مهمة ربط منخفضة التكلفة ومكافأة الرائحة لاختبارات التعلم والذاكرة

Summary

تم استخدام مهمة التعلم الترابطي للرائحة والمكافأة للتحقيق في الآثار التفاضلية للتلاعب الفسيولوجي على الذاكرة طويلة المدى وقصيرة المدى.

Abstract

تعتبر النماذج السلوكية القوية والبسيطة للذاكرة الشهية والترابطية ضرورية للباحثين المهتمين بالآليات الخلوية والجزيئية للذاكرة. في هذه الورقة ، تم وصف بروتوكول سلوكي فعال ومنخفض التكلفة للفأر لفحص آثار التلاعب الفسيولوجي (مثل ضخ العوامل الدوائية) على معدل التعلم ومدة ذاكرة الرائحة المكافأة. يتم تقديم نتائج تمثيلية من دراسة تدرس الدور التفاضلي لنشاط مستقبلات التيروزين كيناز في الذاكرة قصيرة المدى (STM) والذاكرة طويلة المدى (LTM). تم تكييف ذكور الفئران لربط مكافأة (حبيبات السكر) بإحدى الرائحتين ، وتم اختبار ذاكرتها للجمعية بعد ساعتين أو 48 ساعة. قبل التدريب مباشرة ، تم تسليم مثبط مستقبلات التيروزين كيناز (Trk) أو حقن السيارة في البصلة الشمية (OB). على الرغم من عدم وجود تأثير للتسريب على معدل التعلم ، إلا أن حصار مستقبلات Trk في OB ضعف LTM بشكل انتقائي (48 ساعة) ، وليس الذاكرة قصيرة المدى (STM ؛ 2 ساعة). يعزى ضعف LTM إلى انتقائية الرائحة المتناقصة كما تم قياسها بطول وقت الحفر. أظهرت ذروة نتائج هذه التجربة أن تنشيط مستقبلات Trk في OB هو المفتاح في توحيد الذاكرة الشمية.

Introduction

تم التحقيق في آليات تكوين الذاكرة الترابطية سابقا بناء على دراسات تكييف الخوف في تجربة واحدة. ومع ذلك ، فإن العديد من المهام الدنيوية عادة ما يكون لها أنماط اكتساب أكثر تعقيدا وتعتمد على المواجهات المتكررة. الهدف من هذا البروتوكول هو توفير نموذج سلوكي فعال من حيث التكلفة للقوارض يستخدم لفهم الآليات الخلوية والجزيئية للتعلم الشهية والذاكرة متعددة التجارب.

يوفر تعلم الرائحة الذي يعتمد على البصلة الشمية الرئيسية (OB) العديد من المزايا لدراسة الذاكرة الشهية متعددة التجارب. أولا ، الذكريات المعتمدة على OB لها فترات متفاوتة (STM و LTM والذاكرة متوسطة^{المدى 1}) وتعتمد على نفس الجزيئي^2،3 والآلية الهيكلية كما هو الحال في أي مكان آخر في الدماغ ، بما في ذلك التعديل العصبي⁴ ، والتقوية طويلة المدى⁵ ، وتكوين الخلايا العصبية للبالغين^6،7،8. ثانيا ، على عكس المناطق ذات الترتيب الأعلى ، مثل الحصين ، تسمح الذكريات المعتمدة على OB بملاحظات تطابق مباشر أكثر بين تلاعب المجرب بالبيئة الإدراكية والتغيرات في الدوائر العصبية المسؤولة عن التعلم^8،9،10،11. في هذه الورقة ، تم تفصيل نموذج التعلم الترابطي والذاكرة المعتمد على OB ، والذي يمكن استخدامه لدراسة الآليات الجزيئية والهيكلية العامة. تم تطويره للسماح للباحثين بالوصول إلى مزايا التعلم الشمي لدراسة الآليات الخلوية والجزيئية للذاكرة.

في منشورنا الأخير³ ، تم استخدام البروتوكول الموصوف هنا لإثبات أن توحيد تعلم الرائحة الشهية يعتمد على تنشيط مستقبلات Trk داخل OB. في البروتوكول أدناه ، تمت مناقشة المجالات التي يمكن فيها تعديل النموذج السلوكي لتلبية الاحتياجات التجريبية المختلفة.

تم استخدام ما مجموعه 27 من الفئران الذكور CD-1 البالغين ، الذين يبلغون من العمر 8 أسابيع في وقت القنية ، في هذه الدراسة. للحصول على توزيعات المجموعة الدقيقة واستخدام مجموعة الروائح ، راجع قسم الطرق في منشورنا السابق³. تم استخدام ذكور الفئران لتجنب التقلبات الكبيرة في مستويات هرمون الاستروجين لأن الأبحاث السابقة¹² أظهرت أن الذاكرة الشمية تتعزز عن طريق زيادة مستويات هرمون الاستروجين. تم الاحتفاظ بهذه الفئران دائما في دورة إضاءة / ظلام عكسية 12:12 ساعة وتمكنت من الوصول إلى الماء. خلال التجارب السلوكية ، تم تقييد الأنظمة الغذائية للفئران للحفاظ عليها عند ~ 90٪ من وزنها الحر. بدأ تقييد النظام الغذائي قبل 3 أيام من بدء التجربة السلوكية. كما سيتم وصفه أدناه ، يتم تقديم نفس مجموعة الفئران بمجموعات روائح مختلفة من أجل الوصول إلى المستويات المناسبة من القوة الإحصائية مع تقليل استخدام. يوضح قسم التحليل الإحصائي كيفية حساب التباين العشوائي الذي قد يتم إدخاله من خلال هذا.

Protocol

يلتزم البروتوكول أدناه بإرشادات رعاية الخاصة ب IACUC في كلية إيرلهام.

1. قنية المصباح الشمي

ملاحظة: لا تتطلب هذه العمليات الجراحية تقنية معقمة لأنها لا تتطلب شقوقا كبيرة. ومع ذلك ، قد تختلف كل مؤسسة في متطلباتها. إذا كان المجربون يقومون بإجراء هذه الجراحة على سلالات الفئران التي تعاني من نقص المناعة ، فقد تكون هناك حاجة إلى اعتبارات إضافية. بشكل عام ، يتم تشجيع المجربين على مناقشة هذا البروتوكول مع الطبيب البيطري وفريق رعاية قبل الاستخدام وتنظيف وتطهير جميع الأدوات بين كل عملية جراحية.

1. أثناء الإعداد ، انقع القنيات والبراغي في دورق صغير أو طبق بتري يحتوي على 32٪ كلورهيكسيدين للحفاظ على تطهيرها.
2. تخدير الفئران بالأيزوفلوران الغازي بنسبة 4٪ في الأكسجين النقي وتأمينها في جهاز تجسيم. أثناء الجراحة ، تأكد من الحفاظ على الفئران تحت تخدير الأيزوفلوران بنسبة 1.5-2٪ من خلال مخروط الأنف. راقب التنفس طوال الجراحة. استخدم مرهم العين لمنع جفاف العينين أثناء التخدير.
3. بعد أن يتم تأمين الفأر ولم يعد يستجيب لقرصة قوية في القدم الخلفية ، استخدم 32٪ من الكلورهيكسيدين لفرك الجزء العلوي من الرأس لتنظيف سطح الشق.
4. بعد ذلك ، افركي الجزء العلوي من الرأس في الاتجاه المنقاري إلى الذيلي باستخدام الليدوكائين (التسكين الموضعي).
5. اضغط لأسفل بقوة لعمل شق واحد أسفل خط الوسط بشفرة مشرط نظيفة.
6. باستخدام مثقاب متصل بالتجسيم ، قم بحفر فتحتين فوق المصابيح الشمية لقنية التوجيه (26 جم) باستخدام الإحداثيات AP + 5.0 مم ، ML +/- 0.75 مم فيما يتعلق بالبريجما.
7. حفر فتحتين فوق التكوين المخيخي.
   ملاحظة: لا يلزم أن يكون موقع هذه البراغي دقيقا ، تأكد من أنها متماثلة على طول خط الوسط.
8. ضع البراغي في الفتحتين فوق التكوين المخيخي واستخدم مادة لاصقة للأنسجة لتثبيت هذه البراغي بالجمجمة.
9. استخدم التجسيم لإدخال قنية التوجيه (26 جم) في الثقوب المحفورة فوق المصابيح الشمية (الخطوة 1.6). اخفض القنية DV 1.0 مم.
10. اخلطي أسمنت الأسنان في طبق بتري. استخدم مغرفة معدنية صغيرة لتكديس الأسمنت السني ببطء حول القنية. اتركه يجف لمدة 5 ثوان. بعد ذلك ، قم بإزالة أذرع الجهاز التجسيمي ، مع الحرص على عدم سحب قنية التوجيه للخارج في هذه العملية. استمر في تكديس الأسمنت السني على الشق بأكمله حتى يتم تشكيل غطاء صغير (انظر الشكل 1أ).
11. ضع سدادات وهمية في قنية التوجيه في هذه المرحلة لمنع الانسداد.
12. بعد الجراحة مباشرة ، قم بحقن الكيتوبروفين (0.2 مجم / كجم) والمحلول الملحي (200 ميكرولتر) لتقليل الألم وإعادة الترطيب. قدم طعاما طريا أو هيدروجيل للفئران بعد الجراحة. لا تترك الفئران دون رقابة حتى تستعيد وعيها للحفاظ على الاستلقاء القصي.
    ملاحظة: يتم أيضا إيواء الفئران بشكل فردي من هذه النقطة فصاعدا.
13. حقن محلول ملحي (200 ميكرولتر) وكيتوبروفين (0.2 مجم / كجم) مرة واحدة يوميا لمدة يومين بعد الجراحة.
14. لمدة يومين وحتى 5 أيام ، (حسب الحاجة) بعد الجراحة ، قم بوزن الفئران ومراقبة أوزانها. إذا لم يعد الوزن إلى مستويات ما قبل الجراحة في غضون يومين أو ثلاثة أيام ، فاستشر الطبيب البيطري حول طريقة التغذية المناسبة.
15. اسمح للفئران بالتعافي لمدة 7 أيام على الأقل قبل بدء التدريب السلوكي.

2. مهمة التمييز الترابطي

1. ضخ
   1. قم بإعطاء الحقن الخاصة ب OB من مثبط مستقبلات التيروزين كيناز ، K252a (50 ميكرومتر ؛ 5٪ DMSO في محلول ملحي) ، أو مركبة (5٪ DMSO في محلول ملحي) للفئران على النحو التالي.
      1. قم بتوصيل التسريب إلى OB للفئران بشكل ثنائي. حقن 2.0 ميكرولتر الحجم النهائي لكل لمبة بمعدل تسريب 0.2 ميكرولتر / دقيقة و 10 دقائق من إجمالي وقت التسريب باستخدام مضخة حاقن مزدوجة.
         ملاحظة: يمكن تعديل توقيت التلاعب اعتمادا على نوع الدراسة السلوكية التي يتم إجراؤها. الخطوات الدقيقة للتسريب خاصة بكل مضخة حاقن ويتم توفيرها في دليل الشركة المصنعة.
      2. تأكد من ترك الحاقنات داخل القنيات لمدة 5 دقائق بعد الولادة لمنع التدفق العكسي وتعزيز الانتشار. (على سبيل المثال ، خطط لما مجموعه 15 دقيقة لكل تسريب).
2. مجموعات الرائحة.
   1. خفف جميع الروائح في الزيت المعدني الخفيف إلى ضغط جزئي قدره 1.0 باسكال باستخدام نسبة محسوبة مسبقا بناء على ضغط البخار (الجدول 1).
   2. استخدم 5 أزواج منفصلة من الروائح من الجدول 1 (تشير الأرقام الموجودة في الجدول إلى الحجم بالميكرولتر لخلطها في 50 مل من الزيت المعدني ل 1.0 باسكال).
   3. لتحضير الرمل المعطر لاستخدامه أثناء الخطوات السلوكية (القسم 2.3 و 3) ، امزج 400 ميكرولتر من رائحة 1.0 باسكال من الخطوة 2.2.2 لكل 100 غرام من رمل اللعب.
3. تشكيل
   ملاحظة: يجب أن تخضع الفئران للتشكيل لمدة 10 أيام كما هو موضح أدناه.
   1. أحضر الفئران إلى غرفة العمليات وتعامل معها لمدة 10 دقائق يوميا في اليومين الأولين بعد التعافي من الجراحة.
   2. في اليوم 3 ، ضع طبق بتري مليء بالرمل المعطر بالليمونين (+) في أقفاص الفئران المنزلية ومملوءة بحوالي 10 حبيبات سكروز ، كل منها 5 ملغ في الكتلة.
      ملاحظة: استخدم 1.0 باسكال (+) -ليمونين (امزج 102 ميكرولتر في 50 مل من الزيت المعدني) كرائحة مكافأة وزيت معدني عادي (عامل تخفيف روائح الاختبار) كرائحة غير مكافأة. يوصى أيضا باختيار الروائح أحادية الجزيء لأنها من المرجح أن تكون جديدة للفئران.
   3. قم بتجديد كل من الرمل والكريات في اليوم 4.
   4. في اليومين 5 و 6 ، تأقلم الفئران مع الجهاز السلوكي المخصص ، عن طريق وضعها في الجهاز والسماح لها باستكشاف الفضاء (الشكل 1ب ، ج). اصنع الجهاز باستخدام قفص منزلي قياسي ، وبولي (ميثيل ميثاكريلات) لبناء غطاءين ومقسم مركزي أسود. تأكد من أن كلا من الأغطية والمقسم المركزي أكبر بمقدار 1-2 سم من قفص المنزل.
   5. قم بإعداد طبق بتري من الرمل المعطر بالليمونين وآخر بالرمل المحتوي على الزيت المعدني. بعد التأقلم في كل من اليومين 5 و 6 ، ضع كلا من أطباق الرمل في غرفة الاختبار واخلط 10 حبيبات سكروز في الطبق المعطر بالليمونين لتكون بمثابة مكافأة. ضع كل فأر في غرفة الاختبار لمدة 10 دقائق واتركه لاستكشاف واستهلاك كريات المكافأة بحرية.
   6. في اليوم السابع ، قدم الفئران إلى نسخة مختصرة من إجراء الاختبار النهائي ، عن طريق وضع الأطباق التي تحتوي على رمل معطر بالليمونين والزيوت المعدنية في الجهاز السلوكي. هذه المرة قم بتضمين المقسم المركزي.
      1. ضع مكافأة واحدة فوق الرمل المعطر بالليمونين وضع الفأر في غرفة الراحة.
      2. بمجرد وضع الماوس في غرفة الراحة ، ارفع المقسم المركزي للسماح للفأر بدخول غرفة الاختبار للتحقيق والحفر في الأطباق المليئة بالرمل. أعد الماوس إلى غرفة الراحة إما بعد استرداد حبيبات المكافأة أو بعد انقضاء 5 دقائق.
      3. كرر هذه العملية لإجمالي 10 تجارب لكل فأرة على حدة. قم بموازنة وضع الطبق بمكافأة إما على الجانب الأيسر أو الجانب الأيمن من خلال استخدام مولد أرقام عشوائي. لا توجد فترات راحة بين التجارب.
   7. في اليوم 8 ، كرر تجارب اليوم 7 ، ولكن أيضا دفن الحبيبات تدريجيا بشكل أعمق وأعمق في الرمال.
      ملاحظة: يجب أن تبحث معظم الفئران عن حبيبات المكافأة غير المرئية بحلول^{التجربة} العاشرة في اليوم 8.
   8. في اليوم 9 ، قم بزيادة عدد التجارب إلى 20 تجربة لكل فأر مع الدفن العميق الكامل لحبيبات السكروز وإدخال الفئران إلى غرفة الاختبار لمدة دقيقة واحدة لكل تجربة. دع الفئران تحفر في كلا الطبقين للحصول على مكافأة.
   9. في اليوم العاشر ، كرر التجارب العشرين لكل فأر ، ولكن إذا حفروا في الطبق غير المكافأ قبل أن يحفروا في الطبق المكافأ ، ثم يبدأون التجربة التالية. اسمح للفئران التي حفرت لأول مرة في الطبق المكافأ (برائحة الليمونين) باسترداد حبيبات المكافأة قبل إعادتها إلى غرفة الراحة.

3. التدريب والاختبار

ملاحظة: بمجرد أن تبدأ الفئران في الحفر بشكل موثوق عن كريات المكافأة غير المرئية ذات الرائحة ، يمكن أن تبدأ التجربة.

1. تدريب
   ملاحظة: تبدأ مرحلة التدريب بعد يومين من اكتمال التشكيل وتتكون من 20 تجربة لكل فأر. قبل التدريب ، قم بتوصيل حقن الدواء / السيارة داخل البصيلة على الفور (انظر القسم 2.1 للحصول على تفاصيل التسريب) وابدأ التدريب مباشرة بعد الحقن.
   1. ضع الفأر في غرفة الراحة.
   2. ضع طبقين من الرمل المعطر برائحة جديدة في غرفة الاختبار ، حيث يتم دفن حبيبات المكافأة في أحد الأطباق.
   3. بمجرد أن تصبح غرفة الاختبار جاهزة ، ارفع الحاجز غير الشفاف وأدخل الماوس في غرفة الاختبار. أعد الماوس على الفور إلى غرفة الراحة ، إذا حفر الفأر في الطبق غير المكافأ أولا (سجل هذه التجارب ك "0"). إذا حفر الفأر في الرائحة المجزية أولا ، اسمح له باسترداد الحبيبات وإعادتها إلى غرفة الراحة. سجل هذه التجارب ك "1". إذا استمرت التجربة لمدة دقيقة واحدة دون أن يسترد الماوس المكافأة ، فأرسل الماوس مرة أخرى إلى غرفة الراحة.
   4. نظف الأطباق وأعد تعبئتها وابدأ التجربة التالية. كرر نفس الشيء لمدة 20 تجربة.
2. اختبار
   ملاحظة: يمكن إجراء اختبار الذاكرة في أي مدة تهم الباحث. في هذه التجربة ، تم اختبار مجموعتين منفصلتين من الفئران لمدة 2 ساعة (STM) أو 48 ساعة (LTM) بعد التدريب نظرا للاهتمام بالتأثير التفاضلي ل K252a على STM و LTM.
   1. إجراء الاختبار باستخدام نفس الروائح والإجراءات الموضحة للتدريب (القسم 3.1).
      ملاحظة: اعتمادا على سؤال البحث ، قد يحتاج الباحث إلى تضمين مجموعات التحكم. على سبيل المثال ، في التجربة المنشورة سابقا ، تمت دراسة تأثيرات حصار مستقبلات Trk على توحيد الذاكرة³. لذلك ، تم غرس مجموعة التحكم ب K252a قبل اختبار 48 ساعة لإظهار أن التأثيرات لم تكن بسبب التداخل مع الاسترجاع.
3. التحليل الإحصائي
   ملاحظة: بناء جملة SPSS 22.0 لكل خطوة مقدمة كملف تكميلي كمثال.
   1. إجراء التحليل الإحصائي باستخدام تحليل التأثيرات الخطية المختلطة. على عكس ANOVAs ، يمكن لنماذج التأثيرات المختلطة الخطية أن تفسر بشكل أفضل التأثيرات العشوائية والمقاييس المتكررة.
   2. احسب المقياس التابع: "نسبة صحيحة". تذكر من 3.1.3 أنه تم تعيين "1" للتجارب التي حفر فيها الفأر الرائحة المجزية أولا ، و "0" إذا حفر الفأر أولا في الرائحة غير المجزية. كان متوسط كل خمس تجارب لإنشاء أربع فدرات تجريبية (السل؛ على سبيل المثال، كانت الكتلة التجريبية 1 أو TB1 هي متوسط التجارب 1-5، والكتلة التجريبية 2 أو السل 2 هو متوسط التجارب 6-10 وهكذا دواليك).
   3. تعيين المتغيرات المستقلة أو التأثيرات الثابتة كمجموعات المخدرات (K252a أو Vehicle; القسم 2.1.1) والكتل التجريبية (من 3.3.1). في النتائج التمثيلية أدناه ، يتم تحديد المتغيرات المستخدمة لكل تحليل.
   4. قم بتضمين مجموعة الماوس والرائحة الفردية المتداخلة داخل الماوس ك "تأثيرات عشوائية" للتعويض عن الاختلافات السلوكية الجوهرية في الفئران وأي تأثيرات لاستخدام مجموعات روائح متعددة.
   5. قم بإجراء تحويل لوجيت على النسبة الصحيحة.
      ملاحظة: النسبة الصحيحة ليست متغيرا تابعا مستمرا وغير مرتبط. وبالتالي ، فإنه ينتهك افتراضين للنماذج الخطية. لذلك ، يتم إجراء تحويل اللوجيت.
   6. استخدام الوسائل الهامشية المقدرة لإجراء اختبارات لاحقة على التفاعلات الهامة التي حددها النموذج الكامل؛ يجب تصحيح المقارنات الزوجية المتعددة في الاختبار اللاحق. عادة ما يتم استخدام Bonferroni أو Šidák.

النتائج

كما هو موضح ، يسمح هذا البروتوكول للباحثين بتقييم تأثير بعض التلاعب على التعلم و STM و LTM. يتم عرض نتائج عينة من Tong et al، 2018³ هنا. تدعم النتائج الفرضية القائلة بأن حصار مستقبلات Trk يثبط LTM بشكل انتقائي ، ولكن ليس التعلم أو STM.

يوضح الشكل 2أ مخططات التدريب واختبار STM واختبار LTM. أولا ، تبين أن حقن K252a لم تؤثر على معدل التعلم لارتباط مكافأة الرائحة. يوضح الشكل 2ب (القسم 3.1) معدل التعلم لكل من K252a ومجموعات المركبات من التدريب. أجري التحليل الإحصائي باستخدام نموذج مختلط خطي بتأثيرين ثابتين، مجموعة الأدوية والكتلة التجريبية. كانت مجموعة الماوس والرائحة المتداخلة داخل الماوس تأثيرات عشوائية. لم يتم تضمين البيانات من الاختبار (القسم 3.2) في التحليل. لوحظ تأثير رئيسي يعتد به من فدرة التجربة (F (3 ، 183.692) = 43.735 ، ص < 0.001) ، ولكن لم يكن هناك تأثير من مجموعة الأدوية (F (F (1 ، 85.685) = 0.132 ، p = 0.717) وعدم وجود تفاعل يعتد به (F (3 ، 183.692) = 0.111 ، p = 0.954). أكدت الاختبارات اللاحقة ، باستخدام تعديل Šidák ، أن K252a ومجموعات المركبات لم تختلف في أي من الكتل التجريبية أثناء التدريب (ص > 0.05 لجميع المقارنات). كانت TB2 و TB3 و TB4 أعلى بكثير من TB1 لجميع المقارنات (ص ≤ 0.001 في جميع الحالات) ، مما يدل على أن كلا المجموعتين تعلمتا بنجاح ارتباط الرائحة والمكافأة بنهاية 20 تجربة تدريبية.

بعد ذلك ، لفحص آثار التسريب على STM و LTM ، تم إجراء نفس التحليل وتضمن بيانات من الاختبار (القسم 3.2). أظهر تفاعلا معتد به بين مجموعة الأدوية والكتلة التجريبية (F (2 ، 77.558) = 4.043 ، ص = 0.021) ، مع عدم وجود تأثيرات رئيسية يعتد بها لمجموعة الأدوية (F (1 ، 55.629) = 1.438 ، p = 0.236) أو كتلة التجربة (F (2 ، 69.979) = 1.360 ، ص = 0.263). من أجل فحص الذاكرة على وجه التحديد ، قارنت المقارنات الزوجية اللاحقة مع تصحيح Šidák الاختلافات بين الكتلة التجريبية الأخيرة للتدريب (القسم 3.1) والكتلة التجريبية الأولى للاختبار (القسم 3.2) إما 2 (STM) أو 48 ساعة (LTM) لاحقا. بالنسبة للفئران المملوءة بالمركبات ، أظهرت المقارنات الاحتفاظ بالذاكرة الترابطية في كل من 2 و 48 ساعة بعد التدريب (ص > 0.05 لجميع المقارنات مع أداء التدريب). بالنسبة للفئران المملوءة ب K252a ، لم تختلف الكتلة التجريبية الأولى لاختبار ساعتين (STM) عن آخر كتلة تجريبية من التدريب (ص > 0.05). ومع ذلك ، كان أداء ذاكرتهم أقل بكثير بعد 48 ساعة (ص = 0.018). بالإضافة إلى ذلك ، انخفضت الذاكرة في اختبار 48 ساعة بشكل كبير مقارنة بالذاكرة في اختبار ساعتين (ص = 0.009) ، وأداء مجموعة المركبات في اختبار 48 ساعة (ص = 0.006). لم يكن هناك فرق في STM بين الفئران المملوءة بالمركبة و K252a (ص = 0.356). تظهر النتائج معا أن تثبيط K252a لمستقبلات Trk في البصلة الشمية يعطل بشكل انتقائي ذاكرة الرائحة طويلة المدى ، ولكن ليس قصيرة المدى (الشكل 3).

