة 6 ساعة عند 37 درجة مئوية.
    3. التقاط وتسجيل صور المجهر لنمو الخلايا البكتيرية داخل GVs كل 30 دقيقة باستخدام أشباه الموصلات أكسيد المعادن التكميلية العلمية (sCMOS) الكاميرا.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

نقدم طريقة بسيطة لتوليد GVs تحتوي على خلايا بكتيريةواحدة باستخدام طريقة نقل قطرات (الشكل 1). ويبين الشكل 1أ صورة تخطيطية لهطول الأمطار من المركبات الكهربائية التي تحتوي على بكتيريا. يتم نقل قطرات W /O التي تحتوي على البكتيريا عبر واجهة المياه ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

هنا، ونحن نصف طريقة لزراعة الخلايا البكتيرية على مستوى خلية واحدة داخل GVs. تتضمن هذه الطريقة البسيطة تشكيل GVs التي تحتوي على خلايا بكتيرية على مستوى الخلية الواحدة باستخدام طريقة نقل قطرات. بالمقارنة مع النهج الأخرى للحصول على GVs التي تحتوي على الخلايا البكتيرية، ولهذه الطريقة ميزتين: '1' م?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

وقد تم دعم هذا العمل من خلال مبادرة رائدة للباحثين الشباب الممتازين (LEADER، رقم 16812285) من وزارة التعليم والثقافة والرياضة والعلوم والتكنولوجيا (MEXT) في اليابان، وهي منحة مساعدة للبحوث العلمية الشابة (رقم 18K18157، 16K21034) من الجمعية اليابانية لتعزيز العلوم (JSPS) إلى M.M.، والمنحة في المعونة من MEXT إلى K.K. (رقم 17H06417، 17H06413).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
BactotryptoneBD Biosciences211705
ChloroformWako Pure Chemicals032-21921
Cover glass (18 × 18 mm)Matsunami Glass Ind.C018181thickness 0.13–0.17 mm
Cover glass (30 × 40 mm)Matsunami Glass Ind.custom-orderthickness 0.25–0.35 mm
Desktop centrifugeHi-Tech Co.ATT101swing rotor type
Double-faced seal (10 × 10 × 1 mm)NitomsT4613
Glass vialAS ONE6-306-01Durham fermentation tube
GlucoseWako Pure Chemicals049-31165
Inverted microscopeOlympusIX-73
MethanolWako Pure Chemicals133-16771
Microscopic heating stage systemTOKAI HITTP-110R-100
Mineral oilNacalai Tesque23334-85
Mini-extruderAvanti Polar Lipids610000
NeutravidinThermo Fisher Scientific31000
Objective lensOlympusLUCPLFLN 40×/0.6 NA
Polycarbonate membranesAvanti Polar Lipids610005pore size 100 nm
sCMOS cameraAndorZyla 4.2 plus
Sodium chlorideWako Pure Chemicals191-01665
SucroseWako Pure Chemicals196-00015
Ultrasonic bathAS ONEASU-3D
Yeast extractBD Biosciences212750
0.6 mL lidded plastic tubeWatson130-806C
1.5 mL lidded plastic tubeSumitomo Bakelite Co.MS4265-M
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocolineAvanti Polar Lipids850457PPOPC
1,2-distearoyl-snglycero-3-phosphoethanolamine-N-[biotinyl(polyethyleneglycol)-2000]Avanti Polar Lipids880129PBiotin-PEG-DSPE

References

  1. Ozbudak, E. M., Thattai, M., Kurtser, I., Grossman, A. D., van Oudenaarden, A. Regulation of noise in the expression of a single gene. Nature Genetics. 31, 69-73 (2002).
  2. Rosenfeld, N., Young, J. W., Alon, U., Swain, P. S., Elowitz, M. B. Gene regulation at the single-cell level. Science. 307, 1962-1965 (2005).
  3. Eldar, A., Elowitz, M. B. Functional roles for noise in genetic circuits. Nature. 467, 167-173 (2010).
  4. Hashimoto, M., et al. Noise-driven growth rate gain in clonal cellular populations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3251-3256 (2016).
  5. Boedicker, J. Q., Vincent, M. E., Ismagilov, R. F. Microfluidic confinement of single cells of bacteria in small volumes initiates high-density behavior of quorum sensing and growth and reveals its variability. Angewandte Chemie International Edition. 48, 5908-5911 (2009).
  6. Christopher, M., Waters, B. L. B. Quorum sensing: cell-to-cell communication in bacteria. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 21, 319-346 (2005).
  7. Inoue, I., Wakamoto, Y., Moriguchi, H., Okano, K., Yasuda, K. On-chip culture system for observation of isolated individual cells. Lab on a Chip. 1, 50-55 (2001).
  8. Wang, P., et al. Robust growth of Escherichia coli. Current Biology. 20, 1099-1103 (2010).
  9. Reshes, G., Vanounou, S., Fishov, I., Feingold, M. Cell shape dynamics in Escherichia coli. Biophysical Journal. 94, 251-264 (2008).
  10. Balaban, N. Q., Merrin, J., Chait, R., Kowalik, L., Leibler, S. Bacterial Persistence as a Phenotypic Switch. Science. 305, 1622-1625 (2004).
  11. Brouzes, E., et al. Droplet microfluidic technology for single-cell high-throughput screening. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (34), 14195-14200 (2009).
  12. Zengler, K., et al. Cultivating the uncultured. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (24), 15681-15686 (2002).
  13. Eun, Y., Utada, A. S., Copeland, M. F., Takeuchi, S., Weibel, D. B. Encapsulating bacteria in agarose microparticles using microfluidics for high-throughput cell analysis and isolation. ACS Chemical Biology. 6, 260-266 (2011).
  14. Allen, T. M., Cullis, P. R. Liposomal drug delivery systems: From concept to clinical applications. Advanced Drug Delivery Reviews. 65, 36-48 (2013).
  15. Szostak, J. W., Bartel, D. P., Luisi, P. L. Synthesizing life. Nature. 409, 387-390 (2001).
  16. Noireaux, V., Libchaber, A. A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (51), 17669-17674 (2004).
  17. Tan, Y. C., Hettiarachchi, K., Siu, M., Pan, Y. R., Lee, A. P. Controlled microfluidic encapsulation of cells, proteins, and microbeads in lipid vesicles. Journal of the American Chemical Society. 128 (17), 5656-5658 (2006).
  18. Chowdhuri, S., Cole, C. M., Devaraj, N. K. Encapsulation of Living Cells within Giant Phospholipid Liposomes Formed by the Inverse-Emulsion Technique. ChemBioChem. 17, 886-889 (2016).
  19. Morita, M., Katoh, K., Noda, N. Direct observation of bacterial growth in giant unilamellar vesicles: a novel tool for bacterial cultures. ChemistryOpen. 7, 845-849 (2018).
  20. Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Production of Unilamellar Vesicles Using an Inverted Emulsion. Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).
  21. Hope, M. J., Bally, M. B., Webb, G., Cullis, P. R. Production of large unilamellar vesicles by a rapid extrusion procedure. Characterization of size distribution, trapped volume and ability to maintain a membrane potential. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 812, 55-65 (1985).
  22. Tsumoto, K., Matsuo, H., Tomita, M., Yoshimura, T. Efficient formation of giant liposomes through the gentle hydration of phosphatidylcholine films doped with sugar. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 68, 98-105 (2009).
  23. Li, A., Pazzi, J., Xu, M., Subramaniam, A. B. Cellulose abetted assembly and temporally decoupled loading of cargo into vesicles synthesized from functionally diverse lamellar phase forming amphiphiles. Biomacromolecules. 19, 849-859 (2018).
  24. Weinberger, A., et al. Gel-assisted formation of giant unilamellar vesicles. Biophysical Journal. 105, 154-164 (2013).
  25. Kurokawa, C., et al. DNA cytoskeleton for stabilizing artificial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (28), 7228-7233 (2017).
  26. Nourian, Z., Roelofsen, W., Danelon, C. Triggered gene expression in fed-vesicle microreactors with a multifunctional membrane. Angewandte Chemie International Edition. 51, 3114-3118 (2012).
  27. Dezi, M., Di Cicco, A., Bassereau, P., Levy, D. Detergent-mediated incorporation of transmembrane proteins in giant unilamellar vesicles with controlled physiological contents. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (18), 7276-7281 (2013).
  28. Trantidou, T., Dekker, L., Polizzi, K., Ces, O., Elani, Y. Functionalizing cell-mimetic giant vesicles with encapsulated bacterial biosensors. Interface Focus. 8, 20180024(2018).
  29. Elani, Y., et al. Constructing vesicle-based artificial cells with embedded living cells as organelle-like modules. Scientific Reports. 8, 4564(2018).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

146

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved