تحليل التفاعلات بين بطانة الرحم وميكروبيوتا الأمعاء البشرية باستخدام أنظمة تخمير الحمام في المختبر

Summary

يوصف هنا هو بروتوكول للتحقيق في التفاعلات بين بطانة الرحم وميكروبيوتا الأمعاء البشرية باستخدام أنظمة التخمير دفعة في المختبر.

Abstract

وقد أصبحت الكائنات الحية الدقيقة المعوية البشرية في الآونة الأخيرة هدفا هاما للبحوث في مجال تعزيز صحة الإنسان والوقاية من الأمراض. وبالتالي، أصبحت التحقيقات في التفاعلات بين الاندوبايوتكس (مثل الأدوية والبريبايوتكس) وميكروبيوتا الأمعاء موضوعا ً بحثيًا مهمًا. ومع ذلك، في التجارب الحية مع المتطوعين الإنسان ليست مثالية لمثل هذه الدراسات بسبب أخلاقيات البيولوجيا والقيود الاقتصادية. ونتيجة لذلك، تم استخدام النماذج الحيوانية لتقييم هذه التفاعلات في الجسم الحي. ومع ذلك، لا تزال الدراسات النموذجية الحيوانية محدودة باعتبارات أخلاقيات البيولوجيا، بالإضافة إلى اختلاف التراكيب والتنوعات في الكائنات الحية الدقيقة في الحيوانات مقابل البشر. استراتيجية بحثية بديلة هي استخدام تجارب التخمير الدفعية التي تسمح بتقييم التفاعلات بين بطانة الرحم وميكروبيوتا الأمعاء في المختبر. لتقييم هذه الاستراتيجية، تم استخدام ثنائي ة البكتيريا (بيف) اكسوبوليساكاريدس (EPS) كممثل xenobiotic. ثم، تم التحقيق في التفاعلات بين Eps BIF وميكروبيوتا الأمعاء البشرية باستخدام عدة طرق مثل الكروماتوغرافيا رقيقة الطبقة (TLC)، والتحليل التركيبي المجتمعي البكتيري مع تسلسل الإنتاجية العالية 16S rRNA، والكروماتوغرافيا الغازية من الأحماض الدهنية قصيرة السلسلة (SCFAs). يقدم هنا بروتوكول للتحقيق في التفاعلات بين بطانة الرحم وميكروبيوتا الأمعاء البشرية باستخدام أنظمة التخمير دفعة في المختبر. والأهم من ذلك، يمكن أيضا تعديل هذا البروتوكول للتحقيق في التفاعلات العامة بين بطانة الرحم الأخرى وميكروبيوتا الأمعاء.

Introduction

تلعب الكائنات المجهرية في الأمعاء دورًا هامًا في أداء الأمعاء البشرية وفي صحة المضيف. وبالتالي، أصبحت ميكروبيوتا الأمعاء مؤخرا هدفا هاما للوقاية من الأمراض والعلاج¹. وعلاوة على ذلك، تتفاعل بكتيريا الأمعاء مع الخلايا المعوية المضيفة وتنظم العمليات الأساسية المضيفة، بما فيذلك الأنشطة الأيضية، وتوافر المواد الغذائية، وتعديل الجهاز المناعي، وحتى وظيفة الدماغ وصنع القرار 2،³ . إن بطانة الرحم لديها إمكانات كبيرة للتأثير على التركيب البكتيري وتنوع ميكروبيوتا الأمعاء. وهكذا، جذبت التفاعلات بين بطانة الرحم وميكروبيوتاالأمعاء البشرية زيادة الاهتمام البحثي 4،^{5،6،7،8،9.}

من الصعب تقييم التفاعلات بين الانبوبيوتكس وميكروبيوتا الأمعاء البشرية في الجسم الحي بسبب أخلاقيات البيولوجيا والقيود الاقتصادية. على سبيل المثال، لا يمكن إجراء التجارب التي تحقق في التفاعلات بين بطانة الرحم وميكروبيوتا الأمعاء البشرية دون إذن من إدارة الغذاء والدواء، وتوظيف المتطوعين مكلف. وبالتالي، كثيرا ما تستخدم النماذج الحيوانية لمثل هذه التحقيقات. ومع ذلك، فإن استخدام النماذج الحيوانية محدود بسبب اختلاف التراكيب المجهرية والتنوع في المجتمعات الحيوانية مقابل المجتمعات المرتبطة بالإنسان. وهناك طريقة بديلة في المختبر لاستكشاف التفاعلات بين بطانة الرحم وميكروبيوتا الأمعاء البشرية من خلال استخدام تجارب الثقافة دفعة.

إكسوبوليساكاريدس (EPSS) هي البريبايوتكس التي تسهم بشكل كبير في الحفاظ على صحة الإنسان¹⁰. يمكن أن تظهر EPSs المتميزة التي تتكون من تركيبات وهياكل أحادية السكريات وظائف متميزة. وقد حددت التحليلات السابقة تكوين BIF EPSs، والتي هي xenobiotic ممثل المستهدفة في الدراسة الحالية¹¹. ومع ذلك، لم يتم النظر في الآثار الأيضية المرتبطة بالمضيف فيما يتعلق بتكوين EPS والتنوع.

يستخدم البروتوكول الموضح هنا الميكروبيوتا البرازية من 12 متطوعًا لتخمير الـ Bif EPSs. ثم يتم استخدام الكروماتوغرافيا ذات الطبقة الرقيقة (TLC)، وتسلسل الجينات ذات الإنتاجية العالية 16S rRNA، والكروماتوغرافيا الغازية (GC) في تركيبة للتحقيق في التفاعلات بين EPSs وميكروبيوتا الأمعاء البشرية. مزايا متميزة من هذا البروتوكول بالمقارنة مع التجارب في الجسم الحي هي انخفاض تكلفته وتجنب آثار التدخل من التمثيل الغذائي للمضيف. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام البروتوكول الموصوف في دراسات أخرى تحقق في التفاعلات بين بطانة الرحم وميكروبيوتا الأمعاء البشرية.

Protocol

يتبع هذا البروتوكول المبادئ التوجيهية للجنة الأخلاقيات في جامعة هونان للعلوم والهندسة (هونان، الصين)، وجامعة تشجيانغ غونغشانغ (تشجيانغ، الصين).

1. إعداد البكتيريا

1. إعداد مرق ثنائي البكي المتوسط
   1. الجمع بين المكونات التالية في 950 مل من الماء المقطر: استخراج اللحوم، 5 غرام / لتر. الخميرة استخراج، 5 غرام / لتر. الكازين ببتون، 10 غرام / لتر؛ صوتوني، 5 غرام / لتر؛ الجلوكوز، 10 غرام / لتر؛ K₂HPO_4,2.04 g/L; MgSO₄·7H₂O, 0.22 g/L; MnSO₄. H₂0, 0.05 g/L; حمض الكلس، 5 غرام/ لتر؛ توين 80، 1 مل؛ محلول الملح، 40 مل(CaCl 2.2H₂O، 0.25 غرام / لتر؛ KH₂PO_4,1 g/L; NaHCO3، 10 غرام / لتر؛ (أ) حمض الكلى، 2 غرام/لتر)؛ وريرازورين، 0.4 مل (2.5 ملغ / لتر). ضبط الحموضة إلى 6.8 مع 2 M هيدروكسيد الصوديوم.
   2. الأوتوكلاف في 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة والسماح للمرق لتبرد لدرجةحرارة الغرفة (RT) في ظل الظروف اللاهوائية (10٪ H 2، 10٪ CO_2،80٪ N_2). إضافة فلتر معقمة سيستين-حمض الهيدروكلوريك (0.5 غرام / لتر) وmupirocin (5 ملغ / لتر) إلى المتوسط.
2. إضافة aliquot (50 درجة مئوية) من لونغوم بيفيدوباكتريوم المجمدة إلى أنبوب الثقافة مع 5 مل من مرق ثنائي الفينيل تريومد المتوسط في ظل ظروف لاهوائية، ثم الثقافة في حاضنة اللاهوائية لمدة 24 ساعة في 37 درجة مئوية.

2. إعداد EPSs ثنائي الفيدوبكتيرية

1. إعداد PYG أجار المتوسطة
   1. الجمع بين ما يلي: peptone، 20 غرام / لتر. الخميرة استخراج، 10 غرام / لتر. الجلوكوز، 5 غرام / لتر. حمض الكلس، 0.08 غرام/ لتر؛ CaCl2، 0.008 غرام / لتر؛ MgSO₄·7H₂O, 0.008 g/L; K₂HPO_4,0.04 g/L; KH₂PO_4,0.04 g/L; NaHCO3, 0.4 جم/لتر; أجار، 12 غرام / لتر. ضبط الحموضة إلى 7.2 باستخدام 10 M هيدروكسيد الصوديوم.
   2. الأوتوكلاف وسائل الإعلام في 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة وبارد إلى ~ 50 درجة مئوية. ثم، لكل 1 لتر من المتوسط، إضافة 0.5 مل من تصفية معقمة فيتامين K₁ الحل (1 غرام من فيتامين ك₁ المذاب في 99 مل من 99٪ الإيثانول)، 5 مل من محلول الهامين (0.5 غرام من الهامين المذاب في 1 مل من 1 مول / L هيدروكسيد الصوديوم ، ثم جلبت ما يصل إلى 100 مل مع الماء المقطر)، و 0.5 غرام من السيستين-حمض الهيدروكلوريك.
   3. قبل صب لوحات PYG، إضافة فلتر تعقيم 5-برومو-4-كلورو-3-إندول β-D-galactopyranoside (X-غال، 0.06 غرام / لتر)، LiCl·3H₂O (5.7 غرام / لتر) وmupirocin (5 ملغ / لتر) إلى المتوسط.
      ملاحظة: X-Gal و LiCl.3H₂O تسمح بتحديد مستعمرات B. longum على لوحات عن طريق تغييرات التلوين.
2. تلقيح 20 ميكرولتر من سلالات الطول B.(الخطوة 1.2) إلى لوحات PYG ووضعها في حاضنة لاهوائية في 37 درجة مئوية لمدة 72 ساعة.
3. جمع المستعمرات البكتيرية المخاطية من لوحات PYG باستخدام مغرفة وزنها، ثم إعادة تعليق تماما في 10 مل من محلول الفوسفات المخزنة المالحة (PBS) باستخدام مذبذب دوامة.
   ملاحظة: يجب إعادة تعليق الخلائط البكتيرية وEPS تماما عن طريق الدوامة أو الأنابيب صعودا وهبوطا مرارا وتكرارا حتى يتم حل الألياف تماما في PBS.
4. الطرد المركزي التعليق في 6000 × ز لمدة 5 دقائق.
5. نقل بعناية supernatants إلى أنبوب الطرد المركزي الجديد ومزيج تماما مع ثلاثة مجلدات من الإيثانول الباردة 99٪ عن طريق تكرار انعكاس ومزج.
6. طرد مركزي الخليط في 6000 × ز لمدة 5 دقائق وإزالة تماما supernatants.
7. إزالة الرواسب من أنابيب الطرد المركزي عن طريق كشط وتجفيف مقتطفات EPS بين عشية وضحاها باستخدام فراغ السرعة.

3. إعداد التخمير المتوسطة

1. إعداد الثقافة الأساسية المتوسطة السادسة
   1. الجمع بين ما يلي: peptone، 3 غرام / لتر. التربتون، 3 غرام / لتر. الخميرة استخراج، 4.5 غرام / لتر. المخاط، 0.5 غرام / لتر. الأملاح الصفراوية رقم 3، 0.4 غرام / لتر؛ حمض الكلة، 4.5 غرام/لتر؛ KCl, 2.5 غرام/لتر; MgCl₂·6H₂O, 4.5 g/L; 1 مل توين 80؛ CaCl2.6H₂O, 0.2 g/L; KH₂PO_4,0.4 g/L; MgSO₄·7H₂O, 3.0 g/L; MnCl₂·4H₂O, 0.32 g/L; فيسو₄·7H2O، 0.1 غرام / لتر؛ CoSO₄·7H₂O, 0.18 g/L; CaCl₂·2H₂O, 0.1 g/L; ZnSO₄·7H₂O, 0.18 g/L; CuSO₄·5H₂O, 0.01 g/L; وNiCl₂·6H₂O, 0.092 g/L. ضبط الحموضة إلى 6.5 مع 1 M حمض الهيدروكلوريك.
   2. إعداد الهيمين والسيستين كما هو الحال في القسم 2.1 وإضافة بعد الأوتوكلاف والتبريد.
2. إعداد وسائل الإعلام الثقافية التي تحتوي على مصادر الكربون المختلفة مع وسائل الإعلام الأساسية السادس. قبل الأوتوكلاف، أضف 8 جم/لتر من ألياف Eps من Bif إلى متوسط VI، مع المجموعة VI_Bif. وبالإضافة إلى ذلك، إضافة 8 غرام / لتر النشا إلى متوسط السادس لتمثيل المجموعة VI_Starch. وأخيراً، يُستخدم المتوسط السادس دون إضافة مصدر كربوني كعنصر تحكم (المجموعة السادسة).
   ملاحظة: يتم حل EPS BIF والنشا أولا في الماء الساخن باستخدام المحرض المغناطيسي، ثم مختلطة مع وسيط ة VI أعدت.
3. الأوتوكلاف جميع وسائل الإعلام في 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة والسماح لتبرد إلى RT.
4. نقل عينة فرعية (5 مل) من كل أنابيب متوسطة إلى ثقافة في حاضنة لاهوائية، وتخزين وسائل الإعلام المتبقية في 4 درجة مئوية.

4. إعداد عينة البراز البشري

1. جمع عينات البراز الطازجة مباشرة بعد التغوط الطازجة من المتطوعين الإنسان البالغين الأصحاء باستخدام حاويات البراز، واستخدامها في وقت لاحق لإعداد الطين.
   ملاحظة: قبل جمع العينات، يجب فحص جميع المتطوعين لضمان عدم تلقي المضادات الحيوية، والبروبيوتيك، أو العلاجات البريبايوتيك لمدة 3 أشهر على الأقل قبل التبرع بالعينات. وبالإضافة إلى ذلك، يجب على جميع الجهات المانحة أن تقدم موافقة خطية مستنيرة.
2. نقل عينة البراز الطازجة (1 غرام) إلى 10 مل من 0.1 M PBS اللاهوائية (pH 7.0) في أكواب زجاجية، ثم استخدام قضبان الزجاج لإعداد الطين 10٪ (ث / الخامس).
3. استخدام غربال 0.4 m لتصفية الطين البراز. ثم، استخدم عينة فرعية من الطين المصفاة لتلقيح تجارب تخمير ثقافة الدفعة، وتخزين الباقي في -80 درجة مئوية لمزيد من التحليلات.
   ملاحظة: تُجرى الخطوات من 4.2 إلى 4-3 في غرفة لاهوائية.

5. في المختبر دفعة التخمير

1. إضافة الطين البراز المصفاة (500 درجة مئوية) إلى التخمير المتوسطة أعدت في الخطوة 3.2 داخل غرفة اللاهوائية، ثم حضانة في 37 درجة مئوية.
2. جمع 2 مل من العينات المخمرة في 24 ساعة و 48 ساعة في الغرفة اللاهوائية ومن ثم الطرد المركزي خارج الغرفة في 6000 × ز لمدة 3 دقائق.
3. نقل بعناية supernatants إلى أنبوب الطرد المركزي الجديد الذي سيتم استخدامه لتحليل تدهور السكريات وقياسات الأحماض الدهنية قصيرة السلسلة (SCFAs).
4. تخزين الكريات الطرد المركزي في -80 درجة مئوية واستخدامها في وقت لاحق لاستخراج الحمض النووي الجينومي البكتيري.

6. تحلل EPS بواسطة ميكروبيوتا البراز البشري

1. تحميل 0.2 ميكرولتر من supernatants المخمرة على هلام السيليكا المغلفة مسبقا-60 لوحات الألومنيوم TLC، ثم تجف باستخدام مجفف الشعر.
2. تطوير لوحات في 20 مل من حمض الفورميك / ن-البوتانول / المياه (6:4:1، v:v:v) الحل والجافة باستخدام مجفف الشعر.
3. نقع لوحات في كاشف orcinol لصبغ، ثم تجف باستخدام مجفف الشعر.
   1. إعداد الكواشف orcinol عن طريق حل 900 ملغ من ليشنول في 25 مل من الماء المقطر ثم إضافة 375 مل من الإيثانول. في وقت لاحق، ينبغي إضافة حمض الكبريتيك المركزة ببطء والحل مختلطة تماما.
4. تُسخّن الأطباق عند درجة حرارة 120 درجة مئوية لمدة 3 دقائق في فرن الخبز وتقيّم تدهور EPS بقياس نطاقات TLC.

7. آثار EPS على ميكروبيوتا الأمعاء البشرية

1. تجميد ذوبان عينات البراز الأصلي أعدت في الخطوة 4.3 والعينات المخمرة أعدت في الخطوة 5.4.
2. استخراج الحمض النووي الجينومي البكتيري (gDNA) من جميع العينات باستخدام مجموعة استخراج الحمض النووي الجينومي البكتيري البراز بناء على تعليمات الشركة المصنعة.
3. تحديد تركيزات الحمض النووي، والنزاهة، وتوزيعات الحجم باستخدام مقياس الطيف الضوئي الجزئي والكهربائي هلام أجار.
4. إجراء PCR من الجينات البكتيرية 16S rRNA من gDNA المستخرجة باستخدام ما يلي وصفها سابقا إلى الأمام وعكس التمهيديات¹²:
   -التمهيدي إلى الأمام (الباركود التمهيدي 338F): ACTCCTACGGGAGGCAGCA
   -التمهيدي العكسي (806R): GGACTACHVGGGTWTAT
   استخدم ظروف الدراجات الحرارية التالية:
   1. 94 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
   2. 94 درجة مئوية لمدة 30 درجة مئوية.
   3. 55 درجة مئوية لمدة 30 درجة مئوية.
   4. 72 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة.
   5. كرر 2-4 لمدة 35 دورة
   6. 72 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
   7. 4 درجة مئوية عقد حتى إزالة من دورة الحرارية.
5. إجراء تسلسل عالي الإنتاجية لمنتجات PCR في شركة تسلسل الحمض النووي باستخدام تحليل مجتمعي ميكروبي فائق الإنتاجية.
6. الحصول على تسلسل نظيفة وعالية الجودة باستخدام الرؤى الكمية في علم البيئة الميكروبية (QIIME) خط أنابيب التسلسل¹³.
7. تحديد وحدات التصنيف التشغيلية (OTUs) لتسلسل الجينات rRNA 16S مع أكبر من 97٪ التشابه النيوكليوتيد باستخدام أدوات المعلوماتية الحيوية مثل مجموعة برامج Mothur¹⁴.
8. اختيار تسلسل تمثيلي من كل OTU واستخدام مصنف RDP جنبا إلى جنب مع قاعدة بيانات تصنيف سيلفا لتصنيف التسلسلات التمثيلية¹⁵.
9. حساب تغطية جيدة، مقاييس التنوع ألفا (بما في ذلك سيمبسون ومؤشر شانون)، والثراء (لاحظ عدد من OTUs) باستخدام أدوات المعلوماتية الحيوية¹⁶.

8- آثار ربحية السهم على إنتاج الميكروبيوتا المعوية البشرية

1. إضافة supernatants المخمرة (1 مل) أعدت في الخطوة 5.3 إلى 2 مل أنابيب الطرد المركزي.
2. إضافة 0.2 مل من 25٪ (ث / الخامس) حمض الميتافوسفوريك إلى كل من العينات وخلط الحلول جيدا عن طريق الدوامة.
3. طرد مركزي الخلائط في 13،000 × غرام لمدة 20 دقيقة ونقل supernatants إلى أنابيب جديدة.
4. في الوقت الذي تقوم فيه بإعداد حلول للأسيحاق 120 مل، بروبيوني، بوتيريك، إيزوبوتيريك، حشيشة الهر والأحماض الإيزوفاليريك. ثم، إضافة 1 مل من كل حمض أعدت إلى 1.2 مل من 25٪ (ث / الخامس) حمض الميتافوسفوريك واستخدامها كالكوكتيلات القياسية.
5. تصفية العينات باستخدام غشاء 0.22 ميكرومتر.
6. الكشف عن تركيزات SCFA باستخدام الكروماتوغرافيا الغاز عالية الأداء وفقا للبروتوكولات الموصوفة سابقا^11،17.
   ملاحظة: يتم استخدام عمود غطاء القلب الأقصى (0.25 م× 30 م × 0.25 درجة مئوية) لكروماتوغرافيا الغاز (GC). ثم يتم تحديد تركيزات SCFA كمياً استناداً إلى مناطق الذروة باستخدام طريقة المعيار الداخلي أحادية النقطة في مجموعة برامج حلول GC.

النتائج

ويمكن ملاحظة إنتاج EPS المخاطية في الثقافات B. longum على لوحات PYG بعد الحضانة اللاهوائية لمدة 72 ساعة (الشكل1A). المركزية من القصاصات الثقافة، تليها هطول الأمطار الإيثانول والتجفيف، أدى إلى جمع EPS مثل السليلوز (الشكل1B). ثم استخدمت EPS المجففة والنشا القابل للذو...

Discussion

وقد أحرز تقدم كبير نحو فهم تكوين ميكروبيوتا الأمعاء البشرية وأنشطتها على مدى العقد الماضي. ونتيجة لهذه الدراسات، ظهر مفهوم الهولوبيوت، الذي يمثل التفاعلات بين المضيفين والمجتمعات الميكروبية المرتبطة بها، كما هو الحال بين البشر وميكروبيوتا الأمعاء^19،20. وع...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 µm membrane filters	Millipore	SLGP033RB	Use to filter samples
0.4-mm Sieve	Thermo Fischer	308080-99-1	Use to prepare human fecal samples
5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside (X-Gal)	Solarbio	X1010	Use to prepare color plate
Acetic	Sigma-Aldrich	71251	Standard sample for SCFA
Agar	Solarbio	YZ-1012214	The component of medium
Anaerobic chamber	Electrotek	AW 400SG	Bacteria culture and fermentation
Autoclave	SANYO	MLS-3750	Use to autoclave
Bacto soytone	Sigma-Aldrich	70178	The component of medium
Baking oven	Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd	DHG-9240A	Use to heat and bake
Beef Extract	Solarbio	G8270	The component of medium
Bifidobacterium longum Reuter	ATCC	ATCC® 51870™	Bacteria
Bile Salts	Solarbio	YZ-1071304	The component of medium
Butyric	Sigma-Aldrich	19215	Standard sample for SCFA
CaCl2	Solarbio	C7250	Salt solution of medium
Capillary column	SHIMADZU-GL	InertCap FFAP (0.25 mm × 30 m × 0.25 μm)	Used to SCFA detection
Casein Peptone	Sigma-Aldrich	39396	The component of medium
Centrifuge	Thermo Scientific	Sorvall ST 8	Use for centrifugation
CoSO4.7H2O	Solarbio	C7490	The component of medium
CuSO4.5H2O	Solarbio	203165	The component of medium
Cysteine-HCl	Solarbio	L1550	The component of medium
Ethanol	Sigma-Aldrich	E7023	Use to prepare vitamin K1
FeSO4.7H2O	Solarbio	YZ-111614	The component of medium
Formic Acid	Sigma-Aldrich	399388	Used to TLC
Gas chromatography	Shimadzu Corporation	GC-2010 Plus	Used to SCFA detection
Glass beaker	Fisher Scientific	FB10050	Used for slurry preparation
Glucose	Solarbio	G8760	The component of medium
Haemin	Solarbio	H8130	The component of medium
HCl	Sigma-Aldrich	30721	Basic solution used to adjust the pH of the buffers
Isobutyric	Sigma-Aldrich	46935-U	Standard sample for SCFA
Isovaleric Acids	Sigma-Aldrich	129542	Standard sample for SCFA
K2HPO4	Solarbio	D9880	Salt solution of medium
KCl	Solarbio	P9921	The component of medium
KH2PO4	Solarbio	P7392	Salt solution of medium
LiCl.3H2O	Solarbio	C8380	Use to prepare color plate
Meat Extract	Sigma-Aldrich-Aldrich	70164	The component of medium
Metaphosphoric Acid	Sigma-Aldrich	B7350	Standard sample for SCFA
MgCl2.6H2O	Solarbio	M8160	The component of medium
MgSO4.7H2O	Solarbio	M8300	Salt solution of medium
MISEQ	Illumina	MiSeq 300PE system	DNA sequencing
MnSO4.H20	Sigma-Aldrich	M8179	Salt solution of medium
Mupirocin	Solarbio	YZ-1448901	Antibiotic
NaCl	Solarbio	YZ-100376	Salt solution of medium
NaHCO3	Sigma-Aldrich	792519	Salt solution of medium
NanoDrop ND-2000	NanoDrop Technologies	ND-2000	Determine DNA concentrations
NaOH	Sigma-Aldrich	30620	Basic solution used to adjust the pH of the buffers
n-butanol	ChemSpider	71-36-3	Used to TLC
NiCl2	Solarbio	746460	The component of medium
Orcinol	Sigma-Aldrich	447420	Used to prepare orcinol reagents
Propionic	Sigma-Aldrich	94425	Standard sample for SCFA
QIAamp DNA Stool Mini Kit	QIAGEN	51504	Extract bacterial genomic DNA
Ready-to-use PBS powder	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	A610100-0001	Used to prepare the lipid suspension
Resazurin	Solarbio	R8150	Anaerobic Equipment
Speed Vacuum Concentrator	LABCONCO	CentriVap	Use to prepare EPSs
Starch	Solarbio	YZ-140602	Use to the carbon source
Sulfuric Acid	Sigma-Aldrich	150692	Used to prepare orcinol reagents
T100 PCR	BIO-RAD	1861096	PCR amplification
TLC aluminium sheets	MerckMillipore	116835	Used to TLC
Trypticase Peptone	Sigma-Aldrich	Z699209	The component of medium
Tryptone	Sigma-Aldrich	T7293	The component of medium
Tween 80	Solarbio	T8360	Salt solution of medium
Valeric	Sigma-Aldrich	75054	Standard sample for SCFA
Vitamin K1	Sigma-Aldrich	V3501	The component of medium
Vortex oscillator	Scientific Industries	Vortex.Genie2	Use to vortexing
Yeast Extract	Sigma-Aldrich	Y1625	The component of medium
ZnSO4.7H2O	Sigma-Aldrich	Z0251	The component of medium