JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يقدم هنا بروتوكول للجيل التلقائي من المجالات العصبية المخصب في الخلايا السلف العصبية من الخلايا العصبية مطلي عالية الكثافة. خلال نفس التجربة، عندما يتم طلاء الخلايا العصبية في كثافة أقل، والبروتوكول يؤدي أيضا في الثقافات العصبية الفئران الأولية لفترات طويلة.

Abstract

ثقافة الخلايا العصبية الأولية هي تقنية أساسية في مجال علم الأعصاب. للحصول على رؤى ميكانيكية أعمق في الدماغ، فمن الضروري أن يكون لديك نموذج قوي في المختبر التي يمكن استغلالها لمختلف دراسات علم الأحياء العصبية. على الرغم من أن الثقافات العصبية الأولية (أي، الثقافات فرس النهر على المدى الطويل) قدمت العلماء مع النماذج، فإنه لا يمثل حتى الآن تعقيد شبكة الدماغ تماما. في أعقاب هذه القيود، ظهر نموذج جديد باستخدام المجالات العصبية، والتي تحمل تشابها أوثق إلى أنسجة الدماغ. يصف هذا البروتوكول طلاء الكثافات العالية والمنخفضة من الخلايا العصبية القشرية وفرس النهر المختلطة المعزولة من جنين اليوم الجنيني 14-16 الفئران سبراغ داولي. وهذا يسمح لتوليد المجالات العصبية وثقافة الخلايا العصبية الأولية على المدى الطويل كمنصتين مستقلتين لإجراء مزيد من الدراسات. هذه العملية بسيطة للغاية وفعالة من حيث التكلفة, كما أنه يقلل من عدة خطوات والكواشف تعتبر سابقا ضرورية لثقافة الخلايا العصبية. هذا هو بروتوكول قوي مع الحد الأدنى من المتطلبات التي يمكن تنفيذها مع نتائج قابلة للتحقيق ومزيد من الاستخدام لتنوع الدراسات المتعلقة بعلم الأعصاب.

Introduction

الدماغ هو دوائر معقدة من الخلايا العصبية وغير العصبية. لسنوات، يحاول العلماء الحصول على نظرة ثاقبة في هذه الآلية المعقدة. وللقيام بذلك، لجأ علماء الأعصاب في البداية إلى مختلف خطوط الخلايا القائمة على الأعصاب المحولة لإجراء التحقيقات. ومع ذلك، فإن عدم قدرة هذه الخطوط الخلية clonal لتشكيل اتصالات متشابكة قوية والمحاور المناسبة أو dendrites قد تحولت الاهتمام العلمي إلى الثقافات العصبية الأولية1،2. الجانب الأكثر إثارة من ثقافة الخلايا العصبية الأولية هو أنه يخلق فرصة لمراقبة والتلاعب الخلايا العصبية الحية3. وعلاوة على ذلك، فإنه أقل تعقيدا بالمقارنة مع الأنسجة العصبية، مما يجعلها مرشحا مثاليا لدراسة وظيفة ونقل البروتينات العصبية المختلفة. في الآونة الأخيرة، ولدت العديد من التطورات في مجالات الفحص المجهري، وعلم الجينوم، والبروتيوميات فرصا جديدة لعلماء الأعصاب لاستغلال الثقافات العصبية4.

وقد سمحت الثقافات الأولية لعلماء الأعصاب باستكشاف الآليات الجزيئية وراء التطور العصبي، وتحليل مختلف مسارات الإشارات العصبية، وتطوير فهم أكثر تماسكا لنقاط الاشتباك العصبي. على الرغم من أن عددا من الأساليب قد ذكرت الثقافات من الخلايا العصبية الأولية (معظمها من أصل فرس النهر5و6و7)،بروتوكول موحد مع وسيلة محددة كيميائيا التي تمكن ثقافة طويلة الأجل من الخلايا العصبية هو لا تزال هناك حاجة. ومع ذلك، لوحظت الخلايا العصبية مطلية في كثافة منخفضة في معظم الأحيان، والتي لا البقاء على قيد الحياة على المدى الطويل، على الأرجح بسبب عدم وجود الدعم الغذائي8 التي يتم توفيرها من قبل الخلايا العصبية المجاورة والخلايا الغليفية. وقد اقترحت بعض الأساليب حتى المشاركة في زراعة الخلايا العصبية الأولية مع الخلايا الدبقية، حيث يتم استخدام الخلايا الدبقية كطبقة مغذية9. ومع ذلك، فإن الخلايا الغليفية تشكل الكثير من المشاكل بسبب فرط نموها، والتي تتجاوز في بعض الأحيان نمو الخلايا العصبية10. وبالتالي، وبالنظر إلى المشاكل المذكورة أعلاه، مطلوب بروتوكول أبسط وأكثر فعالية من حيث التكلفة للثقافة العصبية الأولية، والتي يمكن استخدامها من قبل كل من علماء الأحياء العصبية والكيميائيين العصبيين للتحقيقات.

