نموذج أرنب من مرض العين الجاف المُقوّل المُسبّب بواسطة Concanavalin حقنة في الغدد اللارِسية: تطبيق على دراسات فعالية الدواء

Summary

تصف هذه المقالة تطوير طريقة للحث على مرض العين الجاف الحاد أو المزمن في الأرانب عن طريق حقن concanavalin A إلى جميع أجزاء نظام الغدة الدمعية المدارية. هذه الطريقة، متفوقة على تلك التي ذكرت بالفعل، يولد نموذج استنساخها، مستقرة من العين الجافة مناسبة لدراسة العوامل الدوائية.

Abstract

مرض العين الجاف (DED)، وهو مرض التهابي متعدد العوامل من سطح العين، يصيب 1 من كل 6 بشر في جميع أنحاء العالم مع آثار مذهلة على نوعية الحياة وتكاليف الرعاية الصحية. إن عدم وجود نماذج للحيوانات الإعلامية التي تُلخص ملامحها الرئيسية يعوق البحث عن عوامل علاجية جديدة لوزارة الصحة والديمقراطية. نماذج الحيوانات DED المتاحة محدودة الاستنساخ والفعالية. يتم تقديم نموذج هنا يتم فيه حث DED عن طريق حقن الكونكونافالين ميتوجين A (Con A) في الغدد المحيطية المدارية للأرانب. الجوانب المبتكرة لهذا النموذج هي استخدام الموجات فوق الصوتية (الولايات المتحدة) التوجيه لضمان الحقن الأمثل واستنساخها من كون A في الغدة الدمعية السفلي; حقن Con A في جميع الغدد الدمعية المدارية التي تحد من الإنتاج التعويضي للدموع؛ واستخدام تكرار الحقن الدوري من كون أ التي تطيل حالة DED في الإرادة. يتم رصد DED واستجابتها لعوامل الاختبار مع لوحة من المعلمات التي تقيّم إنتاج المسيل للدموع ، واستقرار الفيلم المسيل للدموع ، وحالة الغشاء المخاطي للقرنية والملتحمة. وهي تشمل الأوسولاريتي المسيل للدموع، المسيل للدموع تفكك الوقت، اختبار المسيل للدموع شيرمر، ارتفع تلطيخ البنغال، ومستويات الكتوفيرين المسيل للدموع. ويرد وصف تفصيلي لتحريض دائرة المؤشرات على المؤشرات ورصد بارامتراتها. هذا النموذج بسيط وقوي وقابل للاستنساخ وغني بالمعلومات. هذا النموذج الحيواني مناسب لدراسة فسيولوجيا التمزق والفيزيولوجيا المرضية لـ DED وكذلك لتقييم فعالية وسلامة العوامل المرشحة لعلاج DED.

Introduction

مرض جفاف العين (DED) هو حالة مزمنة مع ارتفاع معدل الانتشار والمراضة^1،2،^3،4. التهاب يلعب دورا رئيسيا في الإمراض^5،6. وتصور الفيزيولوجيا المرضية للإدارة على أنها مستمدة إما من نقص الإنتاج أو الإفراط في تبخر الدموع؛ ومن المعروف أيضا السابق كما مائي ناقص DED⁷. متلازمة Sjögren، وهو سبب نموذجي درس على نطاق واسع من DED، ويؤثر في المقام الأول على الغدد الدمعية (LGs) وهو مثال صارخ على أهميتها في مسببات الأمراض من DED. غالباً ما يتم التعامل مع DED بالدموع الاصطناعية التي توفر الإغاثة المؤقتة، أو مع السيكلوسبورين أو lifitegrast، وكلاهما قمع التهاب العين. لا شيء من العلاجات المتاحة لDED هي الأمثل، مما يتطلب تطوير وكلاء جديدة^8،9.

ويعوق البحث عن عوامل علاجية جديدة لوزارة التنمية الدولية ثلاثة تحديات رئيسية هي: عدم وجود هدف جزيئي معترف به للعقاقير، وهو ما قد يكون بعيد المنال بالنظر إلى التعقيد الفيزيولوجي للإدارة؛ والافتقار إلى الموارد الطبيعية؛ والافتقار إلى الموارد الطبيعية؛ والافتقار إلى الموارد الطبيعية؛ والافتقار إلى الموارد الطبيعية؛ والافتقار إلى الموارد الطبيعية؛ والافتقار إلى الموارد الطبيعية؛ والافتقار إلى الموارد الطبيعية؛ والافتقار إلى الموارد. الرّازة بين العوامل الواعدة؛ وعدم وجود نماذج الحيوانات التي تلخيص السمات الرئيسية للDED.

وكما هو الحال مع معظم جهود تطوير الأدوية، فإن النماذج الحيوانية الإعلامية لـ DED هي أداة تحقيق حاسمة، على الرغم من البيان البديهي بأنه لا يوجد نموذج للحيوانات يُلخص مرضًا بشريًا تمامًا. الماوس والجرذ والأرنب نماذج من DED هي الأكثر استخداما في حين تستخدم الكلاب والرئيسيات نادرا^10،11. معظم أكثر من 12 أرنب DED نماذج ذكرت حتى الآن محاولة للحد من إنتاج المسيل للدموع إما عن طريق إزالة LGs أو عن طريق عرقلة وظيفتها^{12،13،14،15،16.} وتشمل هذه النُهج الاستئصال الجراحي للوحدة الدولية للأطباء؛ واستئصال الاستئصال الجراحي للوحدة؛ واستئصال الـ ILG؛ واستئصال الـ ILG؛ و إغلاق القناة الإفرازية؛ وإضعاف وظيفة إل جي عن طريق التشعيع أو حقن أحد الخلايا الليمفاوية المنشطة ، mitogens ، توكسين البوتولينوم ، الأتروبين ، أو البنزالكلونيوم. القيود الرئيسية لهذه الأساليب هي عدم اتساقها والقمع الجزئي المتكرر للإنتاج المسيل للدموع.

Concanavalin A (Con A) ، وهو ليكتين من أصل نباتي ، هو مجموعة فرعية محفزة قوية للخلايا التتي وتم استخدامه في النماذج التجريبية لالتهاب الكبد¹⁷ وDED^18. وذُكر أن النموذج الأصلي القائم على كون ألف يوفر مزايا هامة، بما في ذلك بساطته النسبية؛ تدفق الخلايا الالتهابية في LGs ، يحاكي أمراضًا مثل Sjogren ؛ تحفيز السيتوكينات البرواتية IL-1α, IL-8, و TGF-α1; انخفاض وظيفة المسيل للدموع رصدها عن طريق قياس إزالة الفلورسين المسيل للدموع وتمزق وقت التفكك (TBUT)؛ واستجابة الدواء هو مبين لكورتيكوستيرويد مضاد للالتهابات.

وعندما طُبقت هذه الطريقة الواعدة، بالإضافة إلى مزاياها، تم تحديد أوجه القصور التي استلزمت تنقيحها العام وإدخال تحسينات جذرية عليها. تم توثيق ثلاثة أوجه قصور حرجة في الطريقة. أولاً، كان النموذج حاداً؛ فأولاً، كان النموذج نموذجياً. وDED المستحثة هدأت بعد حوالي 1 أسبوع. ثانياً، كانت استجابة الحيوانات غير متسقة. كما هو موضح، في الحقن عبر الجلد "العمياء" إلى LG السفلي (ILG)، تم تسليم Con A بشكل عشوائي فقط إلى الغدة المستهدفة. كشفت دراسة مفصلة لتشريح ILG أن حجمه يمكن أن يختلف بقدر 4 أضعاف¹⁹ مما يجعل مثل هذه الحقن "ضرب أو تفوت" الجهود. وأخيراً، حتى عندما تم حقن ILG، فإن LG المتفوقة (SLG) كثيراً ما تعوض عن انخفاض تدفق التمزق، مما يجعل النموذج إشكالياً.

تم التغلب على هذه القيود الرئيسية من خلال إدخال ثلاثة تعديلات على الطريقة ، وتوليد نموذج الحيوان متفوقة من DED. أولاً، تم إجراء حقن Con A في ILG تحت توجيه الموجات فوق الصوتية (الولايات المتحدة) ، مما يضمن دخول Con A إلى الغدة. تم تأكيد نجاح الحقن من خلال الحصول على صورة أمريكية بعد الحقن ، كما هو موضح في الشكل 1. ثانياً، لإزالة مساهمة تمزق تعويضي من SLG، تم حقن كل من الأجزاء الباليبرال والمدارية من هذه الغدة مع Con A. وأخيرا، تم تحويل هذا النموذج الحاد من DED إلى واحد مزمن عن طريق الحقن المتكررة من كون A كل 7-10 أيام. وتتحقق بسهولة في هذه الأرانب DED من 2 أشهر مدة. وقد تم توثيق نجاح هذا النهج بشكل واف^19.

كما سبق ذكره ، وتطبيق مهم من النماذج الحيوانية من إدارة الشؤون الديمقراطية هو تحديد فعالية وسلامة العوامل العلاجية المرشحة. وقد تجلت فائدة هذا النموذج من خلال دراسة فوسفوسولنداك (OXT-328)، وهو جزيء صغير مضاد للالتهابات رواية^20،21 تدار كقطرات العين. وقد تم إثبات فعاليته ابناء على لوحة من المعلمات من DED¹⁹. البساطة النسبية والطبيعة الإعلامية لهذا النموذج سمحت أيضا مقارنة جنبا إلى جنب من فوسفوسولنداك إلى اثنين من الأدوية المعتمدة لادارة الاغذية والعقاقير DED, السيكلوسبورين وlifitegrast, مما يدل على تفوقها قوية قبل السريرية.

Protocol

تمت الموافقة على جميع الدراسات الحيوانية من قبل مجلس المراجعة المؤسسية لجامعة ستوني بروك وأجريت وفقًا لبيان ARVO لاستخدام الحيوانات في أبحاث العيون والرؤية.

1- الحيوانات والمساكن

1. الحصول على نيوزيلندا الأبيض (NZW) الأرانب وزنها 2-3 كجم.
2. منزل الأرانب بشكل مُحدّد في أقفاص ذات درجة حرارة صارمة (65 ± 5 درجة فهرنهايت) والرطوبة (45 ± 5%) التحكم. يجب أن يكون للإضاءة دورة 12 ساعة على / إيقاف التشغيل.
3. توفير وصول غير محدود إلى الماء وحساء الأرانب القياسي. القضاء على التخصيبات الغذائية لأنها قد تحتوي على فيتامين (أ) الذي يؤثر على العين.
4. تأقلم الحيوانات لمدة أسبوعين على الأقل قبل التدابير الأساسية أو تحريض العين الجافة.

2. طرق التخدير والقتل الرحيم

ملاحظة: تتطلب جميع الإجراءات التخدير المعتدل باستثناء حقن Con A الذي يتطلب التخدير المعتدل.

1. للتسيد الخفيف، حقن الاسبرومازين (1 ملغ/كغ) تحت الجلد على الكتفين باستخدام إبرة قياس 26. نقطة النهاية للتسيد المعتدل: تحافظ الحيوانات على وضعية رأس مريحة مع فصوص الأذن التي لم تعد تستقيم تمامًا.
   ملاحظة: إذا لم يتم الوصول إلى نقطة النهاية المناسبة، قد يتم إعطاء حقنة إضافية من الآسيرومازين. يجب أن تبقى الحيوانات مستيقظة دائمًا ، وتستجيب للمس شعيراتها ، ولا تظهر أبدًا بطء ًا في التنفس.
2. للالتخدير المعتدل، أولا إعطاء الحيوانات acepromazine على النحو الوارد أعلاه. بعد الوصول إلى نقطة النهاية (انظر الملاحظة أعلاه) ، أعط isoflurane باستخدام قناع الغاز مع تدفق O₂ المحدد في 1 L / min والتسليم isoflurane تعيين إلى 5 ٪(الشكل 2).
3. إدارة isoflurane حتى نغمة الجسم الأرنب هو استرخاء تماما وآذان مرنة تماما.
   ملاحظة: لا ينبغي أن تحدث حركات العضلات التعويضية عندما يتم تشغيل الحيوان على جانبه; التنفس يبقى دائما عفوية.
4. يحدث الانتعاش التلقائي في غضون 2-5 دقيقة: وتشمل علامات حركات الرأس التلقائية وزيادة أو لهجة العضلات العادية. بعد الانتهاء من الإجراء التجريبي مع التخدير المعتدل ، لاحظ الأرانب لمدة 30 دقيقة أو حتى يعود سلوكهم إلى طبيعته.
   ملاحظة: مرهم العيون غير مطلوب أثناء أي شكل من أشكال التمسيد. 1) في التّهسيد المعتدل، الحيوانات لا تزال يقظة وتحافظ على ردفعل وميض. في التخدير المعتدل ، يكون تثبيط منعكس الوميض قصيرًا جدًا لدرجة أن سطح العين ليس في خطر. 2) وضع مرهم العيون على سطح العين يمنع تصور الهياكل التي تم تقييمها أثناء الاختبار.
5. القتل الرحيم: استخدم جرعة زائدة من البنتوباربيتال الوريدي (100 ملغم/كغ).

3. إزالة غشاء nictitating

1. قم بإجراء الإزالة خلال فترة التأقلم (عادة في الأسبوع الأول) للسماح بإجراء تقييم كامل ودقيق للقرنية.
2. الحقن إلى الغشاء النطّاب الأيمن
   ملاحظة: إذا كان الغشاء nictitating من كلتا العينين هو أن تتم إزالتها، فمن أبسط للقيام بذلك في جلسة واحدة. تبدأ بعين واحدة والمضي قدما على النحو المبين. لوضوح الوصف، تبدأ هذه الطريقة بالعين اليمنى.
   1. وضع الأرنب في كيس تقييد الحجم المناسب.
   2. حث التسيد الخفيف كما هو موضح في الخطوة 2.1.
   3. تطبيق 25 ميكرولتر من الليدوكائين الخالية من المواد الحافظة على العين اليمنى باستخدام ميكروبيبيت.
   4. ضع منظار ًا مرنًا لغطاء الأسلاك بين الجفون.
   5. باستخدام 0.3 ملقط (أو ما يعادلها)، فهم الغشاء nictitating في ذروته امتدت على القرنية.
   6. حقن الليدوكائين 1٪ مع 1:100،000 الادرينالين subconjunctivally في قاعدة غشاء nictitating باستخدام إبرة حادة 26-قياس(الشكل 3A). يجب أن تتشكل البلب المعتدلة على الغشاء الأنسي.
   7. إزالة المنظار.
3. إجراء حقن متطابقة إلى الغشاء النطّاب الأيسر.
4. قطع الغشاء الأنطسي
   1. بعد حوالي 5 دقيقة، ضع منظار الغطاء مرة أخرى في العين اليمنى. فهم والتراجع عن الغشاء nictitating في ذروته باستخدام 0.3 ملقط (أو ما شابه ذلك).
   2. قطع غشاء nictitating قبالة في قاعدتها باستخدام مقص Westcott أو ما يعادلها(الشكل 3B).
      ملاحظة: النزيف هو الحد الأدنى ولا يتطلب عادة الكي. ومع ذلك، يتم الاحتفاظ دائماً بالكي البطارية عالية الحرارة في مكان قريب في حالة الحاجة إلى hemostasis إضافية.
   3. إزالة المنظار.
   4. ضع مرهم المضادات الحيوية الموضعية على العين (على سبيل المثال، النيوميسين، البوليميشين، الباكتراسين، والهيدروكورتيزون).
5. اترك الغدة الصلبة سليمة. وينظر في بعض الأحيان الغدة الصلبة عندما يتم سحب الغشاء nictitating.
   ملاحظة: إذا شوهدت كتلة بيضاء كبيرة أو ارتفاع الأنسجة في منطقة الأنف أو منطقة الملتحمة الأعلى بعد إزالة الغشاء النطاق ، تم استئصال الغشاء قريبًا جدًا من قاعدته مما يسمح للغدة الصلبة بالانقضاء تلقائيًا. لمنع هذا في الإجراءات اللاحقة، وترك أكثر من الغشاء nictitating في القاعدة.
6. السماح للسطح العين للشفاء لمدة أسبوع واحد على الأقل قبل إجراء مزيد من التلاعب أو إجراء عمليات اختبار سطح العين.

4. قياس معلمات العين الجافة وجمع عينات المسيل للدموع

ملاحظة: قياس معلمات DED استنادًا إلى احتياجات بروتوكول الدراسة (على سبيل المثال، عند خط الأساس والنقاط الزمنية المحددة بعد ذلك). وينبغي إجراء قياسات لـ DED بالترتيب التالي، مع بذل جهود صارمة لتكرارها بأمانة في كل مرة. اختبار جميع الحيوانات في نفس الوقت تقريبا من اليوم (± 1 ح) للحد من الاختلافات circadian. وعادة ما تتطلب هذه القياسات فريقا من اثنين من المحققين.

1. ضع الأرنب في كيس تقييد. حث السّيب ةخفيفة.
2. المسيل للدموع Osmolarity²²
   1. وميض الجفون يدويا 5-10 مرات لتوزيع طبقة المسيل للدموع بالتساوي على سطح العين.
   2. اسحب الغطاء السفلي برفق.
   3. عينة الدموع مع مقياس الأوسموت TearLab عند تقاطع الملتحمة palpebral وbulbar على طول fornix السفلي، فقط الخلفي إلى قاعدة الغشاء nictitating مبتورة.
   4. قياس osmolarity باستخدام TearLab اختبار Osmolarity بعد تعليمات الشركة المصنعة.
3. تمزق وقت التفكك (TBUT)
   1. تعتيم الغرفة لهذا الاسبلي.
   2. ضع منظار غطاء الأسلاك بين الجفون.
   3. تطبيق انخفاض 50 ميكرولتر من 0.2٪ الفلورسين على سطح القرنية باستخدام ميكروبيبيت. إذا لم يتم الحصول على توزيع الفلورسين على القرنية مع أول قطرة ، ضع قطرة ثانية.
   4. بدء تشغيل جهاز توقيت على الفور.
   5. مراقبة فيلم المسيل للدموع ما قبل القرنية تحت ضوء أزرق. يتم تعريف TBUT على أنه الوقت الذي تم اتخاذه لتطوير النقاط السوداء أو الخطوط أو التعطيل الواضح لفيلم الفلورسين(الشكل 4). إذا لزم الأمر، استخدم اللوبس الجراحية التي توفر التكبير +1.50 لتصور أفضل العلامات المبكرة للتفكك. رصد لمدة تصل إلى 1 دقيقة؛ إذا تفكك كما هو محدد هنا يحدث بعد 1 دقيقة، سجل TBUT ل60 ثانية فقط.
4. اختبار المسيل للدموع شيرمر (STT)
   1. تطبيق قطرة 25 ميكرولتر من الليدوكائين الخالية من المواد الحافظة على سطح العين.
   2. ضع رمح جراحة الخلية Weck في الوريد السفلي لامتصاص الليدوكائين المتبقية وأي سائل المسيل للدموع. إذا لزم الأمر ، استخدم الجفن السفلي لتغطية الطرف القريب من الإسفنج للمساعدة في الحفاظ عليه في مكانه(الشكل 5A).
   3. بعد ما يقرب من 30 s، وإزالة الإسفنج ويك.
   4. أدخل على الفور شريط اختبار المسيل للدموع شيرمر في المسافة بين القرنية والملتحمة palpebral في منتصف الغطاء السفلي.
   5. بدء على الفور جهاز توقيت(الشكل 5B).
   6. بعد 5 دقيقة، وقياس طول الجزء الرطب من الشريط؛ هذه هي قيمة STT.
   7. تنفيذ التدابير في ثلاثة توائم والإبلاغ عن متوسط القراءات 3 كقيمة STT.
5. جمع عينات المسيل للدموع
   1. لجمع عينات المسيل للدموع لمستويات العينات من تحليل مختلف في نفوسهم مثل اللاكتوفيرين، بعد أن يتم تسجيل قيمة STT في 5 دقيقة، وترك الشريط في مكان حتى يتم الحصول على التبول من 20 ملم على الأقل.
      ملاحظة: إذا لم يحدث الترطيب الكافي بعد أن تم حث DED، تقدم الشريط أعمق في fornix السفلي للمساعدة في الوصول إلى نقطة النهاية هذه في وقت معقول.
   2. قطع الشريط الرطب ووضع هافورا في 490 ميكرولتر من المبردة المسيل للدموع جمع العازلة (4٪ BSA، 1M NaCl، 0.1٪ Tween-20 في PBS مع كوكتيل مثبط البروتينات).
   3. احتفظ بالعينات على الجليد حتى يمكن تخزينها عند -80 درجة مئوية، حيث يجب أن تبقى حتى يتم فحصها.
6. روز البنغال تلطيخ (RBS)
   1. تطبيق 50 ميكرولتر من 1٪ الليدوكائين الخالية من المواد الحافظة على القرنية باستخدام ميكرو ماصة.
   2. بعد 30 s، مكان 25 ميكرولتر من 1٪ ارتفع البنغال على سطح العين وتومض يدويا الجفن لتوزيعها بالتساوي.
   3. بدء تشغيل جهاز توقيت على الفور.
   4. في 3.5 دقيقة، ضع منظار غطاء الأسلاك بين الأغطية.
   5. في 4.0 دقيقة، وتصوير سطح الملتحمة والقرنية متفوقة(الشكل 6).
      ملاحظة: ضبط لنوع الكاميرا المستخدمة. الإعدادات النموذجية: كاميرا رقمية أحادية العدسة منعكسة، ووضع أولوية الفتحة (فتحة 13 أو أكبر)، وعدسة الماكرو ISO 6000، وعدسة الماكرو مقاس 100 مم مرفقة بأنبوبي تمديد 12.5 مم، ووضع التركيز اليدوي، والعدسة عند التكبير الأقصى، والإضاءة من مجموعة فلاش الماكرو/الحلقة إلى وضع تلقائي مع وضع العدسة. يتم تشغيل مصباح التركيز في وميض الحلقة للمساعدة في التركيز على القرنية.
   6. استكمال جميع الصور لكلا العينين في غضون 1 دقيقة.
7. تسجيل تلطيخ سطح العين باستخدام طريقة NEI²³ المعدلة على النحو التالي. لا الصف 6 مناطق الملتحمة منفصلة. يسجل الملتحمة متفوقة من كل عين. هذا هو الجزء من سطح الملتحمة تصويرها بسهولة دون التلاعب في الكرة الأرضية. التلاعب يمكن أن يغير في الواقع تلطيخ سطح العين.
8. مستويات اللاكتوفيرين المسيل للدموع هي مقياس بديل لإنتاج المسيل للدموع من الغدد الدمعية. أساي المسيل للدموع lactoferrin في الدموع التي تم جمعها على النحو الوارد أعلاه باستخدام اختبار المناعة الإنزيم ية²⁴ مجموعة بعد تعليمات الشركة المصنعة.

5. تحريض وعلاج جفاف العين

ملاحظة: يتم حقن ثلاثة أجزاء من نظام الغدة الدمعية المدارية.

1. تخدير الأرانب مع acepromazine 0.2 ملغ / كجم تحت الجلد.
2. قص قبالة الفراء في منطقة periorbital وفروة الرأس وإزالة تماما أي الفراء المتبقية باستخدام نير. ترك الجلد على نحو سلس تماما لتحسين التصور من السمات التشريحية وحقن الولايات المتحدة الموجهة من concanavalin A(الشكل 7).
3. حث التخدير المعتدل كما هو موضح أعلاه.
4. حقن الجزء الحاب من الغدة الدمعية العليا (PSLG)
   ملاحظة: تنفيذ حقن PSLG أولاً.
   1. تنطبق على العين المناسبة 25 ميكرولتر من الليدوكائين الخالية من المواد الحافظة 1٪ مع ميكروبيبيت.
   2. إيفرت الجفن العلوي وتطبيق الضغط الميديا لطيف على الحافة المدارية الخلفية حتى ينظر إلى protuberance بمناسبة الجزء palpebral من الغدة. يظهر PSLG كارتفاع لمبة صغيرة في الجزء الخلفي (الزمني) من الغطاء العلوي.
      ملاحظة: لعرض أنسجة الغدة أثناء عملية التعلم، وتطبيق 5٪ الفلورسين إلى المنطقة(الشكل 8A). ويمكن رؤية الدموع يتدفقون من PSLG لمبة. تطبيق الفلورسين ليست هناك حاجة لإدارة كون A; ويتم ذلك فقط لأغراض التوضيح لإظهار أنسجة الغدة.
   3. باستخدام ملقط دقيق مسنن وإبرة 27 قياس على حقنة درنة، تخترق مباشرة الغدة باستخدام نهج الملتحمة. تقدم الإبرة 2 ملم في الأنسجة وحقن 500 ميكروغرام من كون A في حجم 0.1 مل(الشكل 8B).
      ملاحظة: يمكن أن تكون هذه الحقنة مؤلمة في بعض الأحيان. إذا لزم الأمر، والحفاظ على الحيوانات تحت isoflurane حتى يتم الانتهاء من هذا الحقن.
5. حقن الغدة الدمعية المدارية المتفوقة (OSLG)
   ملاحظة: OSLG يتبع في تعاقب سريع.
   1. تطبيق الضغط الميديا على الكرة الأرضية مما تسبب في OSLG تبرز من incisure الخلفي (انظر المرجع²⁵ للتشريح، إذا لزم الأمر). تطبيق الضغط الميديا على العالم(الشكل 9، السهم الأحمر)مع protuberance من OSLG من incisure الخلفي. يعمل protuberance كتوطين إجمالي للعثور على الـ incisure الخلفي.
   2. استخدام ملقط منحني مع نصائح مغلقة لتحريك المنطقة حتى يشعر فتح عظمي في الجمجمة. سيكون هذا مثل الشق مع اتجاه الأمامي / الخلفي تحت protuberance.
   3. تطبيق ضغط متواضع مع ملقط لترك المسافة البادئة في الجلد، والتي ستكون بمثابة معلم لوضع إبرة(الشكل 10A).
   4. أدخل إبرة (حقنة درنة مع إبرة 27 قياس، 5/8 بوصة) عمودي على الجلد فوق علامة المسافة البادئة(الشكل 10B)~ 1/4 بوصة في incisure، ثم إعادة توجيه الإبرة الخلفي والخارجي نحو canthus الجانبية تهدف إلى نقطة الوسط بين موقع الحقن والحافة المدارية العظمية.
      ملاحظة: إذا لم يتم استهداف incisure بدقة مع الإبرة، الجمجمة كتل تقدمها.
   5. بمجرد الوصول إلى محور الإبرة ، قم بحقن 1000 ميكروغرام ببطء من Con A في حجم 0.2 مل(الشكل 10C).
6. استكمال حقن كل من PSLG وOSLG في غضون 2-3 دقيقة.
7. إزالة الحيوان من الإيأوفلوران ة (إذا لم يتم ذلك بعد). يمكن حقن الغدة الدمعية السفلية (ILG) عادة ما تكتمل دون مزيد من التمسيد.
8. حقن الغدة الدمعية السفلية
   1. عرض الحيوان من الجانب. يمكن رؤية بروز ILG على طول الجزء الأمامي السفلي من المدار(الشكل 11A).
   2. رسم خط عمودي باستخدام قلم وضع علامات جراحية أو علامة دائمة مناسبة على الجلد حيث ينتقل الجزء السطحي من غدة ILG من مكان الراحة السطحي (الخارجي) على العظم الزيغوي إلى موقعه الأكثر ميدياً في المدار. هذا هو عادة أدنى من limbus الأمامي(الشكل 11A).
   3. حدد نهاية العظم الزيغوي عن طريق كنس مسبار الولايات المتحدة الذي يحمل عموديًا عبر هذا الخط على الجلد. يحدث انتقال ILG حيث تتغير صورة الغدة من المحددة بوضوح (يظهر خط الصدى الفائق للعظم الزيغوي على طول الحافة السفلية للغدة في الصورة) إلى واحد بدون حدود وسائط يمكن التعرف عليها (لم يعد صدى العظم الزيغوي موجودًا ، الشكل 1).
   4. لاحظ الموضع النسبي للقطعة اليدوية إلى الخط المرسوم على الجلد عندما تظهر شاشة الولايات المتحدة هذا التغيير. هذا هو "موقع الحقن" حيث يجب إعطاء Con A.
   5. السيطرة على عمق الحقن وذلك لوضع كون A في الغدة عند نقطة مجرد الميديا إلى عظم القوس zygomatic.
   6. تحديد عمق الحقن على النحو التالي: تعيين العمق المطلوب للحقن كما عمق العظام zygomatic (إشارة hyperechoic) بالإضافة إلى 1 ملم. طرح هذه القيمة من طول معروف للإبرة (15 ملم في هذا المثال).
   7. أدخل الإبرة في الغدة في "موقع الحقن" ~ 12 ملم ، ثم اسحبها ببطء حتى يكون طول الإبرة المكشوفة خارج الجسم (يقاس بالفرجار الجراحية) مساويا ً للفرق المحسوب في 5.8.6(الشكل 12). حقن 1000 ميكروغرام من كون A في 0.2 مل.
      ملاحظة: لضمان أن يتم ثقب كبسولة الغدة وليس ببساطة دفعت من قبل الإبرة، وينبغي إدخال الإبرة ~ 12 ملم أو تقريبا إلى المحور قبل أن يبدأ انسحابها.
   8. كرر الولايات المتحدة لتأكيد نجاح الحقن. يجب أن تظهر ILG مساحة هيبوإيكوية مميزة(الشكل 1).
      ملاحظة: حقن ILG هو أفضل واحد من قبل الحيوانات^26، وبالتالي، يتم الماضي.
9. إكمال الإجراء بأكمله لحقن جميع الغدد من كلتا العينين في غضون 10 دقيقة. وسيتطلب ذلك تحقيق الكفاءة في هذا الإجراء.
   ملاحظة: مجموعة واحدة من الحقن في الغدد الدمعية المدارية 2 سوف تحفز DED الحادة تستمر 1-2 أسابيع.
10. لDED لمدة أطول، حقن كون A تماما كما هو موضح أعلاه كل 7 أيام. وقد تم تنفيذ ما يصل إلى 6 من هذه الحقن بنجاح.

6- الرعاية اللاحقة للإجراء

1. بعد حقن Con A ، راقب الحيوانات في أكياس تقييدها لمدة 10-20 دقيقة على الأقل ، أو حتى يلبس تأثير التخدير.
2. لا تترك الحيوانات دون مراقبة حتى أنها قد استعادت ما يكفي من الوعي للحفاظ على الرُكَم الرُقّي. لا تعيدهم إلى أقفاصهم الفردية حتى يتعافوا بالكامل.
3. ألم ما بعد الإجراء عادة ما يكون خفيفًا ويستمر أقل من 48 ساعة. تقييم الألم باستخدام مقياس الغريمات الأرانب. إذا لزم الأمر، وإعطاء جرعة واحدة من الكيتورولاك تحت الجلد (5 ملغ /كغ). لمزيد من الألم الشديد، وإعطاء البوبرينورفين تحت الجلد 0.1 ملغ /كغ كل 8 ساعة.

النتائج

تسبب حقن Con A في استجابة التهابية قوية في الغدد الدمعية التي تتميز بتسرب اللمفاوية الكثيفة(الشكل 13)، مصحوبة بانخفاض إنتاج المسيل للدموع. تم تغيير جميع معلمات المسيل للدموع بشكل ملحوظ(الجدول 1 والجدول 2). وبالإضافة إلى ذلك، تم قمع مستويات الكسوفرين المسيل للدموع (السيطرة = 3.1 ± 0.45 مقابل Con A حقن = 2.7 ± 0.02 نانوغرام / ملغ البروتين (متوسط ± SEM)؛ p < 0.03). وكانت النتيجة النهائية للكشف عن القرنية والظهارة الملتحمة، ويتضح من زيادة ارتفاع تلطيخ البنغال(الشكل 6).

حقن أنسجة إل جي المدارية الثلاثة أنتجت حالة DED متسقة وموحدة على عكس الدول التي حققتها الأساليب السابقة^18،27. وكان المساهمون الرئيسيون في هذه النتيجة حقن ILG بتوجيه من الولايات المتحدة وحقن OSLG. ويلخص الجدول 1 النتائج البارزة لهذه الطريقة. جميع التغييرات تتسق مع DED شديدة.

مجموعة واحدة من حقن كون A تنتج DED دائم حوالي 1 أسبوع; جميع المعلمات السريرية تطبيع من قبل اليوم 10(الجدول 2). متتابعة كون A حقن حوالي 1 أسبوع وبصرف النظر تمديد مدة DED وفقا لذلك. على سبيل المثال، تحافظ المجموعة الثانية من حقن Con A في اليوم 7 على DED لمدة أسبوعين وما إلى ذلك. بعد ما يقرب من 5 مجموعات من الحقن ، غالباً ما تصبح حالة DED دائمة دون الحاجة إلى مزيد من الحقن.

عندما تم التعامل مع الأرانب مع DED Con-التي يسببها مع الففوسفوسلينداك عامل الرواية، فإنه قمعت بشكل ملحوظ المرض. على سبيل المثال، بعد علاج أسبوع واحد مع هذا العامل TBUT زيادة ملحوظة بالمقارنة مع الحيوانات التي تعامل مع المركبات (43.6 ± 4.0 مقابل 12.2 ± 2.8 s؛ p<0.001؛ متوسط ± SEM على التوالي، لهذه والقيم التالية) في حين تم تطبيع الأسمولية المسيل للدموع (294± 4.6 مقابل 311 ± 2.0 mOsm/L، p<0.002). Mechanistically، فوسفوسولاينداك انخفض مستويات اثنين من interleukins حاسمة، IL-1α (8.4 ± 1.2 مقابل 21.2 ± 6.6 pg/mg البروتين؛ p<0.03) وIL-8 (4.9 ± 1.7 مقابل 13.5± 5.0 pg/mg البروتين؛ p<0.05)¹⁹.

الشكل 1: صورة الموجات فوق الصوتية للغدة الدمعية السفلية. اللوحة العلوية: ILG لأنها تتحرك أعمق في المدار للاستلقاء تحت القوس zygomatic. يمثل الخط المتقطع الخط على الجلد الذي يتم مسح المسبار الأمريكي عبره. الألواح الوسطى: كما اجتاحت قطعة اليد عبر هذا الخط، يبحث الفاحص عن فقدان صدى العظام zygomatic التي هي موجودة في الصورةاليسرى (السهم)ويختفي في اليمين. الألواح السفلية: صور من ILG التي اتخذت قبل(اليسار)وبعد(يمين)حقن Con A. تطوير مساحة كيسية كبيرة داخل الغدة يؤكد التسليم السليم. أعيد طبعها بإذن¹⁹. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: تسكين قناع الغاز. تُظهر هذه الصورة قناع الغاز الذي يوفر التخدير المعتدل القصير مع الإيسولوران. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: إزالة الغشاء النثلاثي. (أ) حقن الليدوكائين/الإبينفرين. (ب) اقتطاع الغشاء النطاق في قاعدته مع مقص Westcott. (C) سطح العين تصور أكثر سهولة بعد إزالة الغشاء nictitating. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: تمزق كسر قياس الوقت. (أ) موحدة الأخضر المسيل للدموع مظهر الفيلم من سطح القرنية تحت الضوء الأزرق مباشرة بعد تطبيق قطرات الفلورسين. (ب) سطح القرنية الذي خضع بالفعل لتفكك ملحوظ يتضح من دوائر داكنة متعددة وشرائط خطية في الفلوريسين. يتم تسجيل وقت الانفصال بمجرد أن تتطور أول بقعة أو خط مظلم. الدوائر الزرقاء الخفيفة اثنين هي انعكاسات مصدر الضوء قبالة القرنية. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 5: اختبار المسيل للدموع شيرمر. (أ) الموضع السليم للاسفنجة ويك سيل في fornix السفلى لإزالة أي محلول lidocaine الموضعيالمتبقية والدموع خط الأساس. عن طريق وضع الحافة الخلفية للاسفنجة الثلاثية تحت هامش الغطاء السفلي ، يمكن للمرء الحفاظ على تقنية موحدة للغاية لتجفيف سطح العين قبل وضع شرائط المسيل للدموع. (ب) شريط المسيل للدموع وضعت بشكل مناسب في منتصف وضع الغطاء السفلي بين الكرة الأرضية والغطاء السفلي (الملتحمة palpebral). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 6: تلطيخ روز البنغال. العلوي: صور لسطح القرنية. اليسار: لا يوجد تلطيخ البنغال ارتفع موجود قبل العلاج مع كون A. اليمين: يظهر تلطيخ القرنية والملتحمة المنتشر في الربع العلوي من الأنف بعد الحقن (أعلى اليمين). أقل: الملتحمة الانطباع cytology من الملتحمة bulbar متفوقة. إلى اليسار: توجد العديد من خلايا الكُوب قبل العلاج. اليمين: الخلايا الظهارية موجودة ولكن خلايا الكُوب ة غائبة بعد العلاج. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 7: إعداد أرنب لحقن concanavalin A. (أ) يتم استخدام المقصات الصغيرة لإزالة الفراء، مما يسمح بتصور أسهل للمعالم لتحديد الغدة الدمعية المدارية المتفوقة. (ب) يستخدم ناير لإزالة الشعر الذي يبقى بعد القص. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 8: حقن الغدة الدمعية البُصالية. (أ) الغدة الدمعية البلورية، التي تظهر كارتفاع لمبة في الجزء الزمني الخلفي من الغطاء العلوي. وينظر الدموع يتدفقون من سطح هذه الغدة بعد تطبيق قطرة من 2٪ الفلورسين. (ب) يتم حقن الغدة الدمعية الببرية في حين أن الأرنب يتلقى التخدير المعتدل. أحد المحققين يتراجع عن الجفن، ويحسن التعرض للغدة، ويؤمن القناع بينما يحقن المحقق الثاني الغدة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 9: توطين الغدة الدمعية المدارية العليا. تشير التغيرات في ملامح الجلد إلى موقع OSLG لأنها تبرز من خلال الإنسيافي الخلفي. الضغط اللاسي بالتناوب على الكرة الأرضية(سهم كبير)يؤدي إلى هبوط الغدة المدارية المتفوقة ، والتي ينظر إليها على أنها ارتفاع صغير في الجلد. هذا الارتفاع سوف تزيد في الحجم في كل مرة يتم تطبيق الضغط(الأسهم الصغيرة). موقع هذه الغدة عادة ما يتماشى مع الحافة المدارية الخلفية. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 10: حقن الغدة الدمعية المدارية العليا. (أ) تطبيق الضغط اللطيف على الجمجمة مع ملقط ذات مسننة دقيقة في المنطقة التي المنسدلة كما هو الحال في الشكل 9. فتحة رقيقة تشبه الشق في الجمجمة يمكن أن تكون بالبُرِبة. ترك علامة المسافة البادئة الصغيرة مع ملقط يساعد إلى حد كبير وضع الإبرة أثناء الحقن. (ب) يتم إدخال الإبرة عموديا من خلال incisure. إذا وضعت بشكل غير صحيح، يتم إيقاف مرورها من قبل الجمجمة العظمية. (ج) الإبرة في الوضع النهائي الزاوية نحو canthus الجانبي. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 11: توطين الغدة الدمعية السفلية. (أ) بروز الجزء السطحي من ILG الذي يظهر من خلال الغطاء السفلي. علامة القلم المنحني ة تشير إلى الموضع السفلي للغدة. يشير الخط الرأسي، تحت الليفي، إلى الموضع التقريبي الذي ينتقل فيه ILG إلى موضع أعمق داخل المدار ويعمل كمرجع مرئي للولايات المتحدة. (ب) قطعة يد أمريكية تجتاح منطقة الخط العمودي؛ سوف تظهر الشاشة الأمريكية أين ينتهي العظم الزيغوي، وأين التحولات ILG وحيث يجب إعطاء حقن Con A ("موقع الحقن"). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 12: حقن الغدة الدمعية السفلية. يتم حقن ILG في الموقع الذي حددته الولايات المتحدة. يتم حساب عمق الحقن كما هو موضح في النص (الخطوة 5.8.6). الفرجار (ينظر وراء الإبرة) ضمان أن يتم وضع الإبرة في العمق المناسب قبل الحقن. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 13: الأنسجة من الغدد الدمعية. أقسام الأنسجة من الغدة اللاعية السفلية العادية مع بنية التوبولو السنخية النموذجية (A) وبعد حقن Con A (B)، تظهر تسلل ًا لمفاويًا ملحوظًا مع تفريخ الهيكل. وينظر إلى تسلل التهابات مماثلة في الغدد الدمعية متفوقة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

طريقة الحقن	TBUT، ثانية		المسيل للدموع Osmolality، Osm/L		STT, مم
	الاساس	بعد الحقن	الاساس	بعد الحقن	الاساس	بعد الحقن
	يعني ± SEM، النسبة المئوية للتغيير
ILG دون توجيه الولايات المتحدة	58.5 ± 1.5	44.5 ± 7.7	297 ± 4.9	300 ± 3.8	15.2 ± 0.9	12.9 ± 2.2
%التغيير		-23%		1%		-15%
		p =0.05		p =0.36		p =0.21
ILG + PSLG بتوجيه من الولايات المتحدة	59.4 ± 0.6	11.4 ± 4.2	296 ± 4.7	326 ± 3.7	15.1 ± 1.3	10.7 ± 1.8
النسبة المئوية للتغيير		-81%		10%		-29%
		p<0.0001		p<0.0001		p<0.03
ILG + PSLG + OSLG بتوجيه من الولايات المتحدة	60 ± 0.0	6.2 ± 1.3	299 ± 2.9	309 ± 2.8	14.6 ± 0.9	9.9 ± 1.3
النسبة المئوية للتغيير		-90%		3%		-32%
		p<0.0001		p<0.008		p<0.002
تم قياس جميع القيم في اليوم 6 بعد حقنة واحدة من كون A في الغدد المذكورة. وأجريت جميع المقارنات مع خط الأساس. * ILG، الغدة الدمعية السفلية. PSLG, جزء palpebral من الغدة الدمعية متفوقة; OSLG, جزء مداري من الغدة الدمعية متفوقة; الولايات المتحدة، الموجات فوق الصوتية.

الجدول 1: تأثير تقنية الحقن وعدد مواقع الحقن على شدة العين الجافة.

	الاساس	اليوم السادس	اليوم الثالث عشر	اليوم الحادي والعشرون
		حقنة واحدة	2 حقن	3 حقن
TBUT، ثانية	58.5 ± 1.5	44.5 ± 7.7	29.2 ± 7.8	12.8 ± 3.9
النسبة المئوية للتغيير		-24%	-50%	-78%
		p =0.17	p =0.001	p<0.0001
TOsm, Osm/L	297 ± 4.9	300 ± 3.9	308 ± 4.9	313 ± 2.7
النسبة المئوية للتغيير		1%	4%	5%
		p =0.36	p =0.04	p =0.003
STT, مم	15.2 ± 0.9	9.3 ± 1.6	12.9 ± 1.6	7.4 ± 1.1
النسبة المئوية للتغيير		-39%	-15%	-51%
		p =0.17	p =0.13	p =0.008
وأجريت مقارنات مع خط الأساس.

الجدول 2: تأثير حقن Con A المتكررة في ILG على مدة DED.

Discussion

الأرانب جذابة للغاية لدراسة DED. القرنية والملتحمة لديهم مساحة سطح أقرب إلى أن البشر بالمقارنة مع الفئران والجرذان. تكملة من الإنزيمات استقلاب المخدرات مثل esterases، والأنسجة من الغدد الدمعية مماثلة لتلك التي من البشر، وعيونهم كبيرة بما يكفي لدراسات الدوائية بالمعلومات. بالمقارنة مع الخنازير والقرود ، والتي تشترك في ميزات مماثلة ، فإنها تكلف أقل والتلاعب التجريبي أسهل. إذا تم التفكير في دراسات ميكانيكية ، فإن العيب النسبي للأرنب ، مقارنة بالفئران ، هو أن عددًا أقل من الكواشف (على سبيل المثال ، الأجسام المضادة أحادية النسيلة) متاح. من ناحية أخرى ، الأرنب هو أعلى بكثير من الفئران لدراسات الصيدلة والتوزيع الحيوي لأن الأنسجة الفردية يتم تشريحها بسهولة وحجم كاف للعمل التحليلي ، وتجنب "تجميع العينات".

المعلمة العامة الحرجة هي فترة تأقلم الأرانب. يتم شحن الحيوانات من البائع في ظل ظروف لا تضمن في كثير من الأحيان بيئة نقل من درجة الحرارة المناسبة أو الرطوبة. قد تكون بعض الحيوانات قد وضعت بالفعل العين الجافة عند الوصول. يوصى بفترة أسبوعين من التأقلم. بنفس القدر من الأهمية هو الاهتمام الدقيق بالرطوبة ودرجة الحرارة في الفضاء حيث توجد الأرانب الدراسة في vivarium. الانحرافات في أي شرط يمكن أن تحفز اختلافات كبيرة في حالة العين. لديك مرطبات احتياطية ومزيلات الرطوبة في متناول اليد. إذا فشل النظام المركزي، فتصرف بسرعة لاستعادة الرطوبة المحيطة باستخدام المعدات الاحتياطية. نضع في اعتبارنا أن مثل هذه التطورات المؤسفة هي أكثر شيوعا في أشهر الصيف. الخطوات الثلاث الأكثر أهمية، ومع ذلك، لتحفيز بنجاح DED في الأرانب هي: 1) الاستخدام الماهر للتصوير الولايات المتحدة لتحديد ILG وتوجيه وتأكيد حقن كون A; 2) ضمان حقن كل من ILG وجزأين من SLG؛ و 3) بشكل موثوق واستنساخي المعلمات من DED.

تطوير المهارة التجريبية المطلوبة ليست تافهة ولكن لا ينبغي أن تردع أي محقق جاد. توقع أن يتم إكمال منحنى التعلم في غضون خمسة تكرارات. نظام التصوير في الولايات المتحدة ذات جودة معقولة أمر ضروري. الاعتراف بالسمات التشريحية من قبل الولايات المتحدة مهم ، لذلك ، يجب على المحقق مراجعة تشريح الأرانب. وصف ممتاز لتشريح الأرانب من قبل ديفيس²⁵، وهو كلاسيكي ، يمكن أن يكون مفيدا للغاية. نضع في اعتبارنا أيضا الاختلاف في حجم ILG. والنتيجة الطبيعية لذلك هي أن نجاح كون A يجب أن تتأكد دائما مع متابعة التصوير. الاختلافات في الاستجابة لCon A في مجموعة من الأرانب غالبا ما يرجع إلى تقنية الحقن (حقن غير ناجحة أو ناجحة جزئيا) أو إلى تجاهل قدرة أنسجة الغدة الدمعية المتبقية للتعويض مع الإفراط في إنتاج الدموع. بالنسبة لأولئك الذين يرغبون في السيطرة على تقنية الحقن ، يمكن أن يكون حقن أزرق الميثيلين متبوعًا بتشريح تشريح يُحدّد سريعًا مفيدًا ؛ يتم تحقيق التصور إذا وصل إلى الغدة الدمعية أو انسكب على الأنسجة المجاورة. حتى الآن ، تم تنفيذ طريقة الحقن هذه أكثر من 270 مرة من قبل المؤلفين دون مضاعفات واحدة.

يمكن أن يكون فحص المعلمات الخمسة لـ DED المعروضة أعلاه صعبًا كما هو تصميمهم في الممارسة السريرية. على الرغم من أن الاختلافات الإيقاعية لم يتم توثيقها رسميًا في أي منها ، إلا أن هناك أدلة خلفية كافية على مثل هذه الظواهر في العين²⁸ التي يجب أن يتم فحصها في نفس الوقت من اليوم (± 1 h) ، خاصة عندما يتم إجراء المقالات المتكررة ومقارنتها ببعضها البعض. الاتساق في تنفيذ هذه المقالات أمر ضروري. مطلوب فريق من اثنين. أربعة أو أكثر من المحققين في نفس الغرفة المشاركة في المقالات يمكن أن تكون مدمرة، نظرا لأن بعض الخطوات تتطلب توقيت صارم. ومن المهم تقديم وثائق فوتوغرافية مناسبة وعالية الجودة، حيثما أشير إليها.

هذا النموذج مناسب بشكل مثالي لدراسات تطوير الأدوية. إتقان النموذج الحيواني وتقنيات الاسبهي يضمن استنساخ ممتازة¹⁹ من دراسات الفعالية والسلامة.

هذا هو نهج تجريبي قوي لأنه يقضي على التباين الملتبس للنماذج السابقة ، وقد تبسيط النموذج الحيواني ومعيار أساسا المعلمات الخمسة من DED. وقد أكد التطبيق الناجح لهذا النموذج على دراسة وكيل العلاجية مرشح فائدته العملية كنموذج الحيوان بالمعلومات لمرض في حاجة ماسة إلى عوامل جديدة وفهم أعمق من الإمراض.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm macro lens	Canon EF 100mm f/2.8L IS USM	3554B002
26 gauge needles (5/8)	Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ	305115	Needles for injecting ConA into the lacrimal glands
27 gauge needles (5/8)	Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ	305921	Needles for injecting ConA into the lacrimal glands
Aceproinj (acepromazine)	Henry Schein Animal Health, Dublin, OH	NDC11695-0079-8	0.1ml/kg subcutaneously injection for rabbit sedation
Anesthesia vaporizer	VetEquip, Pleasanton, CA	Item #911103
Bishop Harmon Forceps	Bausch and Lomb (Storz), Bridgewater, NJ	E1500-C	Tissue forceps
Caliper	Bausch and Lomb (Storz), Bridgewater, NJ	E-2404	Caliper used to measure length of needle during ConA injection
Concanavalin A	Sigma, St. Louis, MO	C2010	Make 5mg/ml in PBS for injection into rabbit lacrimal glands
DSLR camera	Canon EOS 7D DSLR	3814B004	Digital single lens reflex camera
fluorescein	AKRON, Lake Forest, IL	NDC17478-253	Dilute to 0.2% with PBS to measure TBUT
Isoflurane	Henry Schein, Melville, NY	29405
Lactoferrin ELISA kit	MyBiosource, San Diego, CA	MBS032049	Measure tear lactoferrin level
lidocaine	Sigma, St. Louis, MO	L5647	1% in PBS for anesthesia agent
macro/ring flash	Canon Macro Ring Lite MR-14EXII	9389B002AA
Osmolarity tips	TearLab Corp., San Diego, CA	#100003 REV R	Measure tear osmolarity
PBS (phosphate buffered saline)	Mediatech, Inc. Manassas, VA	21-031-CV
Rabbit, New Zealand White or Dutch Belted (as described in text)	Charles River Labs, Waltham, MA	2-3 kg	Research animals
Rose Bengal	Amcon Laboratories Inc., St. Louis, MO	NDC51801-004-40	1% in PBS, stain the ocular surface
Schirmer strips	Eaglevision, Katena products. Denville, NJ	AX13613	Measure tear production
Surgical Loupes +1.50	Designs for Vision, Bohemia, NY	Specialty item	Provide magnificantion of ocular surface while observing tear break up and performing Concanavalin A injections.
TearLab Osmometer	TearLab Corp., San Diego, CA	Model #200000W REV A	Measure tear osmolarity
Ultrasound probe	VisualSonics Toronto, Ont	MX 550 S	Untrasonography-guide Con A injection for inferior lacrimal gland