مجموعة الروائح	الرائحة 1	الرائحة 2
1	حمض البنتانويك	حمض البيوتانويك
	225.1	63.6
2	سداسي	سباعي
	11.1	35.3
3	أسيتات البروبيل	أسيتات البوتيل
	3.1	10.9
4	2-أوكتانون	2-هيبتانون
	87.4	28.7
5	البنتانول	هكسانول
	37.2	127.3

الجدول 1: أحجام الخلط لمجموعات الروائح. يظهر كل صف رائحتين يمكن استخدامهما كزوج للخطوات السلوكية. على سبيل المثال ، لاستخدام أول "مجموعة رائحة" ، اصنع مخاليط حمض البنتانويك وحمض البيوتانويك. تشير الأرقام الموجودة في الجدول إلى الحجم بالميكرولتر لخلطه في 50 مل من الزيت المعدني لتركيز 1.0 باسكال لكل رائحة. أثناء التدريب والاختبار ، سيتم تعطير طبق بتري بحمض البنتانويك ، والآخر بحمض البيوتانويك.

الشكل 1: وضع القنية والجهاز السلوكي. (أ) يوضح الموضع النسبي للقنية وغطاء الأسمنت للأسنان والبراغي على رأس الماوس. لاحظ أن إبر القنية تصل إلى المصباحين الشميتين ، ويتم تضمين قاعدة التمثال نفسها في غطاء الأسمنت للأسنان. يتم وضع البراغي في فتحتين محفورتين في الجمجمة فوق تكوين المخيخ. لا تلمس البراغي الدماغ نفسه ، لكنها تعمل كمرساة ذيلية لغطاء الأسمنت للأسنان. يوضح الشكل الحجم النسبي لعمل غطاء الأسمنت. (ب) يظهر الجهاز السلوكي المجمع. الجسم هو قفص منزل الفأر النموذجي. كانت الأغطية ذات الفتحات للهواء مصنوعة من زجاج شبكي. المقسم المركزي مصنوع أيضا من زجاج شبكي أسود. يجب أن تكون الأغطية مصنوعة من زجاج شبكي ثقيل بما يكفي بحيث يمكن أن تكون بمثابة أداة لرفع الحاجز المركزي ووضعه لأسفل أثناء التجارب. (ج) يظهر جانبا واحدا من الجهاز السلوكي. لاحظ أن الحاجز المركزي أطول قليلا من القفص لسهولة الرفع. يمكن وضع أطباق بتري من الرمل على طول الحافة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: تصميم الدراسة ونتائج التعلم. (أ) يبين الرسم التخطيطي لتصميم الدراسة. لاحظ أن مجموعات STM و LTM كانت مستقلة (أي مجموعات مختلفة من الفئران). تشير الرموز الموجودة في بداية الكتل إلى الوقت الذي تم فيه إعطاء الحقن. (ب) يوضح النسبة الصحيحة للتجارب 1-20 أثناء التدريب. تشير النتائج إلى أن K252a ومجموعات المركبات لم تختلف في معدل التعلم (ميل الخطوط). تمثل أشرطة الخطأ الخطأ المعياري للمتوسط (SEM). تظهر العلامات النجمية زيادات كبيرة في النسبة الصحيحة مقارنة ب TB1 لكل من أفواج المركبة و K252a (ص ≤ 0.001 لجميع المقارنات). هذا الرقم مقتبس من Tong et al. 2018 بإذن³. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: التأثيرات التفاضلية لحصار مستقبلات Trk على STM و LTM. يوضح النسبة الصحيحة للكتلة التجريبية 4 من التدريب والكتلة التجريبية 1 لكل من اختبار STM و LTM. أي أنه يتم استخدام نموذج مختلط خطي لمقارنة النسبة الصحيحة خلال الكتلة التجريبية الأخيرة من مرحلة التدريب (الشكل 2 ؛ Training-TB4) لأولئك الذين قاموا خلال الكتل التجريبية الأولى (Testing-TB1) لاختبار الذاكرة قصير المدى (اختبار ساعتين) وطويل المدى (اختبار 48 ساعة). كان للنموذج المختلط الخطي تأثيران ثابتان: مجموعة الأدوية والكتلة التجريبية (Training-TB4 ، STM-TB1 ، LTM-TB1). كانت التأثيرات العشوائية عبارة عن فأر ورائحة متداخلة داخل الماوس. وجدت المقارنات اللاحقة أن الفئران K252a قد أضعفت بشكل كبير LTM (مقارنة مع تدريب TB4; ع = 0.018) ولكن ليس STM (ص > 0.05). كان أداء LTM من قبل الفئران المملوءة ب K252a أقل بكثير من STM للفئران المملوءة ب K252a (p = 0.009) ، وأقل من LTM لفئران المركبات (p = 0.006). تمثل أشرطة الخطأ التسويق عبر محرك البحث. هذا الرقم مقتبس من Tong et al. 2018 بإذن³. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الملف التكميلي: بناء الجملة المستخدم في التحليل الإحصائي. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

Discussion

تكييف الخوف في تجربة واحدة هو بروتوكول سلوكي قوي لدراسة الديناميكيات الجزيئية والخلوية للذاكرة ، ولكن الكثير من التعلم الطبيعي تدريجي وأفضل نمذجة من خلال نموذج مثل النموذج الموصوف أعلاه. منع تثبيط مستقبلات Trk في OB توحيد الذاكرة الشمية في نموذج تعليمي متعدد التجارب وفاتح للشهية كما هو موضح سابقا في مجموعتنا³. يفتح هذا الاكتشاف طرقا جديدة للبحث في التوقيت التفاضلي للآليات الجزيئية ، مثل neurotrophins ، في التعلم الفاتح للشهية والبغيض

تتكون هذه التجربة من جزأين مهمين: (1) التقنية و (2) مهمة التمييز الترابطي (مقسمة إلى التشكيل والتدريب والاختبار). يمكن للمجربين تكييف هذا البروتوكول مع سؤالهم البحثي المحدد. على سبيل المثال ، كنا مهتمين في المقام الأول ب OB ويمكن تطبيق هذا البروتوكول المعمول به بسهولة على دراسات OB الأخرى. بالنسبة للمجربين الذين لديهم مناطق أخرى ذات اهتمام ، سيكون من المهم التحقق من صحة مواقع التسريب في دراسة تجريبية. قد يحتاج المجربون أيضا إلى النظر في معدل الانتشار والاختراق المكاني ومدة النشاط الحيوي لما يغرسونه

تم استخدام خطوات التشكيل الموضحة في البروتوكول على نطاق واسع من قبل مؤلفي هذا البروتوكول. يبدو أن الالتزام بها كما هو موضح مهم لجعل الفئران تتعلم المهمة في الوقت المناسب. باستخدام جداول زمنية أخرى ، لاحظ المؤلفون مزيدا من التباين بين الفئران في معرفتهم بالمهمة وهذا يعني تدريبا إضافيا لإيصال جميع الفئران إلى معيار للاختبار باستخدام الروائح التجريبية. للتدريب والاختبار ، يتمتع الباحث بالمرونة ، اعتمادا على اهتماماته البحثية ، مع عدد التجارب ، وتركيز الروائح التجريبية ، وتشابه الروائح مع بعضها البعض. نوصي باستخدام مجموعات روائح متعددة عندما يكون ذلك ممكنا ، كما وصفنا ، من أجل تقليل عدد المستخدمة في التجربة. راجع قسم التحليل الإحصائي للحصول على إرشادات حول كيفية حساب استخدام مجموعات أوامر متعددة في التحليل النهائي. من حيث المبدأ ، يمكن أن يتنوع تشابه زوج الرائحة لضبط صعوبة التمييز. في الدراسة المنشورة سابقا من مجموعتنا³ ، تتكون أزواج الروائح من روائحين من نفس المجموعة الوظيفية ولكنهما يختلفان عن بعضهما البعض بطول كربون واحد. هذه التمييز أكثر صعوبة من الأزواج التي تختلف بطولين أو أكثر من الكربون ، ولكنها أسهل من المتماثلات (على سبيل المثال ، (+) -ليمونين و (-) ليمونين). تختلف الروائح من المجموعات الوظيفية المختلفة اختلافا كبيرا من الناحية الإدراكية. يناقش Cleland et al¹³ المزيد من الاختلافات في التحفيز وتأثيرها على معايير تعلم محددة.

أحد القيود الرئيسية لهذا البروتوكول هو أنه يستغرق وقتا أطول بكثير للتنفيذ مقارنة بمهام التعلم الترابطي الآلي حيث يمكن اختبار متعددة بالتوازي. بالنسبة لاختبار معين ، سيستغرق باحث واحد 20 دقيقة على الأقل لإكمال 20 تجربة لماوس واحد. ومع ذلك ، فإن هذا النقص في الأتمتة هو الذي يعني أن البروتوكول يمكن الوصول إليه بشكل أكبر من الناحية المالية ، وهي أولوية للعديد من المؤسسات. الأهم من ذلك ، في حالة هذه التجربة ، وجد أن هذا البروتوكول قابل للتتبع للغاية وفعال لتدريب الباحثين الجامعيين المهتمين بعلم الأعصاب السلوكي. على وجه الخصوص ، يطور هؤلاء الطلاب مهارات قوية في التعامل مع بالإضافة إلى الفوائد المعتادة للمشاركة في البحث.

يمكن للباحثين المهتمين بتبني هذا النموذج أن يختلفوا عدة معايير. على ما يبدو ، التلاعب الدوائي بالآليات متنوع ، ويمكن استخدام هذا البروتوكول السلوكي مع تقنيات الوراثة الكيميائية أو طرق أخرى مختلفة للتلاعب بالمسارات الجزيئية والخلوية (مثل علم البصريات الوراثي). يمكن تعديل النموذج نفسه لتغيير نوع التعلم والذاكرة التي تم اختبارها. على سبيل المثال ، يمكن للباحثين ضبط تشابه الرائحتين المعروضة من أجل التحكم في معدل التعلم. في دراستنا³ ، تتكون أزواج الرائحة من روائحين من نفس المجموعة الوظيفية ولكنها تختلف عن بعضها البعض بطول كربون واحد. هذه التمييز أصعب من الأزواج التي تختلف بطولين أو أكثر من الكربون ، ولكنها أسهل من المتماثلات (على سبيل المثال (+) -ليمونين و (-) ليمونين). تختلف الروائح من المجموعات الوظيفية المختلفة اختلافا كبيرا من الناحية الإدراكية. يناقش Cleland et al¹³ المزيد من الاختلافات في التحفيز وتأثيرها على معايير تعلم محددة ، وخلصوا إلى أن الروائح الأكثر تشابها يصعب تمييزها وبالتالي تستغرق وقتا أطول للتعلم¹⁴. ستؤثر هذه التلاعبات أيضا على قوة الذكريات. على هذا المنوال ، قد يكون الباحثون مهتمين باختبار الذاكرة في نقاط زمنية مختلفة بعد التعلم. على سبيل المثال ، فحصت دراستان^15،16 دور BDNF في استمرار LTM لمهمة تعلم مكروهة لتجربة واحدة. BDNF هو رابط من TrkB. أظهرت الدراسات أن ضخ قليل النوكليوتيدات المضاد ل BDNF في الحصين بعد 12 ساعة من التعلم منع LTM بعد 7 أيام ، ولكن ليس بعد يومين. تظهر هذه الدراسة أن الجدول الزمني للآليات الجزيئية بعد التعلم الأولي يلعب أدوارا مثيرة للاهتمام ، ولم يتم فهمها بعد ، في LTM. تصف هذه الورقة بروتوكولا سلوكيا يسمح بالتحقيق في هذه الجداول الزمنية. تشمل المعلمات الأخرى ذات الأهمية للتطبيق المستقبلي نموذج الماوس المستخدم. على سبيل المثال ، سيكون من المثير للاهتمام استبدال ذكور الفئران (التي لديها علم الأعصاب المدروس بشكل أفضل بشكل ملحوظ) ¹⁷ بإناث الفئران في الدراسات المستقبلية لفحص الاختلافات في معدل التعلم ، STM ، و LTM ، حيث تتمتع ثدييات الإناث بحساسية وانتقائية أعلى للروائح من الثدييات الذكور¹⁸. بالطبع ، يمكن أيضا استخدام نماذج القوارض للأمراض بشكل فعال مع هذا البروتوكول.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Double guide cannula	PlasticsOne	C235GS-5-1.5/SPC	Custom order
(-)-limonene	Sigma-Aldrich	218367-50G
(+)-limonene	Sigma-Aldrich	183164-100ML
2-hetanone	Sigma-Aldrich	537683
2-octanone	Sigma-Aldrich	O4709
5mg sucrose pellets	Test Diet	1811560	Custom size. Used for rewards
Butanoic acid	Sigma-Aldrich	B103500
butyl acetate	Sigma-Aldrich	402842
Dental Cement Powder (Coral)	A-M Systems	525000
Dental Cement Solvent	A-M Systems	526000
Double connector assembly	PlasticsOne	C232C
Double dummy cannula	PlasticsOne	C235DCS-5/SPC dummy dbl	Custom order
Double injector	PlasticsOne	C235IS-5/SPC	Custom order
Drill	Kopf Instruments	Model 1474 High Speed Stereotaxic Drill	This drill requires an additional "adaptor" piece in order to fit certain drill bits. We get by this problem by wrapping the drill bit with lab tape to increase the circumference of the drill it to fit. This may not be an option for surgeries requiring sterile technique.
Eye Ointment			Purchase from local pharmacy
Figure 1 illustration software	BioRender
heptanal	Sigma-Aldrich	W254002
hexanal	Sigma-Aldrich	115606
hexanol	Sigma-Aldrich	H13303
Infusion pump model 11	Harvard Apparatus	4169D	Used pumps available via American Instrument Exchange
Isoflurane	Santa Cruz Animal Health	sc-363629Rx	Vet prescription needed for order
K252a	Sigma-Aldrich	K2015	Mixed to 50uM in DMSO (5%)
Ketoprofen	Allivet	25920	Vet prescription needed for order
Lidocaine	Aspercreme		Purchased from Amazon
Mounting Screws	PlasticsOne	00-96 X 3/32
Mouse Anesthesia Mask	Kopf Instruments	Model 907 Mouse Anesthesia Mask	Used with the stereotaxic to allow oxygen and anesthesia while mouse in stereotax
Mouse Nose Adaptor	Kopf Instruments	Model 926 Mouse Adaptor	Used with the stereotaxic to allow for head of mouse to be secured.
Novalsan	Jeffers	41375
Pentanoic acid	Sigma-Aldrich	240370
pentanol	Sigma-Aldrich	138975
Petri dish glass bottoms	VWR	10754-804
Polycarbonate Café bottoms	Ancare	N10PCSEC	Use normal housing cages and custom fit a track in the middle to act as the track for an opaque plexiglass divider
propyl acetate	Sigma-Aldrich	537438
Quikrete Premium Play Sand			Purchase from local hardware store
Saline	Insight Needles	N/A	Sterile saline for drug mixing
Stereotaxic apparatus	Kopf Instruments	Model 902 Small Animal Stereotaxic Instrument
Testing chamber	Ancare	N10PCSEC	Our testing chambers are modified using the regular mouse housing cage. The manuscript details what was done.
Vetbond Tissue Adhesive	3M		Purchased from Amazon