ثقافة الخلايا العصبية الأولية هي أساسا شكل من أشكال الثقافة 2D ولا تمثل اللدونة، والسلامة المكانية، أو عدم تجانس الدماغ. وقد أدى هذا إلى الحاجة إلى نموذج 3D أكثر تصديقا يسمى neurospheres11,12. المجالات العصبية تقدم منصة جديدة لعلماء الأعصاب، مع تشابه أقرب إلى الحقيقي، في الدماغ في الجسم الحي13. المجالات العصبية هي مجموعات ثلاثية الجوانب غير ملتصقة من الخلايا الغنية بالخلايا الجذعية العصبية (NSCs)، والخلايا السلف العصبية (NPCs)، والخلايا العصبية، والخلايا النجمية. فهي مصدر ممتاز لعزل الخلايا الجذعية العصبية والخلايا السلف العصبية، والتي يمكن استخدامها لدراسة التمايز في مختلف السلالات العصبية وغير العصبية. ومرة أخرى، يشكل التغير داخل ثقافات الغلاف العصبي المنتجة باستخدام البروتوكولات المبلغ عنها سابقا عائقا أمام صياغة بروتوكول موحد لثقافة الغلاف العصبي14.

تقدم هذه المخطوطة بروتوكولًا يمكن فيه توليد منصات ثلاثية المدة وثلاثية المدة بالتناوب مع كثافات طلاء الخلايا من ثقافة القشرية وفرس النهر المختلطة. ويلاحظ أنه في غضون 7 أيام يتم الحصول على المجالات العصبية العائمة الحرة من الخلايا العصبية مطلي عالية الكثافة معزولة عن E14-E16 Sprague Dawley الفئران الجنين، والتي على مزيد من الثقافة، وتشكيل الجسور والترابط من خلال ملحقات شعاعي مثل glial. وبالمثل، في الخلايا العصبية مطلي منخفضة الكثافة، يتم الحصول على ثقافة الخلايا العصبية الأولية التي يمكن الحفاظ عليها لمدة تصل إلى 30 يوما عن طريق تغيير وسط الصيانة مرتين في الأسبوع.

Protocol

وقد وافقت اللجنة المؤسسية لأخلاقيات الحيوان التابعة للمعهد الهندي للبيولوجيا الكيميائية على جميع الإجراءات التجريبية المتعلقة بالحيوان (IICB/AEC/Meeting/Apr/2018/1).

1- الكاشف وإعداد وسائل الإعلام

  1. بولي-د-يسين (PDL) الحل: إعداد حلول PDL بتركيزات 0.1 ملغ / مل في الماء منزوع الأيونات وتخزينها في 4 درجة مئوية حتى الاستخدام.
  2. وسط التفكك: إلى 1 لتر من المياه المعقمة والمصفاة، تجمع بين المكونات التالية في التركيزات ذات الصلة: كلوريد الصوديوم (8 ملغ/مل)، كلوريد البوتاسيوم (0.4 ملغم/مل)، فوسفات البوتاسيوم أحادي القاعدة (0.06 ملغم/مل)، D-الجلوكوز (1 ملغ/مل)، ثنائي القاعدة فوسفات الصوديوم (0.479 ملغم/مل)، و1 م هيبس [4-(2-هيدروكسي إيثيل)-1-بيبرازينإيثانيسفولفونيك حمض؛ 10 مل]. دوامة جميع المكونات للمساعدة في خلط السليم وتخزينها في 4 درجة مئوية حتى استخدامها.
    ملاحظة: استخدم وسيط التفكك في شكل بارد على الجليد أثناء التفكك ولكن في درجة حرارة الغرفة (RT) لأغراض الغسيل وغيرها.
  3. وسط الطلاء: يتكون متوسط الطلاء من ما يلي: الحد الأدنى من المتوسط الأساسي (MEM) النسر مع حل الملح المتوازن إيرل (BSS؛ 88.4٪)، D-الجلوكوز (0.6٪)، مصل الحصان (10٪)، والبنسلين / العقدية (1٪). الجمع بين المكونات في النسب المعنية وتنفيذ الإجراء داخل غطاء محرك السيارة في ظل ظروف معقمة.
    ملاحظة: دائماً استخدام وسيط الطلاء المعدة حديثاً لتجنب تدهور أي مكون.
  4. صيانة المتوسطة: إعداد وسيلة الصيانة عن طريق الجمع بين ما يلي في النسب المعنية: المتوسطة العصبية (97٪)، 0.5 مليون متر تم الحصول عليها تجاريا عينة الجلوتامين، B27 الملحق خالية من المصل (2٪)، والبنسلين / العقديات (1٪). الجمع بين المكونات في النسب المعنية وتنفيذ الإجراء داخل غطاء محرك السيارة في ظل ظروف معقمة. تأكد من أن جميع المكونات يتم إعدادها حديثًا.

2- إعداد الأغطية

  1. خذ غطاء زجاجي مستدير قطره 12 مم وانقعه في 1 M حمض الهيدروكلوريك (حمض الهيدروكلوريك) لمدة 4 ساعة.
  2. نقل الأغطية في الماء المقطر باستخدام زوج من الملقط ودوامة بلطف للتخلص من حمض تماما.
  3. نقل الأغطية المغسولة لجولة إضافية من التنظيف في كوب يحتوي على الإيثانول 100٪.
  4. قبل استخدام الأغطية، تجف جيدا في غطاء محرك السيارة laminar عن طريق الاحتفاظ بها على ورقالأنسجة.

3. إعداد لوحات بولي د-يسين المغلفة لثقافة الخلايا العصبية

  1. خذ اثنين من 24 لوحات جيدا: واحد لطلاء عالية الكثافة وآخر لطلاء منخفض الكثافة. افتح الحزم المعقمة فقط داخل غطاء محرك السيارة لامينار.
  2. نقل 12 ملم من الأغطية الزجاجية المعقمة في لوحات الآبار 24.
  3. صب 300 ميكرولتر من محلول PDL (0.1 ملغ / مل في الماء منزوع الأيونات) في كل بئر بحيث يغطي تماما سطح الأغطية.
  4. التفاف لوحات مع رقائق الألومنيوم لمنع التجفيف والاحتفاظ بها في حاضنة CO2 بين عشية وضحاها.
  5. في اليوم التالي (قبل الطلاء)، يستنشق محلول PDL ويغسل بشكل صحيح مع 300 درجة مئوية من الماء المعقمة منزوع ة مرتين إلى ثلاث مرات.
  6. إضافة 200 درجة مئوية من الطلاء الطازجة المتوسطة والعودة لوحات إلى الحاضنة حتى الطلاء.

4. إزالة وقطع رأس الجنين

ملاحظة: تعقيم جميع الأدوات الجراحية معبأة في رقائق الألومنيوم في الأوتوكلاف في 121 درجة مئوية (15 رطل لكل بوصة مربعة) لمدة 30 دقيقة. وهذا يشمل زوج من مقص نهاية حادة، ملقط، ملقط غرامة، مقص ينفء، وملقط شريان واحد للإجراء بأكمله.

  1. لتوليد الخلايا العصبية وneurospheres، واستخدام الفئران Sprague Dawley في الوقت المناسب الحوامل وبمناسبة اليوم مع الكشف عن المكونات المهبلية كما E0.
    ملاحظة: يجب تنفيذ الثقافة بين E14-E16.
  2. في يوم الثقافة، ضع طبق بيتري الزجاجي المعقم على الثلج وملئه بمحلول الملح المتوازن البارد لهانك (HBSS).
  3. التخدير الفئران الحامل E14-E16 مع حقن داخل اقابية (i.p.) من 90 ملغ الكيتامين / كغ من وزن الجسم و 10 ملغ xylazine / كجم، ثم التضحية عن طريق إجراء خلع عنق الرحم.
    ملاحظة: يمكن أيضا أن يتم قتل الفئران عن طريق جرعة زائدة من البنتوباربيتال أو جرعة زائدة من الكيتامين مع xylazine أو الديازيبام.
  4. تعقيم بطن السد عن طريق رش 70٪ الإيثانول وجعل قطع على شكل V في منطقة البطن باستخدام ملقط معقمة وزوج من مقص نهاية حادة.
  5. تناول الأكياس الجنينية بعناية على طبق بيتري مع محلول HBSS البارد.
    ملاحظة: لا تستخدم نفس الملقط والمقص التي كانت تستخدم فقط للبشرة، لأن هذا سوف يلوث الأعضاء الداخلية. استخدام مجموعة مختلفة من مقص / ملقط للأعضاء الداخلية.
  6. أخرج الأجنة من الأكياس الجنينية في HBSS الطازجة والباردة.
  7. قطع الرأس بمقص معقم.

5. إزالة الدماغ وتشريح القشرة مع الحصين

  1. قبل البدء، املأ أطباق بيتري المعقمة عيار 90 مم بطبق HBSS البارد والعقيم.
  2. نقل رؤساء في الأطباق المعقمة باستخدام معقمة، ملقط خلع الملابس غير حادة.
  3. تحت المجهر المجسم، عقد الرأس من منطقة الوضعم مع الملقط المعقمة، مسننة وإزالة الدماغ عن طريق قطع الجلد والجمجمة مفتوحة.
  4. جمع جميع العقول الجنينية بنفس الطريقة في حل HBSS.
  5. إزالة جميع السحاين من نصفي الكرة الأرضية ومنتصف الدماغ عن طريق عقد جذع الدماغ.
  6. إزالة بعناية نصف الكرة الأرضية سليمة تشبه قبعات الفطر التي تحتوي على الحصين والقشرة.
  7. جمع نصف الكرة الأرضية التي تحتوي على القشرة والحصين سليمة في أنبوب مخروطي 15 مل تحتوي على 10 مل من وسط التفكك.

6. تفكك الأنسجة القشرية وفرس النهر في الخلايا العصبية واحدة

  1. السماح للأنسجة التي تم جمعها لتسوية واستنشاق وسط التفكك، وترك 5٪ -10٪ من المتوسطة في ذلك.
  2. إضافة 10 مل من انقطاع جديد المتوسطة إلى الأنسجة، وكرر الخطوة 6.1 مرتين.
  3. إضافة 4.5 مل من تفكك المتوسطة و 0.5 مل من 0.25٪ (1X) تريبسين EDTA (الإيثيلين ديامين تيتراخلات) الحل.
  4. الحفاظ على الأنسجة في الحاضنة في 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة للهضم للمضي قدما.
  5. يستنشق المتوسط وإضافة 10 مل من التفكك والطلاء المتوسطة على التوالي إلى الأنسجة المهضومة.
  6. السماح للأنسجة المهضومة لتستقر وتستنشق وسط التفكك. إضافة 2.5 مل من الطلاء المتوسطة وتصب في قاعدة طبق معقم 90 ملم.
  7. تُدرّس الأنسجة المهضومة في القاعدة الزاوية للطبق باستخدام طرف ماصة بقوة 1000 ميكرولتر لتشغل الحد الأدنى من الحجم.
  8. تمرير تعليق الخلية التي تم الحصول عليها من خلال مصفاة الخلية 70 م، باستثناء أي قطع من الأنسجة.
  9. تحديد كثافة الخلايا القابلة للحياة باستخدام طريقة استبعاد صبغة الأزرق trypan وحساب عدد الخلايا في عداد الخلية الآلي.
    1. لطريقة استبعاد الصبغة الزرقاء trypan، خذ 10 ميكرولتر من تعليق الخلية و 10 ميكرولتر من 0.4٪ بقعة زرقاء trypan، ومزيج تماما، وإضافة 10 ميكرولتر من الخليط في واحدة من اثنين من الغرف المغلقة من الشرائح غرفة المتاح.
    2. أدخل الشريحة التي تحتوي على الخليط في عداد الخلية واحصل على القراءة.
      ملاحظة: ويستند طريقة استبعاد صبغ ة زرقاء trypan على مبدأ أن الخلايا الحية (بسبب أغشيةها سليمة) سوف تستبعد صبغة زرقاء تريبان وبالتالي سوف تظهر السيتوبلازم واضحة، مقارنة مع خلية غير قابلة للحياة التي سوف يستغرق بسهولة الأزرق تريبان وتظهر الأزرق في اللون15.
  10. تخفيف عدد الخلايا التي تم الحصول عليها إلى لوحة 1.5 × 105 خلايا / مل لكثافة عالية و 20،000 خلية / مل لكثافة منخفضة في اثنين من أنابيب منفصلة تحتوي على 30 مل كل من وسط الطلاء.
  11. يستنشق وسيط الطلاء المضافة سابقا من كل بئر ولوحة 500 درجة مئوية من الخلايا المنتشرة في وسط الطلاء في كل بئر.
  12. بعد ذلك العودة لوحات إلى الحاضنة في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة 4 ساعة.
  13. فحص الخلايا للانضمام تحت المجهر 4 ح بعد الطلاء.
  14. إذا كان هناك التزام السليم من الخلايا في كل من لوحات، واستبدال المتوسطة في كل بئر مع 500 درجة مئوية من المتوسطة صيانة جديدة وحضانة في 37 درجة مئوية.
  15. ثقافة هذه الخلايا العصبية نمت في كثافة منخفضة لمدة 30 يوما عن طريق تغيير المتوسطة صيانة 2X في الأسبوع.
  16. ثقافة المجالات العصبية التي تم الحصول عليها من الخلايا العصبية مطلي عالية الكثافة في نفس وسيلة الصيانة عن طريق نقلها إلى لوحات المرفقات منخفضة جدا.
  17. تميز الخلايا العصبية والمجالات العصبية عن طريق تلطيخ المناعة لهم مع علامات هامة. للكيمياء المناعية، أولا إصلاح الخلايا / neurospheres باستخدام 4٪ الفورمالديهايد لمدة 30 دقيقة على اللوحة نفسها، ثم permeabilize الخلايا مع المنظفات غير الأيونية 0.1٪ لمدة 10 دقيقة.
  18. إضافة الأجسام المضادة الأولية لكلا الخلايا العصبية (المضادة لTuj1، GFAP، O4، تاو) وneurospheres (المضادة للنستين، GFAP، Tuj1) في الفوسفات المخزنة المالحة (PBS) في 1:300 تركيزات وحضانة بين عشية وضحاها في 4 °C16.
    ملاحظة: Tuj1 (الفئة الثالثة β-tubulin) وتاو هي علامات إيجابية للخلايا العصبية الأولية، في حين GFAP (البروتين الحمضي الليفي الغليفي) وO4 (علامة oligodendrocyte) هي علامات سلبية للخلايا العصبية الأولية17،18. في حالة المجالات العصبية، Tuj1، GFAP، وNestin كلها بمثابة علامات إيجابية19،20.
  19. في اليوم التالي، غسل الخلايا مع PBS مرة أو مرتين وإضافة الأجسام المضادة الثانوية المناسبة في PBS في تركيزات 1:600 في RT لمدة 2 ساعة.
    ملاحظة: يتم تحديد الأجسام المضادة للماوس أو المضادة للأرنب الثانوية اعتماداً على الأنواع المضيفة للجسم المضاد الأساسي المضافة. وينبغي أن يوضع في الاعتبار أن الأجسام المضادة الثانوية يجب أن تكون مترافقة مع مشتقات الفلورة مناسبة لأغراض التنظير المجهري الفلوري.
  20. اغسل الخلايا مرة أخرى مع PBS مرة أو مرتين.
    1. إجراء تلطيخ نووي للخلايا مع Hoechst 33258 (1 ملغ / مل حل الأسهم في الماء منزوع الأيونات). إعداد 0.1٪ حل Hoechst في PBS من حل الأسهم وإضافته إلى الخلايا.
    2. احتضان الخلايا مع 0.1٪ حل Hoechst لمدة 30 دقيقة، ثم يغسل مرة أخرى مع PBS.
  21. إضافة 20 μL PBS (أو تصاعد المتوسطة) على الشريحة وجبل ببطء غطاء تحتوي على الخلايا الملونة على مساحة الشريحة التي تحتوي على PBS. ختم هوامش غطاء مع ثنائي بوتيل فالثالات البوليسترين إكسيلين (DPX).
  22. إجراء تصوير للخلايا الثابتة تحت المجهر في التكبير 10X و 40x.

النتائج

في هذا البروتوكول، تم توضيح استراتيجية بسيطة يتم فيها الحصول على كثافات طلاء الخلايا المتغيرة من اثنين من منصات الفحص العصبي المختلفة. الشكل 1A،B يوضح التزام الخلايا بعد 4 ساعة من طلاء الخلايا العصبية في الخلايا المطلي عالية ومنخفضة الكثافة ، على...

Discussion

يصف هذا البروتوكول كيف يتم الحصول على اثنين من المنصات العصبية المتغيرة عن طريق تغيير كثافات طلاء الخلايا من الخلايا العصبية الأولية. على الرغم من أن هذا هو أسلوب بسيط، يجب تنفيذ كل خطوة بدقة لتحقيق النتائج المرجوة. وقد أبلغت طرق سابقة أخرى إما على المدى الطويل الثقافات العصبية الأولية أو...

Disclosures

ولا يعلن صاحبا البلاغ عن أي مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgements

نشكر مرفق الحيوانات CSIR-IICB. G. D. شكرا ICMR، J. K. و V. G. أشكر DST إلهام، وD. M. شكرا DBT، الهند على زمالاتهم. س. غ. تتكرم بـ "الصرب" (EMR/2015/002230) الهند لتقديمها الدعم المالي.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Anti-GFAPAbcamAB7260
Anti- NestinAbcamAB92391
Anti-O4MilliporeMAB345
Anti-TauAbcamAB76128
Anti-Tuj1MilliporeMAB1637
B27 Serum Free Supplement Gibco17504-044
Cell CounterLife technologiesCountess II FL
CO2 IncubatorEppendorfGalaxy 170 R
D-glucose SDFCL38450-K05
EthanolMerck Millipore100983
Fluorescence MicroscopeOlympusIX83 Model
FormaldehydeSigma Aldrich47608
GlutaMax-I SupplementGibco35050-061
GtXMs IgG FluorMilliporeAP1814
GtXMs IgG (H+L)MilliporeAP124C
HEPESSRL16826
Hoechst 33258Calbiochem382061
Horse Serum HiMediaRM10674
Hydrochloric AcidRankemH0100
Laminar HoodBioBaseBBS-V1800
MEM Eagle’s with Earle’s BSS Sigma AldrichM-2279
MicroscopeDewinterVictory Model
Neurobasal Medium Gibco21103-049
Plasticware (24 well plate, cell strainers, and low adherence plates)BD Falcon353047, 352350 and 3471
90 mm PetridishesHimediaPW001
Penicillin/Streptomycin Gibco15140-122
Poly-D-LysineMilliporeA.003.E
Potassium Chloride Fisher ScientificBP366-500
Potassium Phosphate Monobasic MerckMI6M562401
Sodium Chloride Qualigem15918
Sodium Phosphate Dibasic MerckMI6M562328
StereomicrosopeDewinterZoomstar Model
Triton-X 100SRL2020130
Trypan Blue SolutionGibco15250-061
0.25 % Trypsin-EDTAGibco25200-072

References

  1. Lorsch, J. R., Collins, F. S., Lippincott-Schwartz, J. Fixing problems with cell lines. Science. 346 (6216), 1452-1453 (2014).
  2. Masters, J. R. W. Cell line misidentification: the beginning of the end. Nature Reviews Cancer. 10 (6), 441-448 (2010).
  3. Banker, G. . Culturing Nerve Cells, 2nd edition. , 339-370 (1998).
  4. Geschwind, D. H., Konopka, G. Neuroscience in the era of functional genomics and systems biology. Nature. 461 (7266), 908-915 (2009).
  5. Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nature Protocol. 1, 2406-2415 (2006).
  6. Lu, Z. M., Piechowicz, M., Qiu, S. F. A Simplified Method for Ultra-Low Density, Long-Term Primary Hippocampal Neuron Culture. Journal of Visual Experiments. 109, e53797 (2016).
  7. Kaneko, A., Sankai, Y. Long-Term Culture of Rat Hippocampal Neurons at Low Density in Serum-Free Medium: Combination of the Sandwich Culture Technique with the Three-Dimensional Nanofibrous Hydrogel PuraMatrix. PLoS ONE. 9 (7), e102703 (2014).
  8. Banker, G. A. Trophic interactions between astroglial cells and hippocampal neurons in culture. Science. 209 (4458), 809-810 (1980).
  9. Dotti, C. G., Sullivan, C. A., Banker, G. A. The establishment of polarity by hippocampal neurons in culture. Journal of Neuroscience. 8 (4), 1454-1468 (1988).
  10. Piret, G., Perez, M. T., Prinz, C. N. Support of Neuronal Growth Over Glial Growth and Guidance of Optic Nerve Axons by Vertical Nanowire Arrays. ACS Applied Materials & Interfaces. 7 (34), 18944-18948 (2015).
  11. Campos, L. S. Neurospheres: Insights biology into neural stem cell biology. Journal of Neuroscience Research. 78 (6), 761-769 (2004).
  12. Ahmed, S. The Culture of Neural Stem Cells. Journal of Cellular Biochemistry. 106, 1-6 (2009).
  13. Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
  14. Jensen, J. B., Parmar, M. Strengths and limitations of the neurosphere culture system. Molecular Neurobiology. 34 (3), 153-161 (2006).
  15. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. 111, A3.B.1-A3.B.3 (2015).
  16. Pradhan, K., et al. Neuro-Regenerative Choline-Functionalized Injectable Graphene Oxide Hydrogel Repairs Focal Brain Injury. ACS Chemical Neuroscience. 10 (3), 1535-1543 (2019).
  17. Ray, B., Bailey, J. A., Sarkar, S., Lahiri, D. K. Molecular and immunocytochemical characterization of primary neuronal cultures from adult rat brain: Differential expression of neuronal and glial protein markers. Journal of Neuroscience Methods. 184 (2), 294-302 (2009).
  18. Robinson, A. P., Rodgers, J. M., Goings, G. E., Miller, S. D. Characterization of Oligodendroglial Populations in Mouse Demyelinating Disease Using Flow Cytometry: Clues for MS Pathogenesis. PLoS ONE. 9 (9), (2014).
  19. Osterberg, N., Roussa, E. Characterization of primary neurospheres generated from mouse ventral rostral hindbrain. Cell and Tissue Research. 336 (1), 11-20 (2009).
  20. Bernal, A., Arranz, L. Nestin-expressing progenitor cells: function, identity and therapeutic implications. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (12), 2177-2195 (2018).
  21. Qu, Q. H., et al. High-efficiency motor neuron differentiation from human pluripotent stem cells and the function of Islet-1. Nature Communications. 5, 3449 (2014).
  22. Bradke, F., Dotti, C. G. Differentiated neurons retain the capacity to generate axons from dendrites. Current Biology. 10 (22), 1467-1470 (2000).
  23. Theocharatos, S., et al. Regulation of Progenitor Cell Proliferation and Neuronal Differentiation in Enteric Nervous System Neurospheres. PLoS ONE. 8 (1), (2013).
  24. Binder, E., et al. Enteric Neurospheres Are Not Specific to Neural Crest Cultures: Implications for Neural Stem Cell Therapies. PLoS ONE. 10 (3), e0119467 (2015).
  25. Cordey, M., Limacher, M., Kobel, S., Taylor, V., Lutolf, M. P. Enhancing the Reliability and Throughput of Neurosphere Culture on Hydrogel Microwell Arrays. Stem Cells. 26 (10), 2586-2594 (2008).
  26. Ladiwala, U., Basu, H., Mathur, D. Assembling Neurospheres: Dynamics of Neural Progenitor/Stem Cell Aggregation Probed Using an Optical Trap. PLoS ONE. 7 (6), (2012).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

150NPCs

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved