JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نعرض طريقة لتشريح وتشريح نماذج سرطان البروستاتا الماوس، مع التركيز على تشريح ورم البروستاتا. كما يتم تقديم بروتوكول خطوة بخطوة لتوليد الأعضاء ورم البروستاتا الماوس.

Abstract

وقد أدت الأساليب القائمة على إعادة التركيب المتجانس لتعديل الجينات إلى تعزيز البحوث البيولوجية إلى حد كبير. نماذج الماوس المهندسة وراثيا (GEMMs) هي طريقة صارمة لدراسة تطور الثدييات والمرض. وقد طور مختبرنا العديد من GEMMs من سرطان البروستاتا (PCa) التي تفتقر إلى التعبير عن واحد أو عدة جينات قمع الورم باستخدام موقع محدد Cre-loxP نظام إعادة الكومبوماومر والمروج البروستاتا محددة. في هذه المقالة، ونحن نصف طريقتنا لnecropsy من هذه GEMMs PCa، مع التركيز في المقام الأول على تشريح أورام البروستاتا الماوس. وقد سهلت الأساليب الجديدة التي تم تطويرها على مدى العقد الماضي ثقافة الخلايا المستمدة من الظهارة إلى نموذج أنظمة الأعضاء في المختبر في ثلاثة أبعاد. كما نقوم بتفصيل طريقة زراعة الخلايا ثلاثية الدنابية لتوليد أعضاء الورم من الماوس PCa GEMMs. وقد هيمنت أبحاث السرطان قبل السريرية من قبل ثقافة الخلايا 2D ونماذج xenograft المستمدة من خط الخلية أو المريض المستمدة. هذه الطرق تفتقر إلى البيئة الدقيقة الورم، والحد من استخدام هذه التقنيات في الدراسات ما قبل السريرية. GEMMs هي أكثر أهمية من الناحية الفسيولوجية لفهم الأورام وتطور السرطان. ثقافة الجهاز الورم هو نظام نموذج في المختبر الذي يلخص الهندسة المعمارية الورم وخصائص سلالة الخلية. وبالإضافة إلى ذلك، تسمح أساليب زراعة الخلايا ثلاثية الدمن بنمو الخلايا الطبيعية للمقارنة مع ثقافات الخلايا السرطانية، ونادراً ما يكون ذلك ممكناً باستخدام تقنيات زراعة الخلايا ثلاثية الد. في تركيبة، استخدام GEMMs وثقافة الخلايا ثلاثية الد في الدراسات ما قبل السريرية لديه القدرة على تحسين فهمنا لبيولوجيا السرطان.

Introduction

منذ أواخر الثمانينات، وقد تقدمت القدرة على تغيير الجينات عن طريق إعادة تركيب متجانسة إلى حد كبير دراسة النظم البيولوجية1. وقد تقدمت الدراسات الجينية من خلال تسهيل السيطرة على التعديلات الجينية من الناحيتين الزمنية والمكانية2و3، 4. وقد خلق الجمع بين هذه الاستراتيجيات الوراثيةمجموعة واسعة من أنظمة النماذج التجريبية 5،6،7.

نماذج الماوس المهندسة وراثيا (GEMMs) هي أداة متكاملة لتقييم كيفية تأثير الجينات الفردية أو مجموعات الجينات على نمو الثدييات والمرض. في أبحاث السرطان قبل السريرية، GEMMs هي الطريقة الأكثر أهمية من الناحية الفسيولوجية وصارمة لدراسة تطور السرطان، والتقدم، والعلاج8. لدينا مختبر متخصص في توليد وتميز السرطان GEMMs.

السرطان غير الجلدي الأكثر تشخيصا ً بين الرجال في الولايات المتحدة هو سرطان البروستاتا (PCa). غالبية المرضى الذين يعانون من مرض PCa يعانون من مرض منخفض المخاطر واحتمال كبير للبقاء على قيد الحياة، ولكن معدلات البقاء على قيد الحياة تنخفض بشكل كبير عندما يتم تشخيص المرض في مراحل متقدمة أو إذا كان العلاج الهرموني المستهدف يحفز على التقدم إلى العدوانية، غير قابلة للشفاء PCa الأنواع الفرعية9،10. وقد وضعت مختبرنا GEMMs التي تستخدم الأليلات floxed من واحد أو أكثر من الجينات قمع الورم. إعادة تركيب وفقدان التعبير الجيني المثبط للورم يحدث على وجه التحديد في البروستاتا لأننا قد أدخلت transgene مع Cre recombinase المصب من المروج probasin تفعيلها فقط في الخلايا الظهارية البروستاتا11، 12.لقد ولدت أيضا لدينا GEMMs لاحتواء transgene مراسل كري دعا mT / mG، الذي يحفز الطماطم التعبير البروتين الفلورسنت في الخلايا التي تفتقر إلى Cre والأخضر بروتين الفلورسنت (GFP) التعبير في الخلايا مع كري13. في حين أن عرض هذه الطريقة ونتائجنا التمثيلية تظهر GEMMs ندرس في مختبرنا، يمكن استخدام هذا البروتوكول لتوليد الأعضاء سرطان البروستاتا من أي نموذج الماوس. ومع ذلك، كما نوقش بالتفصيل في قسم النتائج التمثيلية لدينا، لاحظنا أن بعض خصائص الورم هي الأمثل لتوليد سرطان البروستاتا العضوية.

في العقد الماضي ، أدت أساليب جديدة لزراعة الخلايا من الأنسجة ذات المنشأ الظهاري إلى تقدم كبير في قدرتنا على نموذج أنظمة الأعضاء في المختبر14،15. وقد عُزي مصطلح "ثقافة الخلايا ثلاثية الأبعاد" إلى التقنيات التي ينطوي عليها إنشاء الأعضاء وصيانتها، والتي يمكن تعريفها عموماً بأنها هياكل تتكون من خلايا تجمع الهندسة المعمارية الثانوية التي تحركها سلالة الخلايا الخاصة بالأعضاء. 16. هذه الأساليب الجديدة تختلف عن الكلاسيكية 2D ثقافة الخلية في أن الخلايا لا تتطلب التحول أو الخلود للنمو على المدى الطويل. وهكذا، يمكن مقارنة الثقافات 3D من الخلايا الطبيعية إلى الخلايا المريضة. وهذا أمر ذو قيمة خاصة في أبحاث السرطان حيث الثقافات العادية للسيطرة على الخلايا عادة لم تكن متاحة. وبالإضافة إلى ذلك، تشكل الأعضاء تلقائيا الأنسجة الثانوية مع أنواع الخلايا المتمايزة بشكل مناسب، مما يجعلها أفضل نظام نموذج لفهم السرطان في المختبر من خطوط الخلايا 2D17. وقد أنشأ مختبرنا خطوط عضوية ثلاثية الدنابية من قضية الورم معزولة عن نظام PCa GEMMs لدينا لاستكمال بياناتنا في الجسم الحي وإجراء التجارب التي لن تكون مجدية في GEMMs.

في هذه المقالة، نقدم بروتوكولات مكتوبة ومرئية للنخر الكامل من GEMMs PCa، بما في ذلك تشريح فصوص البروستاتا الماوس متميزة والآفات النقيلية. نحن نصف ونظهر طريقة خطوة بخطوة لتوليد الأوجانات من أورام البروستاتا الماوس على أساس بروتوكول نشر سابقا من قبل Drost وآخرون لاشتقاق اتوجينيات من الأنسجة الظهارية البروستاتا الماوس العادي18.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

تم تنفيذ الإجراءات الحيوانية الموصوفة هنا بموافقة اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها (IACUC) في قسم الموارد الحيوانية المختبرية، مركز روزويل بارك الشامل للسرطان، بوفالو، نيويورك.

ملاحظة: الفئران الذكور التي سيتم تشريحها لعزل البروستاتا أو أورام البروستاتا لتوليد من الأعضاء يجب أن يكون على الأقل قد وصلت إلى سن النضج الجنسي — حوالي 8-10 أسابيع من العمر. يمكن أن تختلف أعمار محددة من الفئران بين الدراسات. وتشمل بعض العوامل التي يجب مراعاتها عند اختيار العمر التغيرات المعتمدة على العمر في مجموعات خلايا البروستاتا، والتعبير المعتمد على العمر من الجينات المتحولة التي يقودها المروج محددة، ومعدل تطور ورم البروستاتا في GEMM معينة.

1. تشريح وتصوير الأورام وأورام الأورام النقيلية للفأر

  1. الاعمال التحضيريه
    1. الحصول على أدوات التشريح المعقمة اللازمة. منطقة تشريح المرحلة على سطح معقم نظيف مع مسطرة 15 سم، توازن دقيق، توازن تحليلي، زجاجة رذاذ مع 70٪ إيثانول، محلول ملحي بـ فوسفو (PBS)، ومناشف ورقية.
    2. إعداد حلول إصلاحية للأعضاء الحشوية والعظام التي لا تستخدم لتوليد الأعضاء
      1. للأعضاء الحشوية: إعداد 4٪ بارافورمالدهايد (PFA) في PBS. لفأر واحد، وجعل 20 مل من 4٪ PFA، aliquot في اثنين من أنابيب مخروطية 15 مل والحفاظ على درجة حرارة الغرفة حتى الاستخدام.
      2. للعظام الطويلة: Aliquot 10 مل من قبل-- صنع محايد 10% محايدة المخزنة الرسمية (NBF) في أنبوب مخروطي 15 مل واحد والحفاظ على درجة حرارة الغرفة حتى الاستخدام.
    3. الحصول على أطباق 10 سم غير المعالجة وملء مع PBS غير معقمة - وهذه سوف تكون بمثابة حاويات مؤقتة للأعضاء أثناء تشريح غرامة باستخدام المجهر تشريح.
      ملاحظة: وتستخدم أدوات معقمة لتشريح الأنسجة لتوليد الأعضاء. يتم استخدام الأدوات غير المعقمة للشق الأولي وتشريح الأطراف الخلفية.
  2. القتل الرحيم والشق الأولي
    1. قتل الفأر عن طريق خنق CO2 باستخدام معدل تدفق 2.0 لتر / دقيقة لمدة 5 دقائق. استخدم توازن الدقة لقياس وزن الجسم والسجل الخاص بالماوس.
    2. ضع الماوس فوق منشفة ورقية والموجه على الجانب البطني السطحي للتشريح مع مواجهة رأس الماوس بعيداً عن المحقق. تثبيت الماوس إلى المجلس عن طريق تمتد أطرافه وثقب كل من الأرجل الأمامية والكفوف الخلفية مع إبرة واحدة يمكن التخلص منها.
    3. باستخدام زجاجة رذاذ، قم بتخدير فرو الفأر مع الإيثانول بنسبة 70%. باستخدام مقص تشريح غير معقمة وملقط مستقيم، قرصة فقط فوق القضيب الماوس وجعل شق صغير من خلال الفراء فقط.
    4. مواصلة شق خط الوسط حتى عنق الماوس من خلال الفراء فقط. إجراء شقوق ثنائية من نقطة الشق الأولي من خلال الطائرة البطنية للفأر من خلال الفراء فقط.
    5. فهم الفراء وسحب بعناية بعيدا عن جلد الماوس. دبوس أسفل الفراء إلى المجلس للسماح بالوصول إلى كل من تجاويف البطن والصدر.
  3. استخراج الجهاز البولي التناسلي الذكري في الكتلة
    1. باستخدام مقص تشريح معقم وملقط مستقيم، قطع بعناية من خلال الجلد حوالي 0.75 سم فوق المستقيم. مواصلة شق خط الوسط حتى القفص الصدري دون إزعاج أي أعضاء في تجويف البطن. سحب بعناية الجلد بعيدا ودبوس إلى المجلس لفضح تجويف البطن بأكمله.
      ملاحظة: لا تسمح لهذه الأدوات للمس خارج الماوس أو أي سطح في منطقة التدريج، كما سيتم استخدام هذه الأنسجة لتوليد organoids.
    2. تشريح الجهاز البولي التناسلي والأعضاء الأخرى وفقا للرسم البياني في الشكل 1A، مع أرقام تشير إلى ترتيب سيتم إزالة الأعضاء من الماوس.
    3. العثور على المثانة، ثم فهم وسادة الدهون إما إلى اليسار أو اليمين وسحب صعودا لفضح الخصية. تشريح بعناية بعيدا الخصية من بقية المنطقة البولية التناسلية ووضعها جانبا. قم بنفس الإجراء على الجانب الآخر.
      ملاحظة: تحقيق الجودة المثلى للأنسجة وتوصيف الورم المفصل لأورام البروستاتا يتطلب إزالة المنطقة البولية التناسلية بأكملها من الماوس في الكتلة19. من المستحسن أن تتم إزالة المنطقة البولية التناسلية أولاً (الشكل1A).
    4. فهم المثانة وسحب بعناية حتى أن المنطقة البولية التناسلية يرفع معا، وفضح مجرى البول تحتها. أثناء عقد المثانة، توجيه مقص حتى تكون ضد الجانب السفلي من البروستاتا الظهرية وقطع مجرى البول. ثم سيتم الإفراج عن المنطقة البولية التناسلية بأكملها من تجويف البطن.
    5. ضع المنطقة البولية التناسلية في طبق 10 سم مليئة PBS. إذا كانت لا تزال مليئة البول، واستنزاف المثانة عن طريق إجراء شق صغير. باستخدام التوازن التحليلي، وتزن الجهاز البولي التناسلي وسجل.
  4. استخراج العقد الليمفاوية الحوضية والطحال والكبد والكلى والرئة والساق والفخذ
    1. إزالة الجهاز البولي التناسلي يعرض العقد الليمفاوية الحوض، المتمركزة مباشرة وراء الجهاز البولي التناسلي (الشكل1A)وعلى جانبي العمود الفقري. لن تكون العقد الليمفاوية مرئية إلا إذا كانت تحتوي على آفات خبيثة أو إذا كان هناك التهاب محلي. توجيه ملقط مستقيم تحت العقدة الليمفاوية وسحب ما يصل لإزالة العقدة الليمفاوية. قم بنفس الإجراء على الجانب الآخر.
    2. فهم المستقيم مع ملقط مستقيم وقطع. سحب على المستقيم لكشف القولون بأكمله والأمعاء الدقيقة، وتبحث عن الآفات النقيلية في العقد الليمفاوية mesenteric. عندما تتم إزالة اللفائفي بأكمله، استمر في سحب الاثني عشر لفضح المعدة. قطع المريء لإزالة المعدة تماما وتجاهل. إذا لوحظت أي آفات النقيليفية في العقد الليمفاوية، تشريح بعناية بعيدا عن الأمعاء وتخزينها في طبق 10 سم من PBS.
    3. وتعريض وإزالة المعدة سحب الطحال من الجانب الردورفي من البطن (الشكل1A). إزالة الطحال ووضعها في 4٪ PFA. الطحال بمثابة عنصر تحكم تلطيخ للهيموتوكسيلين كما هو الخلوية للغاية.
      ملاحظة: سيتم إصلاح الأنسجة الحشوية التي لا تستخدم لتوليد الأعضاء بين عشية وضحاها في 4٪ PFA، وغسلها مع PBS، ومن ثم وضعها في 70٪ الإيثانول.
    4. إزالة الكبد في الجزء العلوي من البطن (الشكل 1A). استنادًا إلى الحمل النقيلي في الكبد، يمكن تشريح الفصوص الفردية، أو يمكن إزالة الكبد بأكمله عن طريق القطع بعناية على طول الحجاب الحاجز. (لا تقطع من خلال الحجاب الحاجز في هذا الوقت). ضع الكبد في طبق 10 سم من PBS.
    5. إزالة الكبد سوف يعرض تماما الكلى على جانبي العمود الفقري (الشكل1A). إزالة الكلى — جنبا إلى جنب مع العقد الليمفاوية الكلوية، إذا كانت العقد لديها آفات النقيلي — عن طريق وضع ملقط مستقيم تحت الكلى وسحب ما يصل. قم بنفس الإجراء للجانب الآخر.
    6. لفضح تجويف الصدر، قطع الحجاب الحاجز بعناية على طول القفص الصدري. ثقب الحجاب الحاجز سوف تطلق الضغط السلبي في تجويف الصدر وفضح القلب والرئتين (الشكل1A).
    7. أمسك القص واسحب حتى يفتح تجويف الصدر أكثر. مراقبة الوجه البطني للتجويف الصدري على طول القفص الصدري للآفات النقيلية في العقد الليمفاوية الصدرية وتشريح، إذا كان موجودا.
    8. بينما لا يزال عقد القص، وقطع بعيدا القفص الصدري البطني للوصول إلى القلب والرئتين. أمسك القلب، اسحب ويقطع تحت الرئتين. لإزالة القلب والرئتين بالكامل، قطع جميع الأوعية الدموية الأمامية والقصبة الهوائية. وضع الأنسجة في PBS وإزالة القلب بعناية دون الإضرار أنسجة الرئة أو الآفات النقيلية الرئة.
    9. خذ ملقط مستقيم غير معقمة ومقص تشريح وقطع الساق الخلفية على رأس عظم الفخذ. فهم بعناية عظم الفخذ وإزالة الساق الخلفية من الفراء.
    10. وضع الساق الخلفية على منشفة ورقية واستيعاب مخلب الخلفية. استخدم شفرة الحلاقة أحادية الحافة لكشط/قطع جميع العضلات والأنسجة الضامة من الساق وعظم الفخذ. إزالة عظم الفخذ من الساق عن طريق قطع الخلفي إلى الرضفة وإزالة الساق عن طريق إزالة مخلب الخلفية. ضع الساق وعظم الفخذ في 10٪ NBF. قم بنفس الإجراء على الجانب الآخر.
      ملاحظة: لأغراض فحص العظام الطويلة للماوس للآفات النقيلية ، لا تحتاج الفيبولا إلى أن تكون سليمة. وسيتم إصلاح العظام الطويلة في 10٪ NBF لمدة أسبوع واحد، ثم decalcified باستخدام حل EDTA محايدة20. بعد ثلاثة أسابيع، سيتم نقل العظام إلى 70٪ الإيثانول.
    11. بعد إزالة الأطراف الخلفية، خذ الأذن أو الذيل قطع للكتابة الجينية في المستقبل. تجاهل الذبيحة الماوس وجميع الأنسجة لا يمكن إصلاحها أو استخدامها لتوليد الجهازية.
  5. تشريح ورم البروستاتا
    ملاحظة: تشريح فصوص البروستاتا الماوس لا يمكن أن يتحقق إلا باستخدام المجهر تشريح19. ومع ذلك، يمكن أن يكون الحمل ورم البروستاتا عالية بحيث لا يمكن تمييز الفصوص الفردية، ويمكن إجراء تشريح دون المجهر. ومع ذلك، يتم وصف البروتوكول الكامل لتشريح فصوص البروستاتا الفردية أدناه.
    1. ضع المنطقة البولية التناسلية في طبق 10 سم من PBS تحت المجهر تشريح وتوجيه الجانب البطني حتى مع المثانة والحويصلات المنوية التي تواجه بعيدا عن المحقق. وينبغي أن يتم كل التلاعب في المنطقة البولية التناسلية باستخدام أدوات معقمة.
    2. تقييم النمط الظاهري العام لورم البروستاتا- على الأرجح، إما سيتم ملاحظة ورم مملوء بالسوائل أو صلب في PCa GEMMs (الشكل2A، B).
      ملاحظة: غالبًا ما توجد الأورام المملوءة بالسوائل في منطقة البروستاتا الأمامية (الشكل2A). تتكون الأورام المملوءة بالسوائل من الأنسجة الضامة في المقام الأول مع مكونات ظهارية ضئيلة — وبالتالي فإن هذه الأورام ليست مثالية لتوليد الأعضاء بسبب انخفاض عدد الخلايا الظهارية الورم، كما سيتم مناقشتها في النتائج التمثيلية قسم.
    3. إذا كانت الأورام المملوءة بالسوائل موجودة، قم بثقب صغير في الورم. ضع المنطقة البولية التناسلية في طبق جديد من PBS 10 سم.
    4. خذ زوج من الملقط المستقيم في اليد غير المهيمنة وملقط منحنية في اليد المهيمنة. قلب المنطقة البولية التناسلية إلى وجهها الظهري. ابحث عن منطقة البروستاتا القريبة (الشكل1B)،والتي يمكن تحديدها من قبل اللون الوردي / الأحمر من مجرى البول. فهم مجرى البول وعقد بحزم حتى التلاعب الأنسجة البولية التناسلية مع ملقط منحني.
      ملاحظة: أثناء تشريح البروستاتا، دائما ً ما تحيط علماً بموقع المثانة، لأن هذه هي أبسط طريقة لتحديد موقع فصوص البروستاتا الفردية (الشكل1B).
  6. إزالة الأنسجة غير البروستاتا من المنطقة البولية التناسلية
    1. بينما لا يزال على الوجه الظهري للمنطقة البولية التناسلية، والعثور على قاعدة الحويصلة المنوية. إزالة بعناية الحويصلة المنوية وتجاهل. تنفيذ نفس الإجراء على الجانب الآخر.
      ملاحظة: تجنب ثقب الحويصلة المنوية، لأن ذلك سوف يطلق السائل السري لزجة وغير شفافة التي تتداخل مع تشريح البروستاتا. إذا تم ثقب الحويصلة المنوية، نقل المنطقة البولية التناسلية المتبقية إلى طبق جديد 10 سم مع PBS الطازجة.
    2. إزالة وتجاهل الأوعية الدموية والأنسجة الدهنية والضامة قدر الإمكان باستخدام الجانب المنحني من ملقط.
    3. في حين لا يزال عقد بحزم مجرى البول / منطقة البروستاتا القريبة، واستخدام زوج من غرامة، مقص وأشار لإزالة المثانة من مجرى البول.
  7. عزل فصوص البروستاتا الفردية
    1. تحديد موقع البروستاتا الأمامية (الشكل1ب). تأكد من الاحتفاظ بقوة منطقة البروستاتا القريبة / مجرى البول مع ملقط مستقيم. إزالة منطقة البروستاتا الأمامية عن طريق استيعاب مباشرة الأنسجة مع الجانب المنحني من ملقط وسحب بحزم بعيدا عن المثانة وبقية البروستاتا. ضع الأنسجة في PBS.
      ملاحظة: بالنسبة لجميع مناطق البروستاتا، قد تكون هناك حاجة إلى مقص تشريح لإزالة الأنسجة، اعتمادا على حجم الورم.
    2. تحديد موقع منطقة البروستاتا البطني (الشكل1ب). إزالة منطقة البروستاتا البطني بنفس الطريقة كما في الخطوة 1.5.7.
    3. عند هذه النقطة في تشريح، فقط مناطق البروستاتا الجانبية والظهرية يجب أن تكون موجودة، في حين أن منطقة البروستاتا القريبة لا يزال يتم استيعابها من قبل ملقط مستقيم. تقييم مناطق البروستاتا الجانبية والذهبية (الشكل1باء). إذا كان يمكن تمييز المنطقة الجانبية عن المنطقة الظهرية، قم بإزالة منطقة البروستاتا الجانبية كما هو موضح في الخطوة 1.5.7. قم بنفس الإجراء على الجانب الآخر.
    4. إزالة منطقة البروستاتا الظهرية كما هو موضح في الخطوة 1.5.7. وضع منطقة البروستاتا القريبة في 4٪ PFA، كما هيكلها داخل الأنسجة العضلية من مجرى البول يجعلها غير مناسبة لتوليد الجهازية.

2. توليد الأعضاء 3D من أنسجة أورام البروستاتا

ملاحظة: ويبين الشكل 3 وصفاً تصويرياً لإجراء توليد الأعضاء السرطانية.

  1. اعداد
    1. إعداد الماوس البروستاتا الوسائط العضوية وفقا لDrost وآخرون18 مع التعديلات التالية. استخدام المتوسطة مكيفة بدلا من البروتينات المؤتلفة نوجين وR-سبوندين واستخدام تركيز نهائي من 1٪ (V / V)، بدلا من 10٪، لكل من نوجين- وR-Spondin المتوسطة مكيفة.
      ملاحظة: يتم استخدام خلايا HEK293 المنقولة بشكل لا يُسلَّم بـ HA-mouse Noggin-Fc أو HA-mouse Rspo1-Fc لإنتاج Noggin- أو R-Spondin- متوسطة مكيفة، على التوالي. وكانت هذه الخطوط الخلوية هدية من مختبر كالفين كو في جامعة ستانفورد.
    2. إعداد محلول الهضم في أنبوب 15 مل عن طريق تخفيف 20 ملغ / مل كولاجيناز الثاني مع متقدمة DMEM / F12 (+++) وسائل الإعلام إلى تركيز نهائي من 5 ملغ / مل. إضافة مثبطات الصخور Y-27632 إلى محلول الكولاجين الثاني بتركيز نهائي قدره 10 ميكرومتر.
      ملاحظة: نسبة التخزين المؤقت الهضم إلى الأنسجة هو 1 مل إلى 50 ملغ، والتي نستخدمها وفقا لDrost وآخرون18.
  2. فرم وهضم أنسجة الورم
    1. في غطاء محرك السيارة ثقافة الخلية، وضع أنسجة ورم البروستاتا في طبق ثقافة معقمة 10 سم، تشريح وتجاهل الأنسجة النخرية.
    2. قم بتقطيع أنسجة أورام البروستاتا المتبقية إلى 1 مم3 مكعبات عن طريق عقد قطع الأنسجة مع الملقط المنحني المعقمة وقطع مع مقص تشريح.
    3. ضع قطع الورم المفروم في أنبوب 15 مل مع المخزن المؤقت للهضم عن طريق جمعها مع الجانب المنحني من الملقط. هضم أنسجة الورم في 37 درجة مئوية مع الهز لمدة 1.5 إلى 2 ح. تحقق من تقدم الهضم كل 20 دقيقة.
      ملاحظة: في هذا الوقت، إخراج ما لا يقل عن 2 مل من المصفوفة من -20 درجة مئوية التخزين وذوبان على الجليد. 1 مل aliquots من المصفوفة سوف يستغرق ما يقرب من 3 ح لإذابة.
    4. بعد هضم الأنسجة، أنبوب الطرد المركزي في 175 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية لتشكيل بيليه الخلية.
    5. إزالة supernatant، نفض الغبار أنبوب لتخفيف بيليه الخلية، وإعادة تعليق بيليه الخلية في 1 مل من التربسين قبل الاحماء تستكمل مع 10 μM Y-27632 مثبطات الصخور. وضع الأنبوب في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
    6. بعد الحضانة، ماصة صعودا وهبوطا 5 مرات مع تلميح P1000 القياسية. العودة الأنبوب إلى 37 درجة مئوية حمام المياه لمدة 5 دقائق أخرى وكرر الخطوة 2.2.6.
      ملاحظة: في هذا الوقت في الإجراء، وتسخين طبق ثقافة الخلية معقمة 6-جيدا عن طريق وضعه في حاضنة 55 درجة مئوية.
  3. خلايا العد وإعادة التعليق في المصفوفة
    1. غسل الخلايا عن طريق إضافة 9 مل من الباردة AdDMEM / F12 (+++) والطرد المركزي الأنبوب في 175 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية.
    2. بعد الطرد المركزي، وإزالة supernatant، نفض الغبار أنبوب لتخفيف بيليه، وغسل الخلايا مرة أخرى عن طريق إضافة 10 مل من AdDMEM الباردة / F12 (+++). الطرد المركزي الأنبوب في 175 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية.
    3. بعد الطرد المركزي، وإزالة supernatant، نفض الغبار أنبوب لتخفيف بيليه، وإعادة تعليق الخلايا في 1 مل من AdDMEM / F12 (+++)،وعد عدد الخلايا باستخدام مقياس الهيموكيتوماتوفقا للإجراء القياسي.
    4. تتسع القباب من سبعة إلى ثمانية قباب في بئر واحد من طبق بئر 6 عندما تكون الأعضاء مطلية في مصفوفة عبر طريقة من حكمة الهبوط. ما يقرب من 200 درجة مئوية من المصفوفة سوف تنتج 7-8 القباب. تحديد عدد الآبار اللازمة للأغراض التجريبية المستقبلية وحساب حجم المصفوفة المطلوبة. ثم، حساب حجم الحل الذي يحتوي على الخلية اللازمة أن يكون التركيز النهائي من 1.0 × 106 خلايا / مل من المصفوفة.
    5. بعد عد الخلايا، الطرد المركزي في 175 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية. إزالة supernatant، نفض الغبار أنبوب لتخفيف بيليه، وإعادة تعليق الخلايا في حجم مصفوفة محسوبة في الخطوة 2.3.4.
      ملاحظة: المصفوفة لا تزال في شكل سائل فقط في 4 درجة مئوية; الحفاظ على أنابيب الأسهم مصفوفة وحلول مصفوفة الخلية على الجليد في جميع الأوقات.
  4. طلاء القباب مصفوفة وتطبيق وسائل الإعلام
    1. مزيج مصفوفة خلية الحل مع الأنابيب P200 لتوزيع الخلايا بالتساوي دون إدخال فقاعات. قم بإزالة طبق الثقافة 6-well من حاضنة 55 درجة مئوية.
    2. ماصة بعناية 200 درجة مئوية من حل مصفوفة الخلية وإسقاط الحل بسرعة في بئر لخلق القباب.
    3. كرر الخطوة 2.4.2. حتى يتم إنفاق حجم حل خلية المصفوفة. السماح للقباب لتترسخ في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 دقيقة.
    4. قلب الطبق 6-جيدا رأسا على عقب ووضع الطبق في حاضنة 37 درجة مئوية لمواصلة التصلب لمدة 20 دقيقة.
    5. بعد الحضانة، إضافة 2 مل من وسائل الإعلام العضوية البروستاتا الماوس إلى كل بئر. إضافة الاندروجين الاصطناعية R1881 إلى كل بئر لتركيز نهائي من 1 NM و Y-27632 مثبطات الصخور إلى تركيز نهائي من 10 درجة مئوية. يُمزج المزيج بعناية ويُوضع الطبق في حاضنة بزاوية 37 درجة مئوية للزراعة.
      ملاحظة: وسائل الإعلام ثقافة العضوية يحتاج إلى أن تستكمل مع 10 μM Y-27632 مثبطات الصخور لمدة أسبوع واحد فقط بعد توليد الجهازية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

تظهر في الشكل 2Aصور المحاصيل التمثيلية للفأر مع ورم البروستاتا الأولي الكبير المملوء بالسوائل في منطقة البروستاتا الأمامية . وعلى النقيض من ذلك، يظهر الشكل 2B، صور ًا تمثيلية للفأر مع ورم كبير قوي في البروستاتا لا يمكن تمييزه من مناطق البر...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

الخطوات الحاسمة ضمن بروتوكول تشريح أورام البروستاتا وتوليد الجهازية
إزالة الأنسجة غير البروستاتا وتشريح غرامة من ورم البروستاتا الماوس أمر بالغ الأهمية للجيل الأمثل من الأعضاء السرطان ية منذ كل من الخلايا الظهارية غير البروستاتا والخلايا الظهارية البروستاتا الطبيعية سوف تو...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ علاقات مالية للكشف عنها.

Acknowledgements

يود المؤلفون أن يشكروا مختبر كالفين كو في جامعة ستانفورد على توفير خلايا HEK293 التي تم نقلها بشكل لا يُنقل بعد ة إما مع HA-mouse Noggin-Fc أو HA-mouse Rspo1-Fc. كما نود أن نشكر الدكتور دين تانغ على السماح لنا بالوصول إلى مجهر تشريح الفلورسنت في مختبره. وقد تم دعم هذا العمل من قبل CA179907 إلى D.W.G. من المعهد الوطني للسرطان. تم دعم الموارد المشتركة في مركز روزويل بارك الشامل للسرطان من قبل المعاهد الوطنية لدعم مركز السرطان الصحي CA016056.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.25% Trypsin+2.21 mM EDTASigma25-053
1 1/4 inch, 23 G, disposable syringe needlesBecton DickinsonZ192430
10% neutral buffered formalinSigmaHT501128
32% paraformaldehydeElectron Microscopy Services15714
A83-01MedChemExpressHY-10432
Advanced DMEM/F12+++Gibco12634
Analytical balanceMettler Toledo30216623
B27 (50x)Gibco17504044
Collagenase IIGibco17101015
Dissecting BoardThermo-Fisher36-1
EHS Sarcoma matrix, Pathclear Lot#19814A10Manufactured by TrevigenRequistitioned from the National Cancer Institute at the Frederick National LaboratoryHolder of grants from the National Cancer Institute can request matrix
HEPES (1 M)Sigma25-060
human recombinant Epidermal growth factor (EGF)PeproTechAF-100-15
L-glutamine (200 mM)Sigma25-005
N-Acetyl-L-CysteineSigmaA9165
Penicillin-StreptomycinSigmaP4333
Precision balanceMettler Toledo30216561
Scalpel #23World Precision Instruments504176
Scalpel Handle #7, 16 cmWorld Precision Instruments500238
Single-edge carbon razor bladeFisherbrand12-640
Stainless steel dissecting scissors, 10 cm, straightWorld Precision Instruments14393
Stainless steel Iris forceps, 10 cm, curved tip, serratedWorld Precision Instruments15915
Stainless steel Nugent utility forceps, straight tip, serratedWorld Precision Instruments504489
Y-276632 (Rock Inhibitor)APExBIOA3008

References

  1. Capecchi, M. R. Altering the genome by homologous recombination. Science. 244 (4910), 1288-1292 (1989).
  2. Furth, P. A., et al. Temporal control of gene expression in transgenic mice by a tetracycline-responsive promoter. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (20), 9302-9306 (1994).
  3. Aranda, M., et al. Altered directionality in the Cre-LoxP site-specific recombination pathway. Journal of Molecular Biology. 311 (3), 453-459 (2001).
  4. Schwenk, F., Kuhn, R., Angrand, P. O., Rajewsky, K., Stewart, A. F. Temporally and spatially regulated somatic mutagenesis in mice. Nucleic Acids Research. 26 (6), 1427-1432 (1998).
  5. Kuhn, R., Schwenk, F., Aguet, M., Rajewsky, K. Inducible gene targeting in mice. Science. 269 (5229), 1427-1429 (1995).
  6. Goodrich, M. M., Talhouk, R., Zhang, X., Goodrich, D. W. An approach for controlling the timing and order of engineered mutations in mice. Genesis. 56 (8), 23242(2018).
  7. Brocard, J., et al. Spatio-temporally controlled site-specific somatic mutagenesis in the mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (26), 14559-14563 (1997).
  8. Day, C. P., Merlino, G., Van Dyke, T. Preclinical mouse cancer models: a maze of opportunities and challenges. Cell. 163 (1), 39-53 (2015).
  9. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2019. CA: A Cancer Journal for Clinicians. , (2019).
  10. Bluemn, E. G., et al. Androgen Receptor Pathway-Independent Prostate Cancer Is Sustained through FGF Signaling. Cancer Cell. 32 (4), 474-489 (2017).
  11. Zhou, Z., et al. Synergy of p53 and Rb deficiency in a conditional mouse model for metastatic prostate cancer. Cancer Research. 66 (16), 7889-7898 (2006).
  12. Ku, S. Y., et al. Rb1 and Trp53 cooperate to suppress prostate cancer lineage plasticity, metastasis, and antiandrogen resistance. Science. 355 (6320), 78-83 (2017).
  13. Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
  14. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  15. Simian, M., Bissell, M. J. Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions. Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).
  16. Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  17. Weiswald, L. B., Bellet, D., Dangles-Marie, V. Spherical cancer models in tumor biology. Neoplasia. 17 (1), 1-15 (2015).
  18. Drost, J., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nature Protocols. 11 (2), 347-358 (2016).
  19. Oliveira, D. S., et al. The mouse prostate: a basic anatomical and histological guideline. Bosnian Journal of Basic Medical Sciences. 16 (1), 8-13 (2016).
  20. Callis, G., Sterchi, D. Decalcification of Bone: Literature Review and Practical Study of Various Decalcifying Agents, Methods, and Their Effects on Bone Histology. The Journal of Histotechnology. (21), 49-58 (1998).
  21. Dardenne, E., et al. N-Myc Induces an EZH2-Mediated Transcriptional Program Driving Neuroendocrine Prostate Cancer. Cancer Cell. 30 (4), 563-577 (2016).
  22. Blattner, M., et al. SPOP Mutation Drives Prostate Tumorigenesis In Vivo through Coordinate Regulation of PI3K/mTOR and AR Signaling. Cancer Cell. 31 (3), 436-451 (2017).
  23. Agarwal, S., et al. Identification of Different Classes of Luminal Progenitor Cells within Prostate Tumors. Cell Reports. 13 (10), 2147-2158 (2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

148Cre recombinase

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved