تسجيل بصري ذو صورة واحدة في شرائح الدماغ باستخدام صبغ حساس للجهد الكهربائي

Summary

نحن نقدم طريقة تسجيل بصري قابل للتكرار ومستقرة لشرائح الدماغ باستخدام صبغة حساسة للجهد. تصف المقالة تلطيخ الصبغة الحساسة للجهد الكهربائي وتسجيل الإشارات البصرية باستخدام الاستعدادات التقليدية لشريحة الحصين.

Abstract

واسعة المجال واحد الفوتون الجهد الحساسة صبغ (VSD) التصوير من الاستعدادات شريحة الدماغ هو أداة مفيدة لتقييم الاتصال الوظيفي في الدوائر العصبية. بسبب التغير الجزئي في إشارة الضوء، كان من الصعب استخدام هذه الطريقة كتحليل كمي. توضح هذه المقالة البصريات الخاصة وأنظمة معالجة الشرائح، مما يجعل هذه التقنية مستقرة وموثوق بها. توضح هذه المقالة التعامل مع شريحة، تلطيخ، وتسجيل شرائح الحصين الملطخة VSD بالتفصيل. يحافظ النظام على الظروف الفسيولوجية لفترة طويلة، مع تلطيخ جيد، ويمنع الحركات الميكانيكية للشريحة أثناء التسجيلات. وعلاوة على ذلك، فإنه يتيح تلطيخ شرائح مع كمية صغيرة من الصبغة. تحقق البصريات فتحة رقمية عالية عند التكبير المنخفض، مما يسمح بتسجيل إشارة VSD بمعدل إطار أقصى قدره 10 كيلو هرتز، مع دقة مكانية 100 بكسل × 100 بكسل. ونظرا لارتفاع معدل الإطار والدقة المكانية، تسمح هذه التقنية بتطبيق مرشحات ما بعد التسجيل التي توفر نسبة كافية من الإشارة إلى الضوضاء لتقييم التغيرات في الدوائر العصبية.

Introduction

وقد أصبح واسعة المجال واحد الفوتون الحساسة للفولطية الحساسة (VSD) التصوير من الاستعدادات شريحة الدماغ الملطخة بالجملة أداة كمية مفيدة لتقييم ديناميات الدوائر العصبية^1،2،3،4 . بعد تحليل التغيرات في الخصائص البصرية بسبب الإثارة الغشاء^5,6,7, تم وصف التصوير VSD لأول مرة في أوائل 1970s من قبل كوهين وآخرون^{6,8, 9}. وهو طريقة مناسبة لمراقبة وظائف الدماغ في الوقت الحقيقي كما الصبغة تحقيقات مباشرة التغيرات المحتملة غشاء (أي، إشارة أساسية من الخلايا العصبية).

يمتلك أقرب VSDs الخصائص المرغوبة لفهم نظام الدماغ، مثل سريع الوقت ثابت لمتابعة الحركية السريعة للأحداث المحتملة غشاء الخلايا العصبية، والخطي مع التغير في الغشاء المحتملة^{9، 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15}. على غرار تجارب التصوير الأخرى، تتطلب هذه التقنية مجموعة واسعة من التوليفات المحددة، مثل الكاميرات والبصريات والبرمجيات وعلم وظائف الأعضاء، لتحقيق النتائج المرجوة. وبسبب هذه المزالق التقنية، لم تتحقق بالضرورة الفوائد المتوقعة خلال الجهود الأولية بالنسبة لمعظم المختبرات التي لم تكن متخصصة في هذه التقنية.

كان السبب الأولية للصعوبة التقنية ضعف حساسية VSD تجاه التغير المحتمل للغشاء عند تطبيقه على تلطيخ الجزء الأكبر من الاستعدادات شريحة. حجم الإشارة البصرية (أي التغير الكسري في الفلورية) عادة مايكون 10-4 -10^-3 من إشارة التحكم (F0) تحت الظروف الفسيولوجية. المقياس الزمني للتغير المحتمل في الغشاء في الخلايا العصبية هو ما يقرب من ميلي ثانية إلى بضع مئات من مللي ثانية. لقياس التغيرات في التغيرات في الغشاء المحتمل للخلايا العصبية، يجب أن تكون الكاميرا المستخدمة للتسجيل قادرة على الحصول على صور بسرعة عالية (10 كيلو هرتز إلى 100 هرتز). تتطلب الحساسية المنخفضة لـ VSD والسرعة اللازمة لمتابعة الإشارة العصبية كمية كبيرة من الضوء ليتم جمعها في الكاميرا بسرعة عالية، مع نسبة إشارة إلى ضوضاء عالية (S/N)^2،16.

كما أن بصريات نظام التسجيل عنصر حاسم لضمان جمع الضوء الكافي وتحسين S/N. التكبير الذي تحققه البصريات غالبا ما يكون منخفضا بشكل مفرط، مثل 1X إلى 10X، لتصور الدائرة العصبية الوظيفية المحلية. على سبيل المثال، لتصور ديناميات الدائرة الحصين، فإن التكبير من حوالي 5 سيكون مناسبا. مثل هذا التكبير منخفضة منخفضة الكفاءة الفلورسنت; لذلك، فإن البصريات المتقدمة تكون مفيدة لمثل هذا التسجيل.

وبالإضافة إلى ذلك، فإن الفسيولوجيا شريحة ضرورية أيضا. وبما أن تحليل التصوير يتطلب أن تكون الشرائح سليمة، فإن هناك حاجة إلى التعامل مع شريحة دقيقة¹⁷. وعلاوة على ذلك، فإن التدابير المتخذة للحفاظ على صلاحية الشريحة لفترة أطول هي¹⁸.

تصف هذه المقالة بروتوكول إعداد الشرائح، تلطيخ VSD، والقياسات. كما توضح المقالة التحسينات التي أدخلت على VSDs وجهاز التصوير والبصريات، وغيرها من التحسينات الإضافية للنظام التجريبي التي مكنت من استخدام هذه الطريقة كاختبار مباشر وقوي وكمي لتصور تعديل وظائف الدماغ^{19,20,21,22,23,24,25}. ويمكن أيضا أن تستخدم هذه التقنية على نطاق واسع للتقوية على المدى الطويل في منطقة CA1 من شرائح الحصين¹. وعلاوة على ذلك، هذه التقنية هي أيضا مفيدة في التسجيل البصري لإمكانات الغشاء في خلية عصبية واحدة²⁶.

Protocol

وقد أجريت جميع التجارب على الحيوانات وفقا للبروتوكولات التي وافقت عليها لجنة رعاية الحيوانات واستخدامها في جامعة توكوشيما بونري. البروتوكول التالي لإعداد شريحة هو تقريبا إجراء قياسي²⁷ ، ولكن التعديلات كانت بروتوكولات تلطيخ وتسجيل مع VSD.

1. التحضير قبل يوم التجربة

1. إعداد المخزون A(الجدول 1) ، والمخزون B (الجدول2)، والمخزون C (الجدول3) الحلول وتخزينها في الثلاجة.
2. إعداد 1 لتر من السائل الدماغي الشوكي الاصطناعي (ACSF) (الجدول4، انظر الخطوة 3) والاحتفاظ بها في الثلاجة.
3. إعداد 1 لتر من ACSF المعدلة (الجدول5)والاحتفاظ بها في الثلاجة.
4. يوزع 500 لتر من مصل جنين البقر (FBS) في قنينات مل2 ويخزن في الفريزر.
5. قم بـِتَب4% من مسحوق الأجار في ACSF (120 مل تقريباً) في الميكروويف وصبّه في طبق بتري القابل للتصرف بـ 90 مم. يجب تبريد طبق الأجار قبل الاستخدام الإضافي.
6. ضع العناصر التالية في الثلاجة في اليوم السابق للتجربة: صينية جراحية، وعاء تقطيع وكتلة تبريد من الألومنيوم (120 × 120 × 20 مم^3).
7. تأكد من وجود حلقات زجاج شبكي كافية مع مرشحات غشاء لشريحة نظام التعامل مع^17،28 (انظر الخطوة 6.12).
8. قم بـِتَبَب 2% من مسحوق الأجار في 50 مل من 3 م كل في الميكروويف. تناول حوالي 85 ميكرولتر من الذوبان الدافئ من أجار-كي كل في 200 ميكروبليت باستخدام ميكروبليت للقطب الكهربائي. فصل طرف في أجار لا يزال دافئ 3 M KCl هلام. كرر الخطوة لملء حوالي 20-40 نصائح مع 2% أجار.

2. إعداد VSD (di-4-ANEPPS) حل المخزون

1. إعداد 1 مل من 10٪ بوليثوكسيدلاتيد حل زيت الخروع مع الماء النقي جدا.
2. إضافة 1 مل من الإيثانول إلى قارورة من دي-4-ANEPPS (5 ملغ قارورة)، دوامة وسونيكات لمدة 10 دقيقة. سوف يتحول الحل إلى لون أحمر عميق مع بقايا صغيرة ممكنة من بلورات DI-4-ANEPPS.
   ملاحظة: الإيثانول المستخدمة في هذه الخطوة ينبغي أن تفتح حديثا.
3. نقل الحل إلى ميكروتيوب 2 مل مع O-حلقة. تدور أسفل الحل وإضافة 500 ميكرولتر من 10٪ بوليثوكسيدلاتيد حل زيت الخروع.
   ملاحظة: الصبغة هو يدهون للغاية. ويمكن أيضا أن تستخدم DMSO وpoloxamer لحل دي-4-ANEPPS ولكن من حيث الإشارة البصرية عند التغيير في الغشاء المحتملة، وجدنا أن استخدام الإيثانول -بوليثوكسيدلاتيد زيت الخروع يعطي إشارة أفضل إلى نسبة الضوضاء. هذا يمكن أن تكون ذات صلة إلى معدل نقل المذيبات إلى غشاء الخلية.
4. دوامة وسونيكات حتى الصبغة قد حلت تماما.
5. تجنب التعرض للضوء وإبقائه في الثلاجة. لا تخزن في الثلاجة. يمكن أن تستمر الأسهم لبضعة أشهر.
   ملاحظة: في يوم التجربة، اتبع الخطوات 3-9.

3- الإعداد اليومي لـ ACSF (1 L) (الجدول 4)

1. وزن كلوريد الصوديوم،NAHCO 3، والجلوكوز في قارورة.
2. أضف 950 مل من الماء المقطر إلى القارورة وابدأ بالفقاعة مع غاز ثاني₂ بنسبة 95%
3. إضافة 2.5 مل من المخزون حل للقارورة واحتضان لمدة 10 دقيقة تقريبا في درجة حرارة الغرفة.
4. إضافة 2.5 مل من محلول C المخزون إلى قارورة.
5. إضافة الماء المقطر لجعل الحل إلى 1 لتر.

4. تحضير يومي للتلطيخ VSD Ssolution

1. Sonicate قارورة 500 ميكرولتر من فبس وVSD حل الأسهم (الخطوة 2) في سونيكاتور فائقة لمدة 5 دقائق.
2. إضافة 500 μL من ACSF أعدت حديثا في قارورة FBS.
3. إضافة 20 (في حالة الفئران) أو 40 (في حالة الفئران) μL من حل المخزون VSD إلى القارورة.
4. فائقة سونيكات ودوامة القارورة حتى يصبح الحل البرتقالي شاحب.

5. التحضير للجراحة

1. خذ 100 مل من ACSF المبردة بشكل منفصل في وعاء من الفولاذ المقاوم للصدأ 300 مل، وكوب سعة 300 مل، وحاوية بلاستيكية، ووضعها في الثلاجة. صب 150 مل من المبردة تعديلACSF (الجدول 2) في كوب آخر ووضعها في الثلاجة. انتظر حتى يتم تبريد الحلول؛ الوقت الذي استغرقه يجب أن يقاس ويحدد مسبقاً.
2. أضعاف لكسر شفرة الحلاقة (الكربون الصلب، الصناعية الصف 0.13 مم سميكة، شفرة على كلا الجانبين) إلى نصف لتقطيع اللحم.
   ملاحظة: يمكن استخدام النصف الآخر للتشريح مع حامل شفرة مناسبة.
3. إعداد كتلة من ACSF 4٪ أجار لوحة مع تهزهز تعديل (الشكل 1).
4. إعداد غرفة حضانة رطبة (غرفة نوع واجهة؛ تعديل 1.2 L مربع مختومة ضيق مع التعبئة سيليكون)للحفاظ على شرائح الدماغ على قيد الحياة من الناحية الفسيولوجية (الشكل 2)؛ أضف ACSF في حاوية صغيرة وكربونات مع 95% O₂/5% CO₂ gas، وملء طبق بيتري 90 مم × 20 مم مع ACSF في الأعلى.
   ملاحظة: يجب وضع طبق بيتري أصغر (60 مم × 20 مم) في وسط طبق 90 مم لدعم ورقة مرشح على الطبق.
5. وضع مربع على جهاز التدفئة وانتظر لمدة 20 دقيقة لتسخينه حتى 28 درجة مئوية.
6. يُضاف الثلج المسحوق إلى وعاء تقطيع اللحم. ضع الأدوات التالية في وعاء من الفولاذ المقاوم للصدأ (صغير) على الجليد: مشرط، حامل شفرة، ملاقط حلقة، كتلة أجار، ومرحلة من تقطيع اللحم. الحفاظ على ACSF المجمدة وتعديل ACSF على الجليد والفقاعة مع 95٪ O₂/5٪ CO₂ الغاز (ويعرف أيضا باسم. كاربوجين).
7. ضع الأدوات التالية في ضريبة القيمة المضافة (كبيرة): مقص (كبير، صغير)، ملاقط، ملعقة، ملعقة، كماشة قطري.

6. جراحة (الفئران)

1. تخدير الماوس باستخدام isoflurane في غطاء محرك الدخان. تقييم مستوى التخدير عن طريق التحقق من رد فعل دواسة الحيوان على قرصة إصبع القدم.
2. قم بقطع رأس الفأر وغمر الرأس في ACSF المثلج في صينية جراحية من الفولاذ المقاوم للصدأ.
3. استخراج الدماغ في غضون 1 دقيقة ووضعها في كوب يحتوي على ACSF المبردة لمدة 5 دقائق.
4. تأخذ الدماغ من الكأس و, باستخدام مشرط, تقليم كتلة الدماغ (الشكل 3A).
5. ضع كتلة الدماغ على كتلة أجار 4٪ (الخطوة 5.3، الشكل 3B). يمكن تركيب نصفي الكرة الأرضية على كتلة أجار. امسح الـ ACSF الزائدة من الكتلة بورقة تصفية.
6. تطبيق لاصق ةيلائع (سوبر الغراء) على الجدول تقطيع اللحم. ضع كتلة الأجار عليها وامسح اللصق الزائد باستخدام ورقة فلتر.
7. تطبيق بلطف كمية صغيرة من ACSF الجليد الباردة (~5 مل) باستخدام ماصة من الجزء العلوي من كتلة الدماغ أجار. وهذا سوف يساعد على ترسيخ الغراء السوبر الزائدة ومنع الغراء من تغطية الدماغ وإزعاج التقطيع.
8. إصلاح الجدول تقطيع اللحم إلى صينية تقطيع اللحم (الشكل3C)وصب ACSF المعدلة.
9. تعيين تقطيع اللحم إلى سرعة بطيئة، مع تردد شفرة في الحد الأقصى.
10. تعيين شريحة سمك إلى 350-400 ميكروم والبدء في تقطيع (الشكل3C). ضع الشرائح على زاوية صينية الشرائح في تسلسل، بحيث يمكن تمييز عمق الشرائح بسهولة. عادة ما يمكن الحصول على ثلاث إلى خمس شرائح من نصف الكرة الأرضية.
11. قطع جزء جذع الدماغ باستخدام إبرة 30 G (الشكل 3D).
    ملاحظة: يجب إجراء الجراحة المجهرية على شريحة الدماغ مثل قطع بين الحدود CA3-CA1 في هذه المرحلة تحت مجهر منظار، إذا لزم الأمر.
12. باستخدام فرشاة طلاء صغيرة، ضع الشريحة في وسط مرشح الغشاء (0.45 ميكروم المسام، PTFE-الغشاء، 13 مم قطر) عقد مع حلقة زجاج شبكي¹⁷ (15 مم القطر الخارجي، 11 مم قطرها الداخلي، 1 مم سمك، الشكل 3E). وضع حلقة في غرفة الانتعاشرطبة (الشكل 2) وتأمين الغطاء للحفاظ على الضغط الداخلي عالية.
    ملاحظة: سوف تمسك الشرائح بالغشاء في غضون 30 دقيقة ويمكن التعامل معها مع الحلقات في الخطوات اللاحقة في غرفة التسجيل. ليس هناك حاجة لاستخدام الأوزان أو تدابير أخرى للحفاظ على شريحة في مكانها.
13. ضبط اتجاه وموضع الشريحة في الحلبة لضمان أنها تركز بشكل جيد ولها اتجاه ثابت (انظر الخطوة 9.3).
14. اترك العينة عند درجة حرارة 28 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، ثم في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 إلى 30 دقيقة على الأقل لاسترداد الشرائح.
    ملاحظة: يمكن للشرائح الآن الاحتفاظ بحالة فسيولوجية جيدة على الأقل لمدة 15 ساعة.

7. تلطيخ والرين من شرائح (الفئران)

1. ضعي 100-110 ميكرولتر من محلول تلطيخ (الخطوة 4) برفق على كل شريحة على الحلبة باستخدام ميكروبليت. ثمانية إلى تسع شرائح يمكن أن تكون ملطخة مع محلول تلطيخ واحد أعدت في الخطوة 4. اترك الشرائح لمدة 20 دقيقة لتلطيخها.
2. إعداد 50-100 مل من ACSF في وعاء ووضع حلقة مع عينة شرائح في ذلك لشطف محلول تلطيخ.
3. قم بتخزين الشريحة المشطة إلى غرفة حضانة أخرى. انتظر أكثر من 1 ساعة للتعافي قبل التجربة.
   ملاحظة: يمكن فصل غرفة الحضانة عن الغاز ونقلها إلى مكان التسجيل في حالة محكمة الإغلاق. يمكن أن تبقى الشريحة على قيد الحياة لمدة 20 دقيقة على الأقل دون إمدادات الغاز. هذا مفيد في حال كنت بحاجة إلى نقل شريحة إلى مكان آخر للتسجيل.

8. تحضير يومي لجهاز تجريبي

1. قم بتشغيل مكبر الصوت والكمبيوتر ونظام الكاميرا، وتحقق من تشغيل البرنامج.
2. ضع ACSF في أنبوب 50 مل وفقاعة مع الكاربوجين.
3. استخدام مضخة التمعجية لتعميم ACSF. ضبط معدل التدفق إلى ما يقرب من 1 مل / دقيقة.
4. ضبط ارتفاع ماصة شفط بحيث مستوى السائل داخل غرفة التجربة هو دائما ثابتة.
   ملاحظة: مستوى الحل مهم للحصول على تسجيل مستقر، وبالتالي، ينبغي أن يتم التعديل باستخدام micromanipulator.
5. تثبيت القطب الأرض تتكون من رقاقة صفراء مليئة 3 M KCl أجار (2٪ (الخطوة 1.8) إلى حامل مع سلك Ag-AgCl مع كمية صغيرة من 3 M KCl الحل.
6. ملء كمية صغيرة من ACSF (حوالي ثلثي حجم) في القطب الزجاجي (1 مم القطر الخارجي، 0.78 مم القطر الداخلي سحبت مع سحب micropipette) باستخدام طرف مدبب رقيقة أنابيب صفراء ووضعها في حامل القطب.
7. إرفاق حامل إلى قضيب تثبيت في المتلاعب. تأكد باستخدام مكبر للصوت أن مقاومة القطب الكهربائي هو ما يقرب من 1 MΩ.
   ملاحظة: يجب أن يكون القطب الكروي الواسع الذي يفتح على نطاق واسع طويل الساق (4-8 ميكرومتر) من نوع الرقعة جيدًا لتسجيل الحقل وكقطب محفز.

9. بدء جلسة تسجيل

1. تأخذ إعداد شريحة من غرفة رطبة مع ملقط.
2. وضع شريحة بسرعة على غرفة تجريبية تحت المجهر (الشكل 4).
3. دفع حافة الحلبة بحزم في سيليكون O-حلقة. يجب الحرص على عدم كسر الغشاء أو الجزء السفلي من غرفة التجربة.
   ملاحظة: وينبغي أن يؤخذ اتجاه الشريحة في الاعتبار فيما يتعلق باتجاه الأقطاب الكهربائية المحفزة والتسجيل في مجال الرؤية. يجب أن شريحة صحية التمسك مرشح غشاء حتى لا تكون هناك حاجة لاستخدام الأجهزة الأخرى لإصلاح شرائح مثل الأوزان والنايلون.
4. ضع طرف القطب المحفز والقطب المحتمل لتسجيل الحقل على الشريحة تحت المجهر مع الضوء المنقول.
5. استخدام نظام التسجيل الكهربي للتحقق من الاستجابة. تأكيد المعتاد (غير ملطخة) تسجيل الكهربيمع تكوين معين.
   ملاحظة: يمكن حذف قطب التسجيل ولكن مفيد للتحقق من علم وظائف الأعضاء من شريحة.
6. قم بضبط كثافة ضوء الإثارة إلى ما يقرب من 70-80% من السعة القصوى في الكاميرا التي تتوافق مع 13-15 ميغاواط/سم² عند العينة عند أخذ العينات بسرعة 10 كيلو هرتز مع عدسة موضوعية للغمر المائي 5 مرات وعدسة أنبوبية 1x PLAN APO. الإثارة ضوء الطول الموجي هو 530 نانومتر، ويجب أن يكون مرشح الانبعاثات > 590 نانومتر.
   ملاحظة: استخدم مصراع لتقليل كمية ضوء الإثارة. التعرض المستمر للضوء قد تتدهور شريحة الفسيولوجيا. تأثير الضرر المحتمل للضوء يعتمد على شدة ومدة الضوء. استخدام تسجيل الكهربية للحكم على تأثير الضوء. في حالة قوة 13-15 mW/cm²، يجب أن يكون التعرض حوالي 1 s الحد الأعلى للتسامح.
7. ضبط التركيز مع نظام الاستحواذ باستخدام مصدر الضوء الفلورسنت لأن التركيز قد تكون مختلفة اعتمادا على الطول الموجي وبدء الاستحواذ.
8. فحص البيانات في برنامج الحصول على صورة.
   ملاحظة: استخدمنا الحزمة الأصلية microprogramming من برامج التحليل العددي لتحليل مفصل.

النتائج

ويبين الشكل 5 الإشارة البصرية التمثيلية عند التحفيز الكهربائي لضمانات شافر في المنطقة CA1 لشريحة فرس النهر. الصور المتتالية في الشكل 5A تظهر الإشارة البصرية قبل تطبيق أي مرشحات مكانية وزمنية، في حين يظهر الشكل 5B نفس البيانا?...

Discussion

الفسيولوجيا شريحة أمر حيوي لجمع الإشارة الصحيحة. استخدام نظام تصفية غشاء حلقة في هذا البروتوكول يضمن أن شريحة لا تزال صحية وغير مشوهة في جميع أنحاء الإجراء^2,16,17. يمكن استخدام أنظمة أخرى للاحتفاظ بشريحة وظائف الأعضاء أثناء التسجيل، ولكن ي?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
High speed image acquisition system	Brainvision co. Ltd.	MiCAM - Ultima	Imaging system
High speed image acquisition system	Brainvision co. Ltd.	MiCAM 02	Imaging system
Macroscepe for wide field imaging	Brainvision co. Ltd.	THT macroscope	macroscope
High powere LED illumination system with photo-diodode stablilizer	Brainvision co. Ltd.	LEX-2G	LED illumination
Image acquisition software	Brainvision co. Ltd.	BV-ana	image acquisition software
Multifunctional electric stimulator	Brainvision co. Ltd.	ESTM-8	Stimulus isolator+AD/DA converter
Slicer	Leica	VT-1200S	slicer
Slicer	Leica	VT-1000	slicer
Blade for slicer	Feather Safety Razor Co., Ltd.	#99027	carbon steel razor blade
Membrane filter for slice support	Merk Millipore Ltd., MA, USA	Omnipore, JHWP01300, 0.45 µm pores,	membrane filter/0.45 13
Numerical analysis software	Wavemetrics Inc., OR, USA	IgorPro	analysing software
Stimulation isolator	WPI Inc.	A395	Stimulus isolator
AD/DA converter	Instrutech	ITC-18	AD/DA converter
Voltage sensitive dye Di-4-ANEPPS	Invitrogen, Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	catalog number: D-1199	VSD: Di-4-ANEPPS
Poloxamer	Invitrogen, Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	Pluronic F-127 P30000MP	poloxamer/Pluronic F-127 (20% solution in DMSO)
Polyethoxylated castor oil	Sigma-Aldrich	Cremophor EL C5135	polyethoxylated castor oil