JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يصف البروتوكول استخدام التصوير الضوئي للسلك لتقييم التوتر الكهربي لامتري لشرايين المساريقي المعزولة عن الفئران ، مع النظر بشكل خاص في التحوير بواسطة العوامل المنبعثة من الخلايا البطانية والانسجه الدهنية الوعائية.

Abstract

تغيير استجابه لهجة الاوعيه الدموية للمؤثرات المرضية الفسيولوجية يساهم في تطوير مجموعه واسعه من الامراض القلبية الوعائية والايضيه. الخلل الغشائي يمثل الجاني الرئيسي للحد من توسع الاوعيه وزيادة انقباض الشرايين. الانسجه الدهنية (الدهون) المحيطة بالشرايين تلعب أدوارا مهمة في تنظيم الاسترخاء بطانة الاعتماد عليها و/أو انكماش خلايا العضلات الملساء الوعائية. ويمكن تقييم المحادثات المتقاطعة بين الانسجه الدهنية البطانته والوعائية السابقة باستخدام الاوعيه الدموية المثبتة بواسطة نظام التصوير بالأسلاك. ومع ذلك ، ينبغي وضع الإعدادات المثلي للشرايين المستمدة من الكائنات الحيوانية من مختلف الأنواع ، والاعمار ، والخلفيات الوراثية و/أو الظروف المرضية الفسيولوجية.

Introduction

يتم تحقيق التضيقات وتضييقات الشرايين عن طريق الارتخاء والانقباضات ، علي التوالي ، من خلايا العضلات الملساء الوعائية. التغيرات في استجابه الاوعيه الدموية من الشرايين الصغيرة تسهم في تنظيم الساكنة الدموية من ضغط الدم الشرياني عن طريق الأعصاب لااراديه والهرمونات الموجودة في الدم (علي سبيل المثال ، الكاتيكولولامين ، انجيوتنسين الثاني ، السيروتونين ، vasopressin). علي المستوي المحلي ، يتم تضمين الاستجابات الوعائية لخلايا العضلات الملساء بواسطة إشارات من كل من الخلايا البطانية للالعشير والانسجه الدهنية المحيطة بالشرايين (الشكل 1).

البطانة ليس فقط حاجزا سلبيا ، ولكن أيضا بمثابه سطح لتبادل الإشارات بين الدم وخلايا العضلات الملساء الاوعيه الدموية الاساسيه. عن طريق الإفراج عن مختلف المواد الفعالة للاوعيه ، بطانة يلعب دورا حاسما في السيطرة المحلية علي الاستجابات لهجة الاوعيه الدموية1. علي سبيل المثال, ردا علي استيل, يتم تنشيط synthase أكسيد النيتريك البطانية (نوس) في بطانة لإنتاج أكسيد النيتريك (NO), الذي يدفع الاسترخاء من العضلات الاساسيه السلس الاوعيه الدموية عن طريق تفعيل القابلة للذوبان guanylyl سيكلواسي (بوابه القيادة) 2. غيرها من المواد الفعالة للاوعيه وتشمل المنتجات من سيكلوكسيجيناسيس (علي سبيل المثال ، proستايسي و ثروبوككسان A2) ، ليبوكسيجيناز (علي سبيل المثال ، 12-هيدروكسي ييكوسيكاتينيويك الأحماض ، 12-hete) ، و سيتوكروم P450 مونوكسيجيناسيس (hete و الأحماض الدهنية, EETs), أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS), الببتيدات النشطة للاوعيه (مثل, الاندوثيلين و انجيوتنسين II), وعوامل فرط الاستقطاب بطانة (EDHF)3. التوازن الدقيق بين موسعات الاوعيه المشتقة من بطانة والمضيقين للاوعيه الحفاظ علي لهجة حركي المحلية4,5.

ويتميز الخلل البطانية من ضعف في توسع الاوعيه المعتمدة علي بطانة6, السمة المميزة للشيخوخة الاوعيه الدموية7. مع العمر ، يتم تخفيض قدره بطانة لتعزيز توسع الاوعيه تدريجيا ، ويرجع ذلك إلى حد كبير إلى انخفاض التوافر البيولوجي لا ، فضلا عن التعبير غير طبيعي ووظيفة نوس في البطانة وبوابه القيادة في خلايا العضلات الملساء الاوعيه الدموية8 , 9 , 10. خفض التوافر البيولوجي لا يقوي إنتاج بطانة التي تعتمد علي مضيق الاوعيه11,12. في الشرايين القديمة ، يسبب الخلل الغشائي فرط تنسج في وسائل الاعلام ، كما ينعكس في الزيادات الملحوظة في سماكه الجدار ، وعدد من النوى الإنسي ، والتي تذكرنا بسماكة الشرايين في ارتفاع ضغط الدم وتصلب الشرايين لوحظ في الإنسان مرضي13,14. الاضافه إلى ذلك ، الحالات المرضية الفسيولوجية مثل السمنة ، والسكري أو ارتفاع ضغط الدم تسريع تطوير الخلل الغشائي15،16.

الانسجه الدهنية الوعائية (PVAT) النشرات العديد من اديبوكينس لتنظيم هيكل الاوعيه الدموية ووظيفة17. وتوسط التاثير المضاد لمقلص من pvat من قبل عوامل الاسترخاء ، مثل اديبوكتين ، لا ، بيروكسيد الهيدروجين وكبريتيد الهيدروجين18،19،20. ومع ذلك ، اعتمادا علي الموقع والحالة المرضية ، PVAT أيضا يمكن ان تعزز استجابات مقلص في مختلف الشرايين21. وتشمل المواد الموالية لمقلص التي تنتجها pvat انجيوتنسين-الثاني ، ليبتين ، المقاومة ، والروس22،23.  في معظم الدراسات علي الاوعيه الدموية المعزولة, وقد اعتبر PVAT كدعم الهيكلية بسيطه للاوعيه الدموية التالي ازالتها اثناء اعداد أجزاء حلقه السفينة الدم. منذ الخلل الوظيفي الدهني يمثل عامل خطر مستقل لارتفاع ضغط الدم ومضاعفات القلب والاوعيه الدموية المرتبطة بها24، يجب النظر في pvat المحيطة الاوعيه الدموية عند التحقيق في الاستجابة الوعائية شرايين مختلفه.

وقد استخدمت أنظمه متعددة الأسلاك myograph علي نطاق واسع للتحقيق في وظائف حركي مجموعه متنوعة من الاوعيه الدموية ، بما في ذلك الشريان الابهر ، المساريقي ، الكلي ، الفخذ ، الدماغي والشرايين التاجية25،26. البروتوكولات الموصوفة هنا سوف تستخدم الأسلاك التصويرية لتقييم استجابه الاوعيه الدموية في الشرايين المساريقيه المعزولة عن نماذج الماوس المعدلة وراثيا ، مع تركيز خاص علي التحوير من قبل PVAT.

Protocol

وقدمت جميع الكائنات المستخدمة في الدراسة التالية من قبل وحده المختبرات الحيوانية في كليه الطب ، جامعه هونغ كونغ. تم الحصول علي الموافقة الاخلاقيه من اللجنة الاداريه المعنية باستخدام المختبرات الحيوانية للتدريس والبحث (CULATR, no.: 4085-16).

1-الاعمال التحضيرية

  1. اعداد الادويه
    1. تخزين الادويه بشكل مناسب كما هو مبين في ورقه بيانات سلامه المواد (المسدس) مباشره بعد تلقيها. حل المخدرات في شكل مسحوق في المذيبات كحلول الأسهم عاليه التركيز ومن ثم قسامه للتخزين في-20 درجه مئوية.
      ملاحظه: يتم حل معظم الادويه في الماء المقطر لاعداد حلول الأسهم. قد تكون هناك حاجه إلى التدفئة أو صوتنه لبعض الادويه. إذا كانت الادويه لا تذوب تماما في الماء ، يمكن أضافه قطره من 1 م NaOH ، في حين للادويه الاساسيه قطره من 1 M HCl يمكن استخدامها. ويمكن حل العقاقير المسعورة في ثنائي ميثيل سولفوكسيد (DMSO) أو الايثانول المطلق. في الحالات الاخيره ، يجب ان يكون تركيز الحمام النهائي (في M) معروفا وينبغي اجراء الضوابط المناسبة لاستبعاد اثار المذيبات.
    2. قبل التجربة ، حل المخدرات قسامات (جدول المواد) في محلول بيكربونات الرنين كريبس (krebs) التي تحتوي علي 115 mm كلوريد الصوديوم ، 4.6 mm kcl ، 2.5 mm cacl2، 1.17 mm mgso4، 1.17 mm KH2PO4، 25 مم ناهكو3 ، 11.1 Mm D-الجلوكوز و 0.01 mm أدتا ، الأس الهيدروجيني 7.4.
    3. للتركيز التراكمي-منحنيات الاستجابة ، واعداد المخزونات وحلول العمل من الادويه المختلفة عن طريق التخفيفات التسلسلية (الجدول 1).
  2. اعداد الاداه
    1. معايره محول القوه لجميع القناات قبل استخدام نظام myograph في كل يوم ، أو في كل مره تم نقل النظام.
      ملاحظه: يختلف اجراء المعايرة التفصيلية تبعا للنموذج. بشكل عام ، يتم تطبيق وزن اثنين من الغرام علي الفكين والقوه المقابلة ينبغي 9.81 ± 0.1 mN. إذا كانت القراءة من قبل أكثر من 0.1 mN ، يجب أعاده معايره محول. بالنسبة للنظام المستخدم في هذا البروتوكول (انظر جدول المواد) يجب ان تكون قيم التشغيل لمحول القوه اثناء المعايرة بين 3000 و 3500. إذا كانت قيمه المحول اعلي أو اقل ، يجب استبدال محول القوه.
    2. اضبط ومحاذاة الدعامات المتصاعدة في كل غرفه. الاستخدام المستمر والمتكرر للغرفة الناسخة قد يسبب بعض اختلال الدعم المتصاعد ، والذي يحتاج إلى تعديل من حين لأخر قبل التجارب لضمان محاذاة الفكين بشكل صحيح.
      ملاحظه: هناك حاجه إلى اهتمام خاص عند ضبط الدعامات المتصاعدة لان محولات القوه حساسة جدا وهشه.
    3. التبديل علي سخانات والغاز (95 ٪ O2 و 5 ٪ CO2) علي الأقل 30 دقيقه قبل التجربة للسماح للغرف والمخازن المؤقتة لتكون درجه حرارة تصل إلى 37 ± 0.1 °c و معايرتها مع خليط الغاز.
      1. تحقق من درجه الحرارة علي ترمومتر لضمان دقه سخان. يمكن تعديل درجه الحرارة لتشغيل التبريد أو الاحترار التجارب. إذا كانت درجه الحرارة غير صحيحه كما هو محدد ، تطبيق وظيفة أزاحه الجهاز لزيادة أو إنقاص الإعدادات للوصول إلى درجه الحرارة المطلوبة.
    4. في نهاية التجربة ، وتنظيف جميع الغرف وإيقاف السخان ، فضلا عن تشغيل الغاز إلى الاعداد.
      1. لا تطفئ الغاز قبل ان يتم امتصاص كل السائل في الغرفة من النظام ، والا فان الماء الحمضي/المقطر قد اجتر ويصل إلى غرفه الجهاز خلال الاستخدام التالي.
      2. لتنظيف الغرف من السلك الناسخ ، الطريقة الأكثر فعاليه هو اجراء غسل الحمض باستخدام محلول حمض الخليك المخفف. تنظيف الحافة وداخل الغرف مع مسحه من القطن.
      3. بعد الغسيل ، شطف الحجرات جيدا بالماء المقطر. امسح الخارج من الحجرات بقطعه قماش مبلله لأزاله الملح المجفف. ويمكن أيضا استخدام الايثانول إذا استخدمت العقاقير المسعورة اثناء التجربة.
      4. مثال علي اجراء الغسيل علي النحو التالي. ملء الغرف مع محلول حمض الخليك 8 ٪ واحتضان لمده 2 دقيقه. استخدام قضيب من القطن يميل إلى تنظيف سطح غرفه الصلب ميكانيكيا. تجنب اي اتصال مع الجزء ألومنيوم من الناسخ.
      5. يستنشق حمض الخليك ويغسل غرفه التصوير ويدعم عده مرات مع الماء المقطر وتجف الأسطح باستخدام ورقه ماصه أو تطبيقها القطن طرف.
  3. تشريح حلقات الشرايين المساريقي
    ملاحظه: الحيوانية المستخدمة في الدراسة الحالية والحمية الغذائية عاليه الدسم تغذيه الذكور الفئران SIRT1 والبرية نوع الأصحاب كعناصر التحكم. وزن كل حيوانيه تقريبا 45 [غ] [آت تيم] من التجارب.
    1. موت ببطء الماوس بواسطة حقن داخل الصفاق من البنتوباربيتال الصوديوم (50 ملغم/كغ).
    2. مع المقص الجراحي والملقط ، قم باجراء بضع البطن في منتصف الخط للكشف عن المحتويات البطنية.
    3. جمع الممرات المساريقي في طبق بتري المغلفة السيليكون.
    4. انتشار ودبوس أسفل الشبكة المساريقي في طبق بيتري للكشف عن المتفرعة من المساريق والنسيج الضام مشعمل.
    5. تحت المجهر (10x) ، ومع مقص غرامه وملقط ، تشريح بعناية خارج الانسجه الضامة المحيطة بها. تجنب اتلاف طبقه التهوية. بدلا من ذلك ، يمكن الاحتفاظ الانسجه الدهنية المحيطة حول الاوعيه الدموية للتجربة (إذا لزم الأمر).
    6. باستخدام مقص غرامه وملقط ، والمكوس الفروع الثانوية من الشرايين المساريقي في الجليد الباردة Krebs العازلة.
      ملاحظه: كل باحث يجب ان يكون له/لها مجموعه من مجموعه التشريح ، والسلاسل والركبان. وينبغي الحفاظ علي هذه الاداات بشكل صحيح وتنظيفها في كل مره بعد التجربة كما ان بعض الادويه من الصعب ان يغسل بعيدا وبقايا يمكن التمسك بها.
      1. الحفاظ علي الاوعيه الدموية في العازلة Krebs الباردة اثناء فصل الانسجه الضامة المحيطة بها ، بما في ذلك PVAT. اثناء التعامل مع الاوعيه الدموية ، تكون لطيفه لمنع الاضرار غير الضرورية لبطانة.
      2. إذا كانت التجربة تنطوي علي دراسة PVAT ، والاحتفاظ 1.5 إلى 2 ملم قطرها المجال من PVAT حول الاوعيه الدموية. بدلا من ذلك ، يمكن أضافه نفس كميات الانسجه الدهنية في كل غرفه للتجربة.
    7. اختياري أزاله البطانة من الاوعيه الدموية تشريح كعنصر تحكم لتقييم بطانة التبعية للاستجابات. بالنسبة للشرايين المساريقيه ، قم بازاله البطانة بالتقليب برفق علي السلك أو الشعر.
    8. قطع الاوعيه الدموية التي أعدت علي النحو الوارد أعلاه في حلقات صغيره (~ 2 ملم طول) ووضعها في طبق من البلاستيك الكامل من الخلوية (95 ٪ O2 و 5 ٪ CO2) كريبس العازلة للتركيب اللاحقة في الغرف من الأسلاك المطبوعة27.
    9. نقل حلقات السفينة إلى غرفه التصوير المقطعي وضعت تحت المجهر. وينبغي وضع حلقات بالتساوي ، مع الركبان العلوي والسفلي موازيه. يجب ان يكون السلك المرفق (40 μm) معدا حديثا لان الادويه قد ترتبط بالأوتار.
    10. الموضوع حلقه الاوعيه الدموية علي طول مناسب (2 سم) من السلك وأمنه لفك واحد من غرفه المتصاعدة عن طريق الشد لإصلاح الموقف.
    11. تمرير سلك ثان من خلال الحلبة ومرساه إلى الفك المعاكس.
    12. مع حلقات مترابطة والمضمونة لفك الغرفة ، جبل الغرفة علي الاعداد myograph وتحويل المسمار ميكرومتر في اتجاه عقارب اليوم لتحريك الأسلاك بالقرب من بعضها البعض حتى القراءة قوه علي واجهه المستخدم المقابلة للغرفة التي شنت هو صفر أو فقط ادناه.
      ملاحظه: يجب ان يكون السلك المرفق بالفك العلوي من الطول الأدنى لضمان ان التوتر يمكن ان يكون محولا بالبالكامل إلى جهاز الكشف.
    13. تتوازن الاستعدادات في 37 درجه مئوية لمده 30 دقيقه علي الأقل قبل التطبيق الأول للقوه باستخدام ميكرومتر قابل للتعديل.
    14. تقييم سلامه الانسجه في 115 mM عاليه البوتاسيوم (كلوريد الصوديوم الاستعاضة عنها kcl علي أساس المولي) krebs التي تحتوي علي 4.6 mm كلوريد الصوديوم ، 115 mm Kcl ، 2.5 mm cacl2، 1.17 mM MGSO4، 1.17 Mm KH2PO4، 25 مم ناهكو3 و 11.1 mM D-الجلوكوز في 7.4 pH.
      ملاحظه: تعتبر الاوعيه المعزولة قابله للاستمرار إذا كانت القوه المقلصة محوله ومسجله كانحراف فوق خط الأساس في برنامج تسجيل البيانات الخاص بنظام التصوير المجسم هو أكثر من 40% من نغمه الراحة الخاصة بهم ، وذلك استجابه لعامل مقلص. إذا كان الشريان لا العقد بشكل مناسب ، ثم اما التوتر القاعدي الأمثل/ضغط الجدار لم يتم تعديلها علي نحو صحيح أو الشريان قد تضررت اثناء العزلة أو تركيب السفينة.
    15. اختياري تقييم سلامه الخلايا البطانية عن طريق تطبيق فينيليفرين للحث علي انكماش السفينة إلى 50 ٪ من الاستجابة الاوليه ل KCl (كما سجلت من قبل محول القوه في برنامج تسجيل البيانات) ، تليها أضافه 1 μM استيل.
      ملاحظه: يعد اعداد الاوعيه الدموية الجيدة أمرا حاسما للحصول علي نتائج متناسقة ودقيقه. يجب عدم استخدام الاعداد للتجربة اما إذا كان اختبار السلامة البطانية غير مرض أو انه لا يستجيب ل KCl ، مشيرا إلى ان وظيفة بطانة الاوعيه الدموية أو انقباض العضلات الملساء الوعائية ، علي التوالي ، ليست مرضيه. في هذه الحالة ، يجب ان يتم استبدال الاعداد مع حلقه جديده من نفس الوعاء الدموي أو الاوعيه الدموية الجديدة.

2-التطبيع لتحديد التوتر الاولي الأمثل

ملاحظه: يسمح اجراء التطبيع بتحديد القطر الداخلي الأمثل (IC) من الشرايين التي يواجه فيها الوعاء الدموي ضغطا مناسبا للعوارض الجدارية (100 زئبق أو 13.3 كيلو باسكال لشرايين المساريقي) وينتج اقصي نشاط القوات ردا علي العوامل الفعالة للاوعيه.

  1. التبديل علي الكمبيوتر وفتح برنامج تسجيل البيانات (انظر جدول المواد).
  2. حفظ التجربة ك "ملف بيانات LabChart" مع اسم جديد لتجنب الكتابة فوق ملف الاعداد الأصلي.
  3. افتح اطار إعدادات التسوية وقم بتعيين عامل k ك 1. قبول القيم الافتراضية لمعايره العدسة (0.3 ، إذا كان طول السفينة غير معروف ، أو 1 إذا كان طول السفينة معروفا) ، والضغط المستهدف (13.3) ، والوقت المتوسط علي الإنترنت (2) وتاخير الوقت (60). انقر فوق موافق لحفظ الإعدادات.
  4. حدد قنوات الاهتمام وإدخال قطر السلك (40 μm) ، ونقاط نهاية الانسجه (a1:0 ؛ a2: طول الانسجه كما تقاس) ، قراءه ميكرومتر الاوليه في نافذه التطبيع.
  5. بدء اجراء التطبيع عن طريق تطبيق أول امتداد السلبي إلى الاوعيه الدموية (تحويل المسمار ميكرومتر عكس اتجاه عقارب الدقيقة).
  6. انتظر السفينة لتحقيق الاستقرار (3 دقيقه) وإدخال القراءة ميكرومتر جديده في نافذه التطبيع. يتم حساب التوتر الجدار تلقائيا ويظهر كنقطه علي الرسم البياني.
    ملاحظه: الميكرومتر "الخطوات" المستخدمة خلال امتداد السلبي لا تحتاج إلى ان تكون هي نفسها. ويمكن ان تمتد القليلة الاولي 20 ميكرومتر لكل منهما. كما تمتد الاقتراب من خط شريط البار ، يمكن خفض الخطوات إلى 10 μm ، 5 μm ، 2 μm أو حتى أصغر. لديك نافذه الرسم البياني الرئيسية مفتوحة اثناء ضبط الإعدادات ميكرومتر-إذا كان ارتفاع كبير يتجاوز خط شريط البار علي الرسم البياني الطول/التوتر (الذي يشير إلى نقاط الضغط المقابلة لقيمه محدده مسبقا) يظهر ، والحد من التوتر.
  7. بعد كل امتداد السلبي ، واستبدال كريبس السيطرة مع البوتاسيوم العالية ايزو-osmotic التي تحتوي علي 115 mM KCl. عندما يصل الانكماش إلى هضبة (حوالي 3 دقائق) ، سجل القوه النشطة (F) عن طريق طرح القوه السلبية في كل امتداد من القوه التي تنشط البوتاسيوم. حساب التوتر الجدار وكذلك المحيط الداخلي (IC) القيم.
    1. قياس التوتر النشط كانحراف فوق خط الأساس. يتم احتساب التوتر النشط (T) استنادا إلى المعادلة F (mN) = T (mN/mm) × 2 × طول السفينة (مم). وتحسب قيم المحيط الداخلي (IC) من البيانات الميكروميتر (IC = 205.6 μm + 2 x "الفجوة").
  8. أزاله حاله البوتاسيوم عاليه عن طريق استبدال مع Krebs الطازجة. كرر الغسيل لثلاث مرات أكثر من 5 دقائق.
  9. كرر الخطوات 2.5 إلى 2.8 (عن طريق حمل الامتدادات الخاملة متبوعا بالانكماش النشط في المنعطفات البديلة) حتى يبدا التوتر النشط في الانخفاض (الشكل 2).
  10. بعد جولات متعددة من الامتدادات البديلة ، منحنيات الطول/التوتر السلبي تعطي قيمه IC100 ، المحيط الداخلي للسفينة عند ضغط اللوحة الجدارية 100 مم زئبق ، كنقطه العبور مع خط الشريط.
    ملاحظه: يتم إدخال كل قيمه ميكرومتر اثناء التمدد السلبي يدويا في الوحدة النمطية تطبيعالبرامج. يسجل البرنامج تلقائيا قياس القوه المقابلة لتوليد منحني الطول/التوتر السلبي ، والذي يعطي قيمه IC100 كنقطه عبور مع خط البار (الشكل 2، اللوحات اليمني). أقرب نقطه الأخير هو خط شريط البار ولكن فقط فوق التطبيع أفضل من دون اتلاف السفن. نقطه بعيدا جدا فوق ال [ايسبار] خط يمكن ماديا ضررت ال يعلق سفينة, يسبب نتيجات موثوقه اثناء التجربة.
  11. إنشاء منحنيات الطول/التوتر النشطة لتحديد القيم IC1 وحساب التطبيع k عامل كنسبه IC1/IC100 ، والتي سيتم استخدامها لهذا النوع من الاوعيه الدموية في التجارب اللاحقة التصوير الضوئي.
    ملاحظه: يتم إنشاء منحنيات الطول/التوتر النشطة بالتامر علي قيم IC محسوبة من البيانات ميكرومتر علي محور س والتوترات النشطة علي محور ص. IC1 هي القيمة الكامنة داخل منطقه هضبة الذروة (اثار حمراء في الشكل 2، لوحات الحق). بعد رسم منحنيات الطول/التوتر النشطة وتحديد IC1 ، يتم احتساب معامل k التطبيع كنسبه IC1/IC100. استنادا إلى التطبيع k عامل ، والأمثل IC لخط الأساس ، المشار اليها باسم IC1 ، وسوف تظهر علي طول السلبي/منحني التوتر. يظهر الاعداد الميكرومتر لهذا IC تحت المنحني ويجب استخدامه لتعيين المحدد المصغر لتجارب التصوير اللاحق. التوتر الاولي (T) يساوي الضغط المستهدف (Pi) x IC/2 π والقوه المثلي (F) المطبقة علي السفينة تساوي طول السفينة T x 2 x.
  12. يغسل جيدا Krebs البوتاسيوم عاليه وتتوازن الاستعدادات لأخر 30 إلى 45 دقيقه. أعاده تعيين التوترات القاعدية إلى "صفر" بحيث يتم تسجيل الاستجابات مقلص النشطة فقط اثناء التجربة اللاحقة.

3-الانقباضات المستحثة فينيليفرين

ملاحظه: الادويه التي يمكن اختيارها للحث علي الاستجابات مضيق للاوعيه وتشمل بإفراز ناهض الكظر غير محدده, الانتقائي α-1 ناهض فينيليفرين, الببتيد هرمون انجيوتنسين الثاني, و مونوامين الناقل العصبي 5-هيدروكسيتريبتاميني. ويستخدم فينيليفرين في هذا البروتوكول للفحص (جدول المواد).

  1. اعداد وتركيب حلقات الشرايين المقترنة كما هو موضح في القسم 1.3 ، واحد مع PVAT سليمه والاخر مع PVAT أزاله ، من الأقسام المجاورة لكل شريان للتجربة.
  2. بعد التطبيع (الموصوفة في القسم 2) ، قبل التعاقد مع شرائح الشرايين مع ارتفاع البوتاسيوم Krebs العازلة عن طريق أضافه 115 mM الحل KCl إلى الغرفة التي تحتوي علي Krebs.
  3. الانتظار لانكماش إلى هضبة (3 دقيقه) ، ويغسل البوتاسيوم عاليه واستبدال مع العازلة الطازجة الخلوية Krebs. كرر الغسيل ثلاث مرات أكثر من 5 دقائق.
  4. كرر التحفيز KCl والغسيل ثلاث مرات وتسجيل الاستجابة مقلص القصوى/التوتر إلى KCl عن طريق طرح التوتر خط الأساس من التوتر بسبب التحفيز KCl.
  5. بعد الانكماش الأخير والغسيل ، أعاده ملء الغرفة مع الدافئة ، العازلة Krebs والسماح للشريان للتعافي لمده 30 دقيقه قبل تنفيذ المهمة التالية.
  6. لكل غرفه ، أضافه كميات تراكمية من فينيليفرين (زيادات نصف السجل من 10-10 إلى 10-4 م) للحث علي الزيادات التي تعتمد علي التركيز في التوتر متساوي القياس من الاستعدادات هادئه.
  7. تبدا باضافه تركيز منخفض من ناهض إلى الغرفة. بعد السماح بوقت كاف لانقباض مستقر (3 – 5 دقائق) ، أضف التركيز التالي. كرر الخطوات مع تركيزات متزايدة من فينيليفرين.
  8. بعد أضافه الجرعة الاخيره من ناهض (فينيليفرين) ، يغسل المخدرات تماما وأعاده ملء الغرفة مع العازلة Krebs الطازجة. ارسم الاستجابات المعتمدة علي التركيز كنسب مئوية متزايدة من الانقباضات القصوى المستحثة من قبل KCl (الشكل 3).
  9. اختياري لتقييم مساهمه NO ، احتضان الاستعدادات مع مثبطات synthase NO ، L-NAME (10-4 م) ، لمده 30 دقيقه قبل أضافه فينيليفرين... L-NAME يعزز الانقباضات المستحثة فينيليفرين في الاستعدادات هادئه من الشرايين المساريقي (الشكل 4).
    ملاحظه: المثبطات أو الخصوم يجب ان يكون لديك الوقت الكافي لتحقيق تاخيرمن ، عاده 30-45 دقيقه (تكون متسقة لأي مجموعه من التجارب).
  10. لأداء منحني التركيز الثاني-الاستجابة بالتتابع ، اغسل الغرفة بشكل كامل ومتكرر لأزاله كل المنبات السابقة ، حتى لا يتم ملاحظه اي تغييرات أخرى في النغمة.
    ملاحظه: التجريب المتوازي يكشف عن حلقتين علي الأقل تم الحصول عليهما من نفس الوعاء الدموي إلى ناهض ، واحده تحت ظروف السيطرة وواحده في وجود المثبط (ق) ؛ في كل حلقه سيتم تنفيذ منحني التركيز-الاستجابة مره واحده فقط. ويفضل اجراء تجارب موازيه ، لان هذا يوفر مراقبه أفضل لعمل الدواء وحساسية الاوعيه الدموية. التجارب التسلسلية الحصول علي منحني تركيز الاستجابة لناهض في حلقه واحده; غسلها ، وتغيير الظروف التجريبية (علي سبيل المثال ، أضافه مثبط) ، ومن ثم تكرار منحني استجابه التركيز علي نفس الحلبة. في هذه الحالة ، هناك حاجه إلى ضوابط الوقت لإظهار ان الاستجابات المخدرات ليست بسبب تغيرات الانسجه مع مرور الوقت. لا يمكن للمرء ان يكون علي يقين من ان النسيج هو في نفس الدولة تماما بعد التعرض لتجربه تركيز الاستجابة. الوقت الكافي (علي الأقل 30-60 دقيقه) يجب ان تعطي للسماح للقطاعات السفينة للعودة إلى التوتر الراحة (القاعدية) علي الرغم من انه في بعض الحالات ، وهذا قد لا يحدث علي الفور بعد تفكك ناهض التقارب عاليه من المستقبلات. الاضافه إلى ذلك ، يمكن تطبيق البوتاسيوم العالي Krebs بين منحنيات التركيز-الاستجابة التراكمية للحد من التحسس28. تذكر ان معظم الخصوم لا يمكن غسلها تماما ، التالي الحفاظ علي اضافته لبقية التجربة.

4-الارتخاءات/الانقباضات المعتمدة علي بطانة

  1. قبل التعاقد قطعه الشرايين شنت حديثا (كما هو موضح في الخطوات 3.2 إلى 3.5). مره أخرى ، تسجيل الاستجابة مقلص القصوى/التوتر إلى KCl عن طريق طرح التوتر خط الأساس من التوتر بسبب التحفيز KCl.
  2. اختياري احتضان الاستعدادات مع مثبطات synthase NO ، L-NAME (10-4 م) ، لمده 30 دقيقه قبل أضافه U46619.
  3. أضافه تركيزات محسوبة مسبقا من U46619 إلى الغرفة والسماح لانكماش مستقره ومستدامه من شرائح الشريان.
    ملاحظه: يتم الحث علي الاستجابات وعائي في الشرايين المساريقي قبل التعاقد علي حوالي 80 ٪ من الاستجابات القصوى ل 115 mM KCl. ويمكن استخدام منبات مختلفه للحث علي الانكماش عن طريق تفعيل مستقبلات محدده. هنا ، يتم التعاقد المسبق مع شرائح الاوعيه الدموية مع أو بدون PVAT مع U46619 (1 – 3 × 10-8 م ؛ جدول المواد) ، ناهض مستقبلات A2 الجلطة ، للحث علي انقباضات العضلات الملساء مستقره ومستدامه.
  4. أضافه تركيزات تراكمية من استيل (10- 10 إلى 10-4 م) إلى غرفه الأعضاء. وتعرض الاستجابات الوعائية المعتمدة علي التركيز لشرائح الشريان كنسبه مئوية من الاستجابات المقلصة المستحثة بالU46619 (الشكل 5).
    ملاحظه: بالنسبة لمعظم التجربة ، يجب أضافه التركيز التالي لناهض الاسترخاء علي الفور عند ملاحظه الهضبة لمنع انتعاش التوتر. يتم تطبيع الاستجابات الوعائية المعتمدة علي التركيز لشرائح الشريان كنسبه مئوية من الاستجابات المقلصة المستحثة لU46619 للتكيف مع الاختلافات الطفيفة في الإفراز والقطر بين أجزاء الشريان (الشكل 5). المتغيرات الصغيرة في الاستجابة بين الخواتم الفردية التي تم الحصول عليها من نفس الوعاء الدموي تصبح الحد الأدنى عندما يتم تحليل مجموعه من سته أو أكثر من التجارب إحصائيا. عند التعبير عن الاستجابات كنسبه مئوية من الانقباضات القصوى الخاصة بالانسجه الفردية ، فانه من المناسب استخدام تحليل مزدوج (علي سبيل المثال ، اختبار t للطالب المقترن) لمقارنه استجابات نفس النوع من الانسجه من الكائنات المختلفة مقارنه ردود من نسيج واحد قبل وبعد التدخل. عند تحليل تاثيرات PVAT ، يتم استخدام ANOVA ثنائيه الاتجاه متبوعا باختبار المقارنة المتعددة.
  5. بعد أضافه الجرعة النهائية من ناهض الاسترخاء ، وأزاله الدواء من كل غرفه وأعاده ملء مع العازلة الطازجة Krebs. اغسل الغرفة جيدا مع العازلة Krebs والسماح للشريان استقرار لمده لا تقل عن 45 دقيقه قبل اجراء اي تجارب اضافيه.

النتائج

فحص علاقات الطول/التوتر للحصول علي عامل التطبيع k

ويؤثر مقدار التمدد المطبق علي جزء السفينة علي مدي تفاعل اكتين-ميوسين ، التالي القوه النشطة القصوى التي طورت. التالي ، لكل نوع من الاوعيه الدموية ، وتحديد كميه التمدد اللازمة ...

Discussion

وبصرف الفضل عن الخلايا البطانية ، والإشارات المستمدة من PVAT تلعب دورا هاما في تنظيم العضلات السلس التفاعلات العضلية30. Pvat صحية النشرات لا والمضادة للالتهابات اديبونكتين لممارسه تاثير مضاد لمقلص علي الشرايين ، والتي تضيع في ظل الظروف المرضية مثل السمنة ومتلازمة الأيض

Disclosures

الكتاب ليس لديهم شيء للكشف عنه.

Acknowledgements

وكان هذا العمل دعما ماليا من خلال المنح المقدمة من مجلس منح البحوث في هونغ كونغ [17124718 و 17121714] ، وصندوق هونغ كونغ للبحوث الصحية والطبية [13142651 و 13142641] ، وصندوق البحوث التعاونية لهونغ كونغ [C7055] ، والوطنية الاساسيه برنامج البحوث في الصين [973 برنامج 2015 CB553603].

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
AcetylcholineSigma-AldrichA6625Stock concentration: 10-1 M
Working concentration: 10-10 to 10-5 M
L-NAME (Nω-nitro-L-arginine methyl ester)Sigma-AldrichN5751Stock concentration: 3 x 10-2 M
Working concentration: 10-4 M
PhenylephrineSigma-AldrichP6126Stock concentration: 10-2 M
Working concentration: 10-10 to 10-5 M
U46619 (9,11-dideoxy-9α,11αmethanoepoxy prostaglandin F2α)EnzoBML-PG023-0001Stock concentration: 10-5 M
Working concentration: 1-3 x 10-8 M
Multiwire myographDanish MyoTechnology (DMT)620M
PowerLab 4/26ADInstrumentsML848
Labchart7ADInstruments-
Adipo-SIRT1 wild type miceLaboratory Animal Unit, The University of Hong KongCULATR NO.: 4085-16
Silicon-coated Petri dishesDanish MyoTechnology (DMT)
Tungsten wiresDanish MyoTechnology (DMT)300331
Surgical tools

References

  1. Furchgott, R. F., Zawadzki, J. V. The obligatory role of endothelial cells in the relaxation of arterial smooth muscle by acetylcholine. Nature. 288 (5789), 373-376 (1980).
  2. Furchgott, R. F., Vanhoutte, P. M. Endothelium-derived relaxing and contracting factors. The FASEB Journal. 3 (9), 2007-2018 (1989).
  3. Feletou, M., Kohler, R., Vanhoutte, P. M. Endothelium-derived vasoactive factors and hypertension: possible roles in pathogenesis and as treatment targets. Current Hypertension Reports. 12 (4), 267-275 (2010).
  4. Vanhoutte, P. M. Endothelial dysfunction: the first step toward coronary arteriosclerosis. Circulation Journal. 73 (4), 595-601 (2009).
  5. Feletou, M., Huang, Y., Vanhoutte, P. M. Endothelium-mediated control of vascular tone: COX-1 and COX-2 products. British Journal of Pharmacology. 164 (3), 894-912 (2011).
  6. Harrison, D. G. Cellular and molecular mechanisms of endothelial cell dysfunction. Journal of Clinical Investigation. 100 (9), 2153 (1997).
  7. Vanhoutte, P. M., Shimokawa, H., Tang, E. H., Feletou, M. Endothelial dysfunction and vascular disease. Acta physiologica. 196 (2), 193-222 (2009).
  8. Klöß, S., Bouloumié, A., Mülsch, A. Aging and chronic hypertension decrease expression of rat aortic soluble guanylyl cyclase. Hypertension. 35 (1), 43-47 (2000).
  9. Csiszar, A., et al. Aging-induced phenotypic changes and oxidative stress impair coronary arteriolar function. Circulation Research. 90 (11), 1159-1166 (2002).
  10. Guo, Y., et al. Endothelial SIRT1 prevents age-induced impairment of vasodilator responses by enhancing the expression and activity of soluble guanylyl cyclase in smooth muscle cells. Cardiovascular Research. , (2018).
  11. Auch-Schwelk, W., Katusic, Z. S., Vanhoutte, P. M. Nitric oxide inactivates endothelium-derived contracting factor in the rat aorta. Hypertension. 19 (5), 442-445 (1992).
  12. Tang, E. H., Feletou, M., Huang, Y., Man, R. Y., Vanhoutte, P. M. Acetylcholine and sodium nitroprusside cause long-term inhibition of EDCF-mediated contractions. American Journal of Physiology - Heart and Circulation Physiology. 289 (6), H2434-H2440 (2005).
  13. Ghiadoni, L., et al. Endothelial function and common carotid artery wall thickening in patients with essential hypertension. Hypertension. 32 (1), 25-32 (1998).
  14. Xu, X., et al. Age-related Impairment of Vascular Structure and Functions. Aging and Disease. 8 (5), 590-610 (2017).
  15. Tabit, C. E., Chung, W. B., Hamburg, N. M., Vita, J. A. Endothelial dysfunction in diabetes mellitus: Molecular mechanisms and clinical implications. Reviews in Endocrine & Metabolic Disorders. 11 (1), 61-74 (2010).
  16. Tanaka, K., Sata, M. Roles of perivascular adipose tissue in the pathogenesis of atherosclerosis. Frontiers in Physiology. 9, 3 (2018).
  17. Brown, N. K., et al. Perivascular adipose tissue in vascular function and disease: a review of current research and animal models. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 34 (8), 1621-1630 (2014).
  18. Lohn, M., et al. Periadventitial fat releases a vascular relaxing factor. The FASEB Journal. 16 (9), 1057-1063 (2002).
  19. Gálvez-Prieto, B., et al. A reduction in the amount and anti-contractile effect of periadventitial mesenteric adipose tissue precedes hypertension development in spontaneously hypertensive rats. Hypertension research. 31 (7), 1415 (2008).
  20. Gao, Y. J., Lu, C., Su, L. Y., Sharma, A., Lee, R. Modulation of vascular function by perivascular adipose tissue: the role of endothelium and hydrogen peroxide. British Journal of Pharmacology. 151 (3), 323-331 (2007).
  21. Gao, Y. -. J., et al. Perivascular adipose tissue promotes vasoconstriction: the role of superoxide anion. Cardiovascular Research. 71 (2), 363-373 (2006).
  22. Szasz, T., Webb, R. C. Perivascular adipose tissue: more than just structural support. Clinical Science (London). 122 (1), 1-12 (2012).
  23. Ramirez, J. G., O'Malley, E. J., Ho, W. S. V. Pro-contractile effects of perivascular fat in health and disease. Brish Journal of Pharmacology. 174 (20), 3482-3495 (2017).
  24. Hajer, G. R., van Haeften, T. W., Visseren, F. L. Adipose tissue dysfunction in obesity, diabetes, and vascular diseases. European Heart Journal. 29 (24), 2959-2971 (2008).
  25. Mulvany, M. J., Halpern, W. Contractile properties of small arterial resistance vessels in spontaneously hypertensive and normotensive rats. Circulation Research. 41 (1), 19-26 (1977).
  26. Mulvany, M. J., Halpern, W. Mechanical properties of vascular smooth muscle cells in situ. Nature. 260 (5552), 617-619 (1976).
  27. del Campo, L., Ferrer, M. Wire myography to study vascular tone and vascular structure of isolated mouse arteries. Methods in Molecular Biology. 1339, 255-276 (2015).
  28. Dobrin, P. B. Influence of initial length on length-tension relationship of vascular smooth muscle. American Journal of Physiology. 225 (3), 664-670 (1973).
  29. Xu, C., et al. Calorie restriction prevents metabolic aging caused by abnormal SIRT1 function in adipose tissues. Diabetes. 64 (5), 1576-1590 (2015).
  30. Sheykhzade, M., Nyborg, N. C. Caliber dependent calcitonin gene-related peptide-induced relaxation in rat coronary arteries: effect of K+ on the tachyphylaxis. European Journal of Pharmacology. 351 (1), 53-59 (1998).
  31. Soltis, E. E., Cassis, L. A. Influence of perivascular adipose tissue on rat aortic smooth muscle responsiveness. Clinical and Experimental Hypertension A. 13 (2), 277-296 (1991).
  32. Lohn, M., et al. Periadventitial fat releases a vascular relaxing factor. FASEB Journal. 16 (9), 1057-1063 (2002).
  33. Fesus, G., et al. Adiponectin is a novel humoral vasodilator. Cardiovascular Research. 75 (4), 719-727 (2007).
  34. Greenstein, A. S., et al. Local inflammation and hypoxia abolish the protective anticontractile properties of perivascular fat in obese patients. Circulation. 119 (12), 1661-1670 (2009).
  35. Yudkin, J. S., Eringa, E., Stehouwer, C. D. "Vasocrine" signalling from perivascular fat: a mechanism linking insulin resistance to vascular disease. Lancet. 365 (9473), 1817-1820 (2005).
  36. Xia, N., et al. Uncoupling of endothelial nitric oxide synthase in perivascular adipose tissue of diet-induced obese mice. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 36 (1), 78-85 (2016).
  37. Xia, N., Forstermann, U., Li, H. Effects of resveratrol on eNOS in the endothelium and the perivascular adipose tissue. Annals of the New York Academy of Sciences. 1403 (1), 132-141 (2017).
  38. Schinzari, F., Tesauro, M., Cardillo, C. Endothelial and perivascular adipose tissue abnormalities in obesity-related vascular dysfunction: novel targets for treatment. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 69 (6), 360-368 (2017).
  39. Liu, J. T., et al. Lipocalin-2 deficiency prevents endothelial dysfunction associated with dietary obesity: role of cytochrome P450 2C inhibition. British Journal of Pharmacology. 165 (2), 520-531 (2012).
  40. Martinez-Quinones, P., et al. Hypertension induced morphological and physiological changes in cells of the arterial wall. American Journal of Hypertension. 31 (10), 1067-1078 (2018).
  41. Outzen, E. M., et al. Translational value of mechanical and vasomotor properties of mouse isolated mesenteric resistance-sized arteries. Pharmacology Research and Perspectives. 3 (6), e00200 (2015).
  42. Sheykhzade, M., Simonsen, A. H., Boonen, H. C., Outzen, E. M., Nyborg, N. C. Effect of ageing on the passive and active tension and pharmacodynamic characteristics of rat coronary arteries: age-dependent increase in sensitivity to 5-HT and K+. Pharmacology. 90 (3-4), 160-168 (2012).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

148

